專利名稱：一種可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽及其合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽化合物，具體是一種可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽及其合成工藝。

背景技術(shù)：
Hymenistatin-1(HS-1)是由Pettit等研究者從太平洋hymeniacidon海綿中分離得到的一種環(huán)八肽(Pettit G.R.，Clewlow P.W.，Dufresne C.，et al.Isolation and structure of the cyclic peptide hymenistatin I.Can.J.Chem.1990，68708-711.)。肽鏈序列為cyclo(Pro-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu-Ile-Ile)。為了論述方便和準(zhǔn)確，給氨基酸殘基以編號(hào)，即HS-1表達(dá)為(Ile1-Ile2-Pro3-Pro4-Tyr5-Val6-Pro7-Leu8)。
有報(bào)道稱HS-1在小鼠成淋巴細(xì)胞非白血性白血病的P388的研究中，具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但結(jié)果并沒有在后續(xù)的研究中得到充分證實(shí)。
Siemion等研究者揭示了HS-1具有某些抑制體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫抑制作用。文獻(xiàn)(Poojary B，Belagali SL.Synthetic studies on cyclicoctapeptidesYunnanin F and Hymenistatin.Eur.J.Med.Chem.2005，40(4)407-412.)中合成的HS-1顯示處對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，但對(duì)真菌的抑制作用不強(qiáng)，HS-1的驅(qū)蟲作用不大，但表現(xiàn)出一定的抗炎癥作用。文獻(xiàn)(PawelZubrzak，Karol Kociolek，Marek Smoluch，et al.Search for new syntheticimmunosuppressants II.Tetrazole analogues of hymenistatinn 1.ActaBiochimica Polonica，2001，481151-1154.)中，作者用1，5-二取代四唑環(huán)修飾HS-1之后，對(duì)HS-1的免疫抑制活性影響不是很大。
HS-1的一個(gè)基本特征是在分別溶于CHCl3和Me2SO后，化合物的Pro3-Pro4殘基之間是一個(gè)順式酰胺鍵，在Ile2-Tyr5區(qū)域有一個(gè)βVIa轉(zhuǎn)角，以及在Val6-Ile1區(qū)域有一個(gè)βI或βII轉(zhuǎn)角。
天然結(jié)構(gòu)的HS-1中的氨基酸殘基都是疏水性氨基酸，加之序列富有Pro具有二級(jí)胺的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這使得化學(xué)合成極為困難，也非常不利于純化。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，設(shè)計(jì)最佳的合成與純化路線，獲得產(chǎn)率高、純度高的可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽化合物，且該環(huán)肽化合物的免疫抑制活性更高。
為了評(píng)價(jià)肽鍵Ile2-Pro3，Pro3-Pro4，Val6-Pro7對(duì)于HS-1的生物活性有何影響，申請(qǐng)人用Ile2-Statine3代替Ile2-Pro3，合成出一個(gè)新的環(huán)化的HS-1的類似物。申請(qǐng)人還希望通過這種修飾策略進(jìn)而降低該類似物疏水性，提高其在水溶液中的溶解性，以利于隨后的活性檢測(cè)和未來臨床上的應(yīng)用。
Statine(3S，4S)是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA，膽固醇合成限速酶)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用和細(xì)胞效應(yīng)，且不依賴于血液膽固醇的降低。近來有研究表明，Statine不但可以抑制IFN-γ刺激誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的MHC-II抗原的表達(dá)，而且可以選擇性阻斷整合素β2、白細(xì)胞功能抗原-1(LFA-1，即CD11a/CD18)的表達(dá)。這些功能與Statine對(duì)HMG-CoA的抑制作用無關(guān)。提示Statine也是一種潛在的免疫抑制劑。由于天然的Hymenistatin-1顯示出較弱的生物學(xué)活性，這就妨礙了其作為免疫抑制劑的應(yīng)用。因此，本發(fā)明就是采用Statine來對(duì)HS-1進(jìn)行修飾，以期能夠有效提高HS-1的免疫抑制活性。
本發(fā)明中所提到的氨基酸可以是D-型氨基酸也可以是L-型氨基酸，作為優(yōu)選，本發(fā)明所用的氨基酸為L(zhǎng)-型氨基酸。
本發(fā)明可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽，環(huán)(Ile-Ile-Sta-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu)(簡(jiǎn)稱A1HS1)，其結(jié)構(gòu)式為
上述環(huán)肽的理化特性是，白色粉末，難溶于水，易溶于乙醇，DMSO等有機(jī)溶劑。
一般認(rèn)為，直鏈肽在體外往往具有很好的生物活性與穩(wěn)定性，但進(jìn)入體內(nèi)后活性往往會(huì)很快消失，這是直鏈肽作為多肽藥物的不利方面。于是，人們?cè)噲D將直鏈肽改造為環(huán)肽，利用環(huán)肽的具有固定構(gòu)象的特點(diǎn)，使其能更好地與受體結(jié)合，提高生物活性、延長(zhǎng)半衰期、增加受體選擇性；而且由于環(huán)肽的分子內(nèi)不存在游離的氨基端和羧基端，使得環(huán)肽對(duì)氨肽酶和羧肽酶的敏感性大為降低。一般來講，環(huán)肽的代謝穩(wěn)定性和生物利用度要遠(yuǎn)高于直鏈肽。
但是環(huán)肽的化學(xué)合成往往十分困難，尤其是首尾相連的環(huán)肽合成難度最大，因?yàn)榄h(huán)肽的前體即直鏈肽的肽鍵具有很強(qiáng)的P鍵特征，分子更易于形成反式構(gòu)象，呈舒展?fàn)顟B(tài)，造成屬于反應(yīng)中心的端基的羧基和氨基在空間上距離較遠(yuǎn)，不利于發(fā)生分子內(nèi)縮合反應(yīng)，而是有利于分子間縮合。本發(fā)明合成的四種新的多肽都是雜聚肽都是首尾相接的環(huán)肽，這些肽都具有二級(jí)胺的Pro，而且都是具有疏水作用極強(qiáng)的特點(diǎn)，因此合成難度很大。本發(fā)明所研究的肽鏈中，8個(gè)氨基酸殘基都是疏水性氨基酸，這不但造成合成的困難，也使得純化過程更加不易。因?yàn)檫@些環(huán)肽不溶于水溶液，因此在純化中，必須溶于非水溶劑中，或特殊的緩沖液，而這些溶劑或緩沖液很可能不適合應(yīng)用于生物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。另外常規(guī)的固相合成中需要特殊的固相支持物。在用普通的固相支持物時(shí)，在二肽階段，由于環(huán)化引起的損失非常高。有些情況甚至導(dǎo)致所有肽鏈從固相支持物上損失，但是若C端為氨基化Pro時(shí)，使用CTC樹脂則可以避免二肽“切斷”副反應(yīng)從而會(huì)能使產(chǎn)量大為提高。多肽再液相情況下“首尾”偶聯(lián)的另一重要因素是避免消旋反應(yīng)。從合成的角度，Statine(簡(jiǎn)稱為Sta)的引入具有兩方面的考慮Sta不易引起消旋；其次Sta在N-端時(shí)，線性多肽較易純化。圍繞這些考慮，因此本發(fā)明中所采用的幾種不同的樹脂，即分別為Fmoc-法Wang Resin和CTC Resin，及Boc法Merrifield Resin。其次，本發(fā)明以BOP/HoBt/DIEA作為新型的復(fù)合型縮合試劑，具有反應(yīng)快速，縮合條件溫和以及產(chǎn)物易于純化等特點(diǎn)，可以達(dá)到提高產(chǎn)物得率，降低純化費(fèi)用的目的。
對(duì)于環(huán)化過程非常容易引起消旋的環(huán)節(jié)，申請(qǐng)人同時(shí)采取了縮短反應(yīng)時(shí)間、多位點(diǎn)接肽反應(yīng)等一系列手段來抑制消旋，結(jié)果令人滿意。另外值得一提的是，疏水性很強(qiáng)的HS-1經(jīng)Statine修飾后，溶解性大大增強(qiáng)，溶解度相比于HS-1本身大大提高，這非常有利于對(duì)其生物活性的檢測(cè)和未來臨床上的應(yīng)用。
基于以上研究，本發(fā)明環(huán)肽的合成工藝，其特征在于， 1)脫除氨基保護(hù)基將Fmoc-AAn-CTC Resin或Boc-AAn-MerrifieldResin，用DMF浸泡使之充分溶脹，然后抽干；加入含哌啶的DMF溶液，通氮?dú)夥磻?yīng)，再抽干；然后用DMF充分洗滌，以除去殘留的脫保護(hù)試劑，得到H-AAn-CTC Resin或H-AAn-Merrifield Resin；其中AAn選自氨基酸序列Ile、Ile、Sta、Pro、Tyr、Val、Pro、Leu中任一氨基酸，n＝1～8任一正整數(shù)；2)接肽反應(yīng)在反應(yīng)器中加入溶解有Fmoc-AAn-OH的DMF溶液，通氮?dú)鈹嚢?，然后加入HBTU或HATU，最后加入NMM，反應(yīng)，得到Fmoc-AAn-1-AAn-CTC Resin或Boc-AA n-1-AA n-Merrifield Resin；抽干，用DMF充分洗滌，然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，然后用含哌啶的DMF溶液脫保護(hù)，得到H-AA n-1-AA n-CTC Resin或H-AA n-1-AA n-MerrifieldResin，其中AA n-1為氨基酸AA n前位的氨基酸，依此類推； 依氨基酸序列，繼續(xù)用Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Sta-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH中其余6種重復(fù)以上接肽反應(yīng)，最終合成出所需肽鏈Pro-Val-Tyr-Pro-Sta-Ile-Ile-Leu 3)肽鏈的切割將合成肽鏈用TFA液進(jìn)行切割反應(yīng)，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，高速離心，于真空干燥器中充分干燥，得線性肽鏈的粗品，再經(jīng)硅膠柱純化得線性純化多肽； 4)肽鏈的環(huán)化將線性純化多肽用DMF溶解，加入一定量的EDC、HOBt和DIEA，反應(yīng)過程用離子阱質(zhì)譜儀全程跟蹤直至所有的線性肽都轉(zhuǎn)化成環(huán)狀多肽為止；蒸干DMF，得環(huán)肽粗品。
后面實(shí)施例子的合成工藝中，樹脂為Fmoc-AAn-CTC Resin，氨基酸AAn為Pro，AAn-1為Val。
作為優(yōu)選，所述的肽鏈的環(huán)化步驟后有環(huán)肽粗品的純化步驟將上述環(huán)肽粗品溶于DMSO中，用高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，色譜柱為C18反相柱，洗脫液A液為TFA的水溶液，B液為含％TFA的乙腈水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。
本發(fā)明采用固相法合，用Statine修飾天然結(jié)構(gòu)的HS-1，合成出其類似物A1HS1，經(jīng)質(zhì)譜儀分析檢測(cè)，驗(yàn)證了合成產(chǎn)品的正確性。產(chǎn)品經(jīng)RP-HPLC純化，產(chǎn)率高且一次純化后純度均達(dá)到90％以上。產(chǎn)品理化性質(zhì)穩(wěn)定，純度高，為隨后的生物活性檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。



圖1是合成環(huán)肽A1HS1的MS質(zhì)譜圖； 圖2是合成環(huán)肽A1HS1的RP-HPLC圖。

具體實(shí)施例方式 下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。
1合成部分 1.1儀器與試劑 多肽合成儀(ABI 433，美國(guó)ABI公司)、半制備型高效液相色譜儀(WatersDelta Prep 4000，美國(guó)Waters公司)、分析型高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)Agilent公司)、冷凍干燥機(jī)(ChristAlpha，德國(guó)CHRIST公司)、離子阱質(zhì)譜儀(LCQ Deca，美國(guó)Thermo-Finnigan公司)、紫外分光光度計(jì)(BeckmanDU7400，美國(guó)Beckman公司)、C18反相分析柱(Waters XTerra，3.5um，

4.6×150mm)。
實(shí)驗(yàn)所用Boc-Pro-Merrifield Resin(取代值0.22mmol/g，交聯(lián)度1％，100-200mesh)、Boc-Val-Wang Resin(取代值0.52mmol/g，交聯(lián)度1％，100-200mesh)、Fmoc-Pro-CTC Resin(取代值0.25mmol/g，交聯(lián)度1％，200-400mesh)、Boc-Tyr(tBu)-OH、Boc-Pro-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Statine(3S，4S)-OH、HATU、HBTU、HOBt、BOP、DIEA、TFA、DMF、DMSO、DCM、ACN和苯甲硫醚均購(gòu)自于杭州中肽，哌啶經(jīng)重蒸后使用，水為二次去離子水。
1.2HS-1的一種類似物A1HS 1的合成 1.2.1A1HS1的合成工藝與純化 1.2.1.1脫除氨基保護(hù)基將Boc-Pro-Merrifield Resin 8.0g(合成規(guī)模為2.0mmol)用DMF浸泡30min，使之充分溶脹，然后抽干。加入含20％哌啶的DMF溶液20mL，通氮?dú)夥磻?yīng)30min，再抽干。然后用DMF洗滌5次，以除去殘留的脫保護(hù)試劑。茚三酮檢測(cè)，若樹脂呈深藍(lán)色，則表明Fmoc保護(hù)基已經(jīng)脫除。得到H-Pro7-Merrifield Resin。
1.2.1.2接肽反應(yīng)在反應(yīng)器中加入溶解有6.6g Boc-Val-OH的DMF溶液，通氮?dú)鈹嚢鑾追昼姡缓蠹尤際BTU(或HATU)，最后加入NMM，反應(yīng)30min。得到Boc-Val6-Pro7-Merrifield Resin。加入DMF的量以完全浸沒樹脂為準(zhǔn)。抽干，用DMF洗滌5次。然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便進(jìn)行茚三酮檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果若樹脂呈現(xiàn)無色，則說明反應(yīng)較為完全。然后再次用含20％哌啶的DMF溶液脫保護(hù)，得到H-Val6-Pro7-MerrifieldResin。按肽鏈的氨基酸序列依次繼續(xù)用Boc-Tyr(tBu)-OH、Boc-Pro-OH、Boc-Sta-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Leu-OH重復(fù)以上接肽反應(yīng)，直至最終合成出所需肽鏈。完整的合成順序?yàn)镻ro，Val，Tyr，Pro，Sta，Ile，Ile，Leu。
1.2.1.3肽鏈的切割將合成肽鏈用HF液切割，反應(yīng)時(shí)間為3.0h，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，8000rpm離心10min，于真空干燥器中干燥12h，得線性肽鏈的粗品，純度56％。粗品經(jīng)硅膠柱純化的粗品純度92％(得率85％)。
1.2.1.4肽鏈的環(huán)化將線性純化多肽0.5g用200mL DMF溶解，加入一定量的EDC、HOBt和DIEA，反應(yīng)過程用離子阱質(zhì)譜儀全程跟蹤直至所有的線性肽都轉(zhuǎn)化成環(huán)狀多肽為止，總時(shí)間約30-40分鐘。蒸干DMF，得環(huán)肽粗品，粗品純度75％。粗品用離子阱質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒定。
1.2.1.5環(huán)肽粗品的純化將上述環(huán)化粗品肽溶于適量DMSO中，用高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，色譜柱為C18反相柱，洗脫液A液為0.1％TFA的水溶液，B液為含0.1％TFA的乙腈水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。純化好的液體進(jìn)行凍干得最終環(huán)化多肽244mg，純度95.1％(得率65.2％)。
1.2.1.6分析型HPLC檢測(cè)純度色譜柱為Waters XTerra反相柱(3.5u，4.6±150mm，

)，洗脫液A液為0.1％TFA的水溶液，B液為含0.1％TFA的乙腈水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。
1.2.1.7MS鑒定離子阱質(zhì)譜儀檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的分子量。
1.3合成肽純化后的色譜分析純化時(shí)以TFA為交換離子對(duì)、以含0.1％TFA的乙腈水溶液為洗脫液、采用線性梯度洗脫方式對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行純化。純化后的色譜分析結(jié)果顯示，主峰面積較大，其它雜質(zhì)峰面積相比于主峰面積要小得多(圖2)，表明合成的粗品經(jīng)反相高效液相色譜純化后，目標(biāo)肽的純度得到了很大地提高。
1.4合成肽純化后的質(zhì)譜鑒定ESI-MS分析的結(jié)果顯示，實(shí)際合成的多肽或雜聚肽類似物的實(shí)際分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量非常吻合。同時(shí)也可以看出，主峰明顯，雜質(zhì)很少說明合成的目標(biāo)肽經(jīng)色譜儀純化后，可以得到較純的目標(biāo)肽(圖1)。
表1合成的HS-1及其類似物的產(chǎn)率、分子量及純度 2活性實(shí)驗(yàn)部分 2.1儀器與試劑 生物安全柜(美國(guó)FORMA公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)低溫高速離心機(jī)(日本KUBOTA公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(中國(guó))，電子分析天平(Mettler-Toledo公司)，塑料培養(yǎng)皿(96、24孔，丹麥Nunc公司)，721分光光度計(jì)，CsA，蓖麻油，RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)，小牛血清(GIBCO公司)，谷氨酰胺，青霉素(華北制藥股份有限公司)，鏈霉素(上海四藥有限公司)，CsA(諾華制藥有限公司)，DNFB，印度墨汁，等。
2.2試驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠，6-8周齡，18-22g，雌雄各半。購(gòu)自于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2.3方法 2.3.1遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)試驗(yàn) 小鼠腹部皮膚去毛約3cm2區(qū)域，然后用微量進(jìn)樣器取1.2％DNFB(取麻油25ml，丙酮25ml，混勻，加入0.41mlDNFB，約0.6克，溶于上述麻油丙酮混合物中)0.1ml，均勻滴加于脫毛區(qū)致敏。于致敏當(dāng)天開始按200ug/mouse，20ug/mouse劑量對(duì)小鼠灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7d。末次給藥30min后，用1.2％DNFB涂于每鼠右耳前后兩面。實(shí)驗(yàn)分組情況為空白對(duì)照組灌胃400μl 0.9％NaCl溶液；陽性對(duì)照組灌胃400μl CsA(500ug/ml)；多肽組每種合成肽分為高(500ug/ml)、低(50ug/ml)兩個(gè)試驗(yàn)組，灌胃400μl。各組每天灌胃1次，共7天。
24h后稱體重，頸椎脫臼處死小鼠，分別剪下雙耳，用8mm打孔器在相同部位打下圓耳片，電子天平稱重，以左、右耳片重量差值作為腫脹度。
2.3.2小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn) 空白對(duì)照組灌胃400μl 0.9％NaCl溶液；陽性對(duì)照組灌胃400μl CsA(500ug/ml)；多肽組每種合成肽分為高(500ug/ml)、低(50ug/ml)兩個(gè)試驗(yàn)組，灌胃400μl。各組每天灌胃1次，共7天。
從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(注射用墨汁將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3-4倍)，按每10g體重0.1mL計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。
末次給藥后24小時(shí)，鼠尾靜脈注射印度墨汁0.1ml/10g，于注射墨汁后1分鐘及5分鐘眶內(nèi)取血40ul，分別放入含有0.1％Na2CO32ml的小試管內(nèi)，搖勻，用分光光度法測(cè)定光密度，按下式計(jì)算廓清指數(shù)K值。
拉頸處死動(dòng)物后剪取肝脾稱重。吞噬功能以吞噬指數(shù)表示。

2.3.3淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 斷頸處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，或用4層紗布將脾磨碎，用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于1mL的完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95％以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。
將脾淋巴細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組每孔加100μl RPMI1640培養(yǎng)基；陽性對(duì)照組每孔加100μlCsA(500ug/ml，用無水乙醇配制成5mg/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱-20℃保存，用時(shí)用完全培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。)；多肽組每種合成肽(以無水乙醇為溶劑，將多肽配制成5mg/ml的溶液；然后用完全培養(yǎng)液稀釋到我們所需要的濃度。)分為高(500ug/ml)、低(50ug/ml)兩個(gè)試驗(yàn)組，每孔加100μl。
將96孔板置CO2培養(yǎng)箱中(5％CO2，37℃)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔添加20ul MTT(5ug/ml)，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)4h，離心(1000r/min×5min)，吸棄上清，每孔添加二甲亞砜150ul，輕輕震蕩10min以溶解紫色結(jié)晶沉淀，測(cè)定在492nm波長(zhǎng)處的光吸收值。
將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組6個(gè)復(fù)孔的OD各自取平均值，用下式計(jì)算抑制率。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x±s)表示，各組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05表示具有顯著性差異。
2.5結(jié)果 2.5.1環(huán)肽A1HS1的溶解性 HS-1通過Sta取代后成為環(huán)肽A1HS1，其溶解性大大增強(qiáng)，尤其是在水中的溶解性。
2.5.2環(huán)肽A1HS1對(duì)小鼠DTH的影響 A1HS1在低濃度時(shí)腫脹度和胸腺指數(shù)比HS-1高濃度組和低濃度組低，所以說A1HS1對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抑制作用比HS-1強(qiáng)，與陽性對(duì)照組(環(huán)孢菌素)對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抑制作用接近。
表1環(huán)肽A1HS1對(duì)小鼠DTH的影響(x±s，n＝12)
aP＜0.05，相比于陰性對(duì)照組(生理鹽水組)；bP＜0.01，相比于陰性對(duì)照組 cP＜0.05，相比于陽性對(duì)照組(環(huán)孢菌素組)。
2.2環(huán)肽A1HS1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 陰性對(duì)照組小、陽性對(duì)照環(huán)孢菌素組、HS-1組及A1HS1組的檢測(cè)結(jié)果(見表2)。
表2環(huán)肽A1HS1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(x±s，n＝12)
aP＜0.05，相比于陰性對(duì)照組；bP＜0.01，相比于陰性對(duì)照組. 結(jié)果表明，A1HS1在低濃度時(shí)，對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力都表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且表現(xiàn)出比HS-1更強(qiáng)的抑制作用。
2.3環(huán)肽A1HS1對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 利用MTT法測(cè)得的環(huán)孢菌素(陽性對(duì)照)組對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的抑制率為12.6％，天然結(jié)構(gòu)的HS-1高、低劑量組的抑制率分別為11.2％和10.8％，與環(huán)孢菌素水平相當(dāng)，但略低于環(huán)孢菌素組。數(shù)據(jù)見表3。
表3環(huán)肽A1HS1對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s，n＝6)
aP＜0.01，相比于陽性對(duì)照組(環(huán)孢菌素組)。
HS-1在高濃度和低濃度時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖都表現(xiàn)出一定的抑制作用，且高濃度比低濃度的抑制作用略強(qiáng)，但是都比陽性對(duì)照組弱，這和以往的研究結(jié)果一致；A1HS1類似物在低濃度時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率要比高濃度強(qiáng)，且都比陽性對(duì)照組和HS-1組強(qiáng)。
3結(jié)論 通過比較陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、HS-1和A1HS1對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抑制作用、對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響以及對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，A1HS1均表現(xiàn)出了比HS-1更強(qiáng)的免疫抑制作用，已經(jīng)達(dá)到或超出了陽性對(duì)照(環(huán)孢菌素)的免疫抑制作用?？梢杂脕碛米髅庖咭种苿?。
權(quán)利要求
1、一種可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽，環(huán)(Ile-Ile-Sta-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu)，其結(jié)構(gòu)式為
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽，其特征在于為白色粉末，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑乙醇，DMSO中。
3、一種如權(quán)利要求1或2所述的可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽環(huán)肽的合成工藝，其特征在于有如下步驟
1)脫除氨基保護(hù)基將樹脂F(xiàn)moc-AAn-CTC Resin或Boc-AAn-MerrifieldResin，用DMF浸泡使之充分溶脹，然后抽干；加入含哌啶的DMF溶液，通氮?dú)夥磻?yīng)，再抽干；然后用DMF充分洗滌，以除去殘留的脫保護(hù)試劑，得到H-AAn-CTC Resin或H-AAn-Merrifield Resin；其中AAn選自氨基酸序列Ile、Ile、Sta、Pro、Tyr、Val、Pro、Leu中任一氨基酸，n＝1～8任一正整數(shù)；
2)接肽反應(yīng)在反應(yīng)器中加入溶解有Fmoc-AAn-OH的DMF溶液，通氮?dú)鈹嚢?，然后加入HBTU或HATU，最后加入NMM，反應(yīng)，得到Fmoc-AAn-1-AAn-CTC Resin或Boc-AA n-1-AA n-Merrifield Resin；抽干，用DMF充分洗滌，然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，然后用含哌啶的DMF
溶液脫保護(hù)，得到H-AA n-1-AA n-CTC Resin或H-AA n-1-AA n-MerrifieldResin，其中AA n-1為氨基酸AA n前位的氨基酸，依此類推；
依氨基酸序列，繼續(xù)用Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Sta-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH中其余6種重復(fù)以上接肽反應(yīng)，最終合成出所需肽鏈Pro-Val-Tyr-Pro-Sta-Ile-Ile-Leu；
3)肽鏈的切割將合成肽鏈用TFA液進(jìn)行切割反應(yīng)，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，高速離心，于真空干燥器中充分干燥，得線性肽鏈的粗品，再經(jīng)硅膠柱純化得線性純化多肽；
4)肽鏈的環(huán)化將線性純化多肽用DMF溶解，加入一定量的EDC、HOBt和DIEA，反應(yīng)過程用離子阱質(zhì)譜儀全程跟蹤直至所有的線性肽都轉(zhuǎn)化成環(huán)狀多肽為止；蒸干DMF，得環(huán)肽粗品。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的環(huán)肽的合成工藝，其特征在于樹脂為Fmoc-AAn-CTC Resin，氨基酸AAn為Pro，AAn-1為Val。
5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的環(huán)肽合成工藝，其特征在于所述的肽鏈的環(huán)化步驟后有環(huán)肽粗品的純化步驟將上述環(huán)肽粗品溶于DMSO中，用高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，色譜柱為C18反相柱，洗脫液A液為0.1％TFA的水溶液，B液為含0.1％TFA的乙腈水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。
6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的環(huán)肽合成工藝，其特征在于所述的肽鏈的環(huán)化步驟后有環(huán)肽粗品的純化步驟將上述環(huán)肽粗品溶于DMSO中，用高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，色譜柱為C18反相柱，洗脫液A液為TFA的水溶液，B液為含TFA的乙腈水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽，環(huán)(Ile-Ile-Sta-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu)。其合成工藝為1)脫除氨基保護(hù)基；2)接肽反應(yīng)；3)肽鏈的切割；4)肽鏈的環(huán)化。從而獲得了產(chǎn)率高、純度高的可用作免疫抑制劑的帶有-Ile-Sta-Pro-殘基片段的環(huán)肽化合物，且該環(huán)肽化合物的免疫抑制活性更高。通過A1HS1對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抑制作用、對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響以及對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用的實(shí)驗(yàn)，可以看出A1HS1均表現(xiàn)出了比HS-1天然更強(qiáng)的免疫抑制作用，已經(jīng)達(dá)到或超出了陽性對(duì)照(環(huán)孢菌素)的免疫抑制作用。
文檔編號(hào)C07K7/00GK101289499SQ20081006103
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月1日
發(fā)明者湘 李, 琪 徐 申請(qǐng)人:杭州中肽生化有限公司