專利名稱：麥冬皂苷d在制備調控血管內皮細胞功能基因藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及麥冬皂苷D在制藥中的新用途，具體地說是涉及麥冬皂苷D在制備調控血管內皮細胞周期基因藥物中的應用，屬中藥技術領域。
背景技術：
1.麥冬通過保護血管內皮細胞來完成養(yǎng)陰行血之功效麥冬為臨床滋養(yǎng)陰液的常用之品，是養(yǎng)陰生津的代表藥物之一。麥冬，百合科植物麥冬Ophiogon japonicus(Thumb.)Ker-Gawl.的干燥塊根。主要含多種糖甙麥門冬皂苷B、D，23，24二羥基羅斯考皂苷，麥冬甙元-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖甙，甲基麥冬黃烷酮A、B，麥冬黃烷酮A、B，6-醛基異麥冬黃烷酮A、B，麥冬甙元，丙三醇以及β-谷甾醇、豆甾醇。另含揮發(fā)油，從中分得長葉烯、α-廣藿香烯、β-廣藿香烯、香附子烯、愈創(chuàng)奧烯、α-律草烯、樟腦、芳樟醇等成分。麥冬始載于《神農本草經》，味甘、微苦，性微寒，歸肺、胃、心經。具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。
前期研究發(fā)現養(yǎng)陰代表中藥麥冬的藥物血清、有效部位群/組分/成分，具有不同程度的保護血管內皮細胞的作用，其中正丁醇部位的藥效作用更為顯著，以標準品麥冬皂苷D為對照進行高效液相分析發(fā)現，其中含有麥冬皂苷D成分。
2.麥冬皂苷D的研究進展沿階草屬麥冬主產于四川綿陽，三臺和浙江慈溪，蕭山等地。杭麥冬與川麥冬的總皂苷的含量差異與栽培年限相關，杭麥冬生長周期為2～3年，川麥冬的栽培期為1年。不同產地麥冬的單體成分麥冬皂苷B、D含量也有較大差別，杭麥冬主含麥冬皂苷B、含少量皂苷D；而川麥冬主含麥冬皂苷D、含少量皂苷B。
研究發(fā)現麥冬皂苷D可顯著抑制靜脈血栓模型大鼠早期外周血中性粒細胞活化、粘附；減輕血栓重量；降低血清sICAM-1含量；其副作用低；麥冬皂苷D還可下調大鼠靜脈血栓部位TF蛋白表達，并抑制MAPKp38和JNK磷酸化，提示麥冬皂苷D可通過影響上述信號通路，降低炎癥反應，抑制血栓形成。另麥冬皂苷有顯著性的抗炎作用，魯斯可皂苷元和麥冬皂苷D為其中的兩種活性成分。
同種不同產地樣品中麥冬皂苷D的含量有較大差別，浙江產麥冬含量較低，四川產麥冬含量較高。對浙江產麥冬、四川產麥冬不同批次樣品測定，發(fā)現麥冬皂苷D的含量差別較大，且同一產地浙江產麥冬中麥冬皂苷D的含量相差更大。生長年限對麥冬皂苷D的含量有一定的影響，年限長，含量略有增加。因此麥冬皂苷D含量的高低僅僅可作為川麥冬質量指標，而不適合作為浙麥冬質量的指標。
由于皂苷為一類極性較大，結構復雜的化合物，它無紫外吸收，無專一顯色劑，再加上麥冬皂苷測定經常受糖的干擾，若采用紫外檢測末端吸收法，則靈敏度低，且有干擾峰，無法使用。因此，我們采用比色法測定麥冬總皂苷含量為0.2855％，利用HPLC-ELSD法測定麥冬皂苷D的含量為0.03229％。為進一步獲取其內在成分的信息，我們進行了ESI-TOF-MS測試，以ESI正離子為麥冬皂苷主要電離方式，乙腈-水梯度洗脫，205nm為檢測波長提取紫外色譜圖，確定35.52min為麥冬皂苷D，其裂解方式為先脫去與巖藻糖(1→2)連接的鼠李糖及(1→3)連接的木糖，后脫去巖藻糖。采用兩種測試方法全面綜合分析麥冬皂苷D。
3.麥冬皂苷D的提取分離取5~10目麥冬藥粉，加10倍量70％乙醇，熱回流提取3次，每次2h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味。然后，將其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振搖提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水層。將水層繼續(xù)用3倍量正丁醇振搖提取3次，得到正丁醇提取物和水層，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振搖提取2次，棄去0.1mol/L NaOH。將正丁醇提取物進行大孔樹脂柱洗脫，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脫，分別得到相應的洗脫物。60％乙醇洗脫物經硅膠柱色譜，水飽和正丁醇洗脫，得到麥冬皂苷D。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供麥冬皂苷D在制藥中的新用途，具體地說是提供麥冬皂苷D在制備調控血管內皮細胞功能基因藥物中的應用。
保護血管內皮細胞是防治心腦血管病癥的重要環(huán)節(jié)血管內皮細胞(vascular endothelial cell，簡稱VEC)能合成多種血管活性物質，對血管的舒縮功能與血液的流動性有著不可替代的調節(jié)作用。血管內皮并非單純的襯里，它有著活躍的生理功能。如對凝血和抗凝；纖溶抗纖溶；血小板聚集和抗聚集；白細胞粘附和抗粘附；血管舒縮以及平滑肌細胞間的調控(促增殖和抗增殖)都處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦受到損傷則失去平衡，有的學者稱之為內皮功能障礙(Endothelial dysfunction)，是促進形成早期動脈粥樣硬化的始動因素，也是目前研究的熱點。VEC生理功能的動態(tài)平衡是維持血行正常的重要條件。因此，當VEC受到損傷時，不僅自身的生理功能被破壞，而且還會激活多種凝血和促凝因子，致使血液成分改變和粘度增高，導致血液速度減慢或出現旋渦，從而易于產生血瘀。VEC可因諸多因素受損，主要包括自由基、炎癥介質、內毒素等。這些致病因素作用于VEC，可直接加速其凋亡而引起功能失衡，最終引起促栓作用形成微血栓而引發(fā)、加重心腦血管疾病?？梢?，VEC損傷心腦血管疾病中占有非常重要的地位。所以改善和保護血管內皮細胞形態(tài)及功能的完整性，是預防和治療心腦血管疾病的重要著眼點。
本發(fā)明運用基因芯片技術，將血管內皮細胞功能基因芯片的120條基因用于分析與內皮細胞功能相關的基因的表達，包括與血管通透性、血管收縮、血管生成、內皮細胞激活及內皮細胞損傷相關基因。發(fā)現H2O2可顯著上調其中20條基因，下調其中2條基因，麥冬組皂苷D可顯著下調26條基因，包括上述的15條基因，并上調4條基因的表達，因而對抗H2O2的損傷作用，從而達到保護血管內皮細胞形態(tài)及功能的完整性。
具體實施例方式
實施例麥冬皂苷D調控血管內皮細胞功能基因的研究從中藥材麥冬提取分離的有效成分麥冬皂苷D對人臍靜脈血管內皮細胞有抗H2O2所致凋亡的作用。本發(fā)明運用基因芯片技術，針對血管內皮細胞功能相關基因，發(fā)現了麥冬皂苷D所調控的血管內皮細胞基因表達譜。
1材料與方法1.1主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO，USA)(每升含20％小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg、青霉素100u、鏈霉素100u、pH-7.4)；消化劑為0.25％胰蛋白酶(MERCK，USA)；四川綿陽產麥冬，購自南京市藥材公司，經南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定為Ophiopogon japonicus.(L.f.)Ker-Gawl.的塊根。
RNA抽提試劑TRIZOL試劑(Invitrogen life technologies)，氯仿，異丙醇，75％乙醇(以DEPC處理的水配制)，無RNA酶的水，無RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。
RNA質量檢測試劑TE10mM Tris-HCl pH 8，1mM EDTA，0.4M MOPS，pH7.0，0.1M乙酸鈉，0.01M EDTA，甲醛，甲醛上樣染液(ambion)，溴化乙錠(Ethidium Bromide，EB)，瓊脂糖。
cRNA標記與合成試劑TrueLabeling-AMPTM線性RNA擴增試劑盒(cDNA合成G1TrueLabeling引物，RIRNA酶抑制劑，G2cDNA合成酶混合液，G35×cDNA合成緩沖液，H2O除RNA酶的H2O。RNA線性擴增以及cRNA合成G42.5×RNA擴增緩沖液，G5擴增酶類混合液)。Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)，SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒。
芯片雜交試劑Oligo GEArray芯片Human Endothelial Cell BiologyMicroarrayOHS-015，GEAhyb雜交液(SuperArray Bioscience)，20× SSC(900ml H2O中溶解175.3g的NaCl和88.2g的二水檸檬酸鈉，用1M的HCl調節(jié)pH到7.0，加水至1L)，20％SDS(1L H2O中溶解200g十二烷基磺酸鈉)。
化學發(fā)光檢測試劑化學發(fā)光檢測試劑盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，GEA封閉液Q，5×緩沖液F，AP，緩沖液G，CDP-Star化學發(fā)光底物。
1.2麥冬皂苷D的提取分離取5~10目麥冬藥粉，加10倍量70％乙醇，熱回流提取3次，每次2h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味。然后，將其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振搖提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水層。將水層繼續(xù)用3倍量正丁醇振搖提取3次，得到正丁醇提取物和水層，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振搖提取2次，棄去0.1mol/L NaOH。將正丁醇提取物進行大孔樹脂柱洗脫，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脫，分別得到相應的洗脫物。60％乙醇洗脫物經硅膠柱色譜，水飽和正丁醇洗脫，得到麥冬皂苷D。
1.3藥物分組分為對照組、造模組(100umolH2O2)和麥冬皂苷D組(100umolH2O2+1.29ug/ml麥冬)。
1.4血管內皮細胞的培養(yǎng)無菌條件下取胎齡為37~40wk的新生兒臍帶(長約30~50cm)，排盡殘血，剪去鉗夾部分，投入滅菌保存液(0.14mol/L NaCl、4mmol/L KCl、15mmol/L Hepse、11mmol/L葡萄糖、pH7.3)中，4℃保存。然后用D-Hanks液(pH 7.3~7.4)反復灌洗臍靜脈，直至將余血沖洗干凈。向靜脈內注入0.25％的胰蛋白酶5~10ml，在37℃下孵育10min。收集臍靜脈腔內的消化液，此后迅速注入適量(5ml)含20％小牛血清的培養(yǎng)液以終止酶消化作用并收集入刻度離心管中。收集細胞的全過程應在兩分鐘內完成。室溫下1000rpm，離心10分鐘，倒盡上清液，吸取1ml培養(yǎng)液于離心管中，吹打成懸液，用0.4％臺酚藍染色少量細胞懸液。計數活細胞在95％以上，再加入20％RPMI-1640培養(yǎng)基，調整細胞濃度為5×107·L-1，將此濃度的原代HUVEC200ul移入細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。置于5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。第1個24h更換培養(yǎng)液的1/2，以后每隔24h換液1次。根據相差顯微鏡下細胞呈單層鵝卵石樣排列、免疫細胞化學法染色細胞第VIII因子相關抗原呈陽性，確定培養(yǎng)細胞為內皮細胞。
1.5 RNA抽提a.勻漿直接在3.5cm直徑的培養(yǎng)盤中加入1ml TRIZOL試劑裂解細胞，裂解時用槍吸打幾次。加入TRIZOL試劑的量取決于培養(yǎng)盤的面積(每10cm2加1ml)而不是培養(yǎng)細胞的數量。
b.兩相分離勻漿后樣品于15到30℃孵育5分鐘，以便核酸蛋白復合體完全解離。每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12,000×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時加入的TRIZOL試劑的60％。
c.RNA沉淀將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入1ml TRIZOL試劑的此時加0.5ml的異丙醇?；靹蚝?5到30℃孵育10分鐘后，于4℃ 12,000×g離心10分鐘。
d.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃ 7,500×g離心5分鐘。
e.重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘。溶解RNA時，先加入無RNA酶的水用槍反復吹打幾次，然后55到60℃孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于-70℃。
1.6 RNA質量檢測a.紫外吸收測定法取少量液體用TE稀釋(一般1∶100稀釋)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，可以測定RNA溶液濃度和純度。用來稀釋的TE不需要經過無RNA酶處理，因為RNA的微量降解不會明顯影響分光光度計的讀值。測量前需先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。濃度測定在A260下讀值為1表示40μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為A260×稀釋倍數×40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法，比值范圍1.8到2.1。
b.變性瓊脂糖凝膠電泳制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10ml的10×MOPS電泳緩沖液(0.4M MOPS，pH 7.0，0.1M乙酸鈉，0.01MEDTA)和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。取3μg RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。上樣于膠孔中，5-6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。紫外透射光下觀察并拍照。
1.7 cRNA標記與合成a.cDNA合成先配制退火混合液每個RNA樣品均如下配制于一個滅菌的PCR管中0.1-3.0μg總RNA，1.0μl G1，加去RNA酶的H2O至總體積為10μl。用移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，稍微離心使液體聚集于管底。70℃水浴10min后立刻放于冰中。再配制cDNA合成混合液，在離心管中依次加入，按每張芯片4μl除RNA酶的H2O，4μl 5×cDNA合成緩沖液(G3)，1μl RNA酶抑制劑(RI)，1μl cDNA合成酶混合液(G2)，總體積10μl。用移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，稍微離心使液體聚集于管底。置于冰上待用。cDNA合成反應每10μl退火混合液中加入10μl的cDNA合成混合液。移液槍輕輕吸打幾次混合均勻，稍微離心使液體聚集于管底。42℃水浴50分鐘。短暫離心(約2秒)使液體聚集于管底。然后進行cRNA合成步驟或-20℃保存過夜。
b.cRNA合成，標記和擴增先配制擴增混合液試劑盒中所有管溶解后離心溶液至管底，置冰中待用。在離心管中依次加入擴增混合液按每張芯片16μl 2.5×RNA擴增緩沖液(G4)，2μl Biotin-16-UTP(Roche or ENZO)，2μl擴增酶類混合液(G5)，總體積為20μl。分別加入20μl擴增混合液。吸打混勻并離心至管底。37℃水浴4小時以上。
c.cRNA純化使用SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒(貨號GA-012)。按步驟配制cRNA樣品，將cRNA結合至純化柱上，清洗純化柱，再將cRNA從純化柱中洗脫。
d.質量控制取499μl的TE(pH 8.0)至比色管中，確認管壁無氣泡。比色管放入紫外分光光度計，調零。在比色管中直接加入1μl cRNA，吸打混合均勻。讀出其在230，260和280nm的吸光率。取出比色管，棄去液體，洗干凈涼干。計算濃度A260×40×500(稀釋倍數)＝樣品濃度(μg/ml)。計算260/280和260/230比值以確定樣品純度。純化的樣品具有如下比值RNA的260/280比值＞2.0，RNA的260/230比值＞2.0。
1.8芯片雜交a.預雜交加約5ml去離子水于雜交管中預濕芯片膜，擰緊管蓋倒放5分鐘。60℃預熱GEAhyb雜交液(GEAhyb Hybridization Solution)多次顛倒試劑瓶以徹底溶解瓶中組分。去除雜交管中的水，加入2ml預熱的GEAhyb雜交液，轉動管子。確定管蓋擰緊。將雜交管放在雜交爐中，旋緊蓋子。加熱后檢測雜交管蓋是否仍然密封。以轉速5-10rpm 60℃預雜交1到兩小時。
b.雜交配制樣品雜交液加入4到20μg用TrueLabeling-AMP試劑盒制備的生物素標記的cRNA樣品至0.75ml預熱的GEAhyb雜交液中，混合均勻放于60℃。棄去雜交管中的預雜交液，加入含有標記的cRNA的樣品雜交液。于60℃保持5到10rpm旋轉雜交過夜。
c.洗膜每張芯片需配制5ml的洗液1和5ml的洗液2。洗液12× SSC，1％SDS(混合10ml 20×SSC，5ml 20％SDS，和85ml ddH2O)。洗液20.1×SSC，0.5％SDS(混合0.5ml 20×SSC，2.5ml 20％SDS和97ml ddH2O)。洗液1和洗液2使用前均需要預熱至60℃。加入5ml洗液1至雜交管中，簡單轉動幾下，放回雜交爐中。60℃ 20到30rpm轉動洗膜15分鐘。棄去洗液。加入5ml洗液2至雜交管中，簡單轉動幾下，放回雜交爐中。60℃ 20到30rpm轉動下，洗膜15分鐘。立刻棄去洗液，蓋上雜交管蓋以保持膜濕潤，冷卻至室溫。
1.9化學發(fā)光檢測a.膜封閉最后一次洗膜后，棄去洗液，立刻加入1.5ml GEAb封閉液Q，在雜交儀中30到40rpm孵育40分鐘。
b.加入鏈親和素偶聯的堿性磷酸酶(AP)配制1×緩沖液F用水將5×緩沖液F稀釋5倍。(每雜交管準備18ml的1×緩沖液F)。配制結合混合液AP∶1×緩沖液F(1∶7,500)混合。(每雜交管配制2ml結合緩沖液)。棄去雜交管中的GEA封閉液Q，加入2ml結合緩沖液，在雜交儀中輕輕搖動孵育10分鐘。
c.洗膜洗膜4次加入4ml的1×緩沖液F溫和振蕩5分鐘，棄去1×緩沖液F。加入3ml緩沖液G溫和震蕩分鐘；倒掉，再用3ml緩沖液G重復洗一次。
d.檢測加入1.0ml CDP-Star化學發(fā)光底物至雜交管中，室溫孵育2分鐘。取出膜，放在一張濾紙上以去除多余的CDP-Star溶液，然后用干凈的塑料膜兩面包住，驅除氣泡，用X-射線膠片曝光。
2.0圖象采集和數據分析a.圖象和數據采集X-射線膠片曝光后，將膠片上的圖象用掃描儀掃描并轉換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運行ScanAlyze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點陣轉化為數字型數據，將此原始數據儲存為Microsoft Excel文件。
b.數據分析使用芯片配套軟件GEArray Analyzer對原始數據進行去背景計算以及比較運算。每張芯片都點有負對照(PUC18DNA和空白)以及管家基因，包括β-actin，GAPDH，Cyclophilin A和核糖體蛋白L13a。原始數據將首先被減掉背景最小值，繼而用管家基因來進行校正，校正后的數據用來進行樣品間基因轉錄的相對豐度分析。
2結果內皮細胞生物功能芯片包括與血管通透性、血管收縮、血管生成、內皮細胞激活及內皮細胞損傷相關基因。
血管通透性、血管收縮基因血管緊張素系統基因AGTR1，AGTR2，BLR1，MAS1。NO系統NOS2A，NOS3。前列環(huán)素系統基因PTGIS，PTGS2。內皮系統基因EDNRA，EDNRB。
氧化還原酶活性基因ALOX5，NOS2A，NOS3，PTGIS，PTGS2，SOD1，XDH。
血壓調節(jié)基因ACE，AGT，AGTR2，CHGA，EDN1，EDN2，EDN3，EDNRA，NPPB，NPR1，PTGS2。血管通透性調節(jié)基因AZU1，NPPB，NPR1。血管收縮基因EDN1，EDN2，EDN3.
血管生成基因血管生成負調控基因KLK3，NPPB，NPR1，PF4。血管生成正調控基因ANGPTL3，RHOB，SPHK1。其它血管生成基因ANGPT1，ANGPT2，ECGF1，FGF1，FGF2，FLT1，IL8，KDR，PGF，VEGF。
內皮細胞激活基因粘附分子基因ANGPTL3，AZU1，CCL2，CCL5，CDH5，COL18A1，CX3CL1，FN1，ICAM1，ICAM2，ICAM3，IL8，ITGA5，ITGAV，ITGB1，ITGB3，OCLN，PECAM1，RHOB，SELE，SELL，SELPLG，TEK，THBS1，TNF，VCAM1，VWF。胞外分子(ECMs)基因ACE，ACE2，ADAM17，AGT，ANGPT2，ANGPTL3，AZU1，CCL2，CCL20，CCL5，CHGA，COL18A1，CPB2，CSF2，ECGF1，EDN1，EDN2，EDN3，ENPEP，FGF1，FGF2，FLT1，FN1，IL15，IL1B，IL3，IL6，IL7，IL8，KLK3，MMP1，MMP14，MMP2，MMP9，NPPB，PLAT，PLAU，SERPINE1，TFPI，TFPI2，THBS1，TIMP1，TNFSF6，VWF。細胞因子激活基因CCL20，CCL5，CSF2，CSF3，CX3CL1，F3，IFNB1，IL11，IL14，IL15，IL1B，IL3，IL6，IL7，IL8，PF4，TNF，TNFRSF11B，TNFSF10，TNFSF6。凝血酶激活基因ANXA5，PLAT，PLAU，PLG，THBD。血管內皮細胞生長因子激活基因FLT1，FLT3，FLT4，KDR，KIT，PDGFRA，PDGFRB，VEGF。其它與細胞生長相關基因BAX，BCL2，COL18A1，CSF2，CSF3，ECGF1，EDN1，EDN2，EDNRA，ENPEP，FGF1，FGF2，IFNB1，IL11，IL14，IL15，IL1B，IL3，IL6，IL7，IL8，MAS1，NOS2A，NPPB，PGF，PLG，RHOB，SPHK1，TIMP1，VWF。
內皮細胞損傷基因應激反應基因ALOX5，AZU1，BCL2，CCL2，CCL20，CCL5，CSF2，CSF3，CX3CL1，FN1，IFNB1，IL1B，IL6，IL7，IL8，ITGB1，NOS2A，PF4，PLA2G4C，PTGS2，SELE，SELPLG，SOD1，TNF，VEGF，VWF?？沟蛲龌駻ZU1，BAX，BCL2，BCL2A1，BCL2L1，CCL2，CFLAR，SPHK1，TNF，TNFAIP3，TNFRSF6。Caspase激活基因CASP1，CASP10，CASP3，CASP6，CFLAR，IFNB1。凋亡誘導基因BAX，CASP10，CASP3，CASP6，CFLAR，CRADD，TNFRSF6，TNFSF10，TNFSF6，AGTR2，IL1B，RHOB，RIPK1，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF11B，VEGF。
三組芯片經過分析比較不同組間基因上、下調有顯著差異造模與對照組相比較有22條基因有顯著差異，占檢測基因的19.6％，其中20條基因顯示H2O2對其有顯著的上調作用


2條基因顯示H2O2對其有顯著的下調作用

麥冬皂苷D組與模型組相比較有30條基因有顯著差異，占檢測基因的26.8％，其中26條基因顯示麥冬皂苷D可對抗H2O2的上調作用，對其有顯著的下調作用



4條基因顯示麥冬皂苷D可對抗H2O2的下調，有顯著的上調作用


3.討論基因芯片技術是近幾年發(fā)展起來的一項前沿生物技術。它能在一次實驗中對成千上萬種基因的表達水平進行同時檢測，篩選出與疾病相關的大量基因群，找出疾病發(fā)生的關鍵所在，并探尋藥物的作用靶點，它真正實現了基因分析的大規(guī)模、小型、平行和自動化。
內皮細胞損傷是血瘀形成的可能途徑之一，血管內皮細胞在血瘀形成過程中起重要作用。H2O2通過血管內皮細胞的傳導可引起內皮細胞代謝及基因表達的變化。血管內皮細胞生物學基因芯片，包括與血管通透性、血管收縮、血管生成、內皮細胞激活及內皮細胞損傷相關基因。結果顯示H2O2可以對22條基因有顯著調控作用，其中上調的基因有NO體系的NOS3；氧化還原酶活性相關的PTGIS；血管生成相關基因ECGF1、FGF2；粘附分子ICAM3、ITGA5、SELPLG、VCAM1；胞外分子(ECMs)ANGPT2、MMP9、TFPI、TFPI2；細胞因子活性相關的CSF3、CX3CL1、IL15；血管內皮生長因子受體活性相關的FLT4、KDR；與細胞生長相關的SPHK1；抗凋亡的TNFAIP3；誘導凋亡的CRADD。而麥冬皂苷D則可將上述的15條基因顯著下調NO體系的NOS3；粘附分子ICAM3、ITGA5、SELPLG、VCAM1；胞外分子(ECMs)MMP9、TFPI2；細胞因子活性相關的CSF3、CX3CL1、IL15；血管內皮生長因子受體活性相關的FLT4、KDR；與細胞生長相關的SPHK1；抗凋亡的TNFAIP3；誘導凋亡的CRADD。同時還上調了其他6條基因血管生成相關基因ANGPT2；粘附分子OCLN，PECAM1；細胞因子活性相關的IL14；細胞生長基因ECGF1、EDN1、FGF2；應激反應基因PTGS2；誘導凋亡的RHOB。
在H2O2作用下顯著下調的基因有2條血壓調節(jié)相關基因NPR1、內皮細胞粘附分子SELE。而麥冬皂苷D則可顯著上調這兩條基因，并顯著上調另外兩條基因caspase活性相關基因CASP10、凋亡誘導基因TNFRSF10D?？梢婝湺碥誅保護血管內皮細胞的分子機制是一個復雜的網絡關系，是多條基因共同作用的結果。
權利要求
1.麥冬皂苷D在制備調控血管內皮細胞功能基因藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明運用基因芯片技術，將血管內皮細胞功能基因芯片120條基因用于分析與內皮細胞功能相關的基因表達，檢測結果發(fā)現H
文檔編號C07H1/00GK101088506SQ20071002456
公開日2007年12月19日 申請日期2007年6月22日 優(yōu)先權日2007年6月22日
發(fā)明者張旭, 陸兔林, 蔡寶昌, 王明艷, 毛春芹, 張小燕, 張志潔, 楊進 申請人:南京中醫(yī)藥大學