專利名稱：蛋白的親和純化的制作方法
蛋白的親和純化
本發(fā)明涉及用于多肽的親和純化中的嵌合融合蛋白。
諸如蛋白的生物分子的親和純化為本領域已知且允許通過使用靶分
子對分子結合伙伴的結合親和性來純化分子。例如，葡萄球菌A蛋白結 合免疫球蛋白G且這已被用于從血清中純化和/或濃縮抗體。"親和標簽" 的其它例子包括麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽轉移酶、釣調蛋白結合蛋白 和將多組氨酸軌(polyhistidine tracks)工程化為隨后通過在含鎳基質上的 親和純化來純化蛋白。在許多情況下，能夠使用可商購的載體和/或試劑 盒融合感興趣的蛋白和適當?shù)挠H和標簽，然后轉染至宿主細胞中表達以 及隨后提取和在親和基質上純化。
基因組測序導致編碼蛋白的基因的鑒定大量增加。在某些實例中， 簡單地通過參考其線性序列不能明顯得知基因的功能，期望確定這些未 確定功能的蛋白的功能以及在細胞中與它們相互作用的蛋白伙伴。確定 基因功能的逆向基因組方法費力且耗時。確定通過基因組測序筌定的蛋 白的靶蛋白的物理方法有吸引力，并且可能是通向確認未確定功能的開 ;改閱讀框的功能的第一步。此外，在發(fā)現(xiàn)已知蛋白的新的潛在活性的努 力中，還可能期望確定已知蛋白的結合伙伴。
稱為"雙雜交"的經典技術被用來鑒定已知蛋白的結合伙伴，例如 在Battel and Fields 1997) The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press New York中描述的。盡管這項技術已經成功地鑒定了給定蛋白的單 一相互作用伙伴，但其傾向于導致假陽性和假陰性的錯誤，并且由于該 系統(tǒng)不能鑒定細胞中有時存在的更高級結構而受到限制。
WO00/09716中描述了鑒定和分離蛋白復合物的系統(tǒng)。該技術^皮稱為 串聯(lián)親和純化(TAP)且使用兩部分親和純化方法，該兩部分親和純化方法 使用含有被可切割接頭分開的兩個不同親和標簽的融合蛋白，該親和標 簽例如A和B。通常，編碼靶蛋白的核酸被亞克隆至所述親和標簽之一 的附近。這產生由NH靶蛋白親和標簽B -可切割接頭-親和標簽A
COOH組成的融合蛋白。
融合構建體被轉染至諸如酵母細胞的細胞中并表達。結合靶的蛋白 與融合蛋白相連，將細胞在非變性條件下破碎并將細胞提取物施加到標 簽A與之結合的親和基質上。然后在洗涂后通過切割接頭使結合的復合 物從親和基質上解離下來，所述接頭通常為蛋白酶敏感的接頭。然后使 用親和標簽B與之結合的第二親和基質進行第二輪親和純化。洗滌第二 篩選步驟且從第二基質上洗脫以提供與把蛋白結合的蛋白的純化的復合 物。所述兩步篩選減少非特異性結合且允許分離蛋白復合物而非單一結 合伙伴。在WO00/09716中，所述第一和第二親和標簽是蛋白A和鈣調 蛋白結合蛋白。WO03/095619描述了 TAP的其它實例。在這個例子中， 所述第一和第二親和標簽分別是具有生物素化識別基序的蛋白和六肽組 氨酸標簽多肽。
希望鑒定對親和基質有更高親和力的其它親和標簽，以通過提高親 合。、、'、土 、、 、 '、 '
大腸菌素是蛋白質抗生素家族，由腸桿菌科(Ewtera^"en'acae)在應 激期間產生。這些蛋白通過起離子載體的作用且去極化內層膜或通過在 周質或細胞質中的溶解(例如核酸酶)活性殺滅敏感細菌細胞。通常，大腸 菌素包含中心受體結構域、氨基末端轉移結構域和羧基末端細胞毒結構 域。稱為酶E型大腸菌素的一類大腸菌素通過與維生素B12受體和位于周 質中的Tol復合體的接觸進入細菌細胞中，該Tol復合體引發(fā)大腸菌素向 細胞中的轉移。已知E大腸菌素有9個群；El是形成離子載體的大腸菌 素，其余的是核酸內切酶或核糖核酸酶。例如，E3、 E4、 E5和E6大腸 菌素是核糖核酸酶，E2、 E7、 E8和E9是非特異性DNA酶。
E型大腸菌素在宿主細菌細胞中的表達是有困難的，因為宿主細胞必 須能夠嚴格控制核酸酶的活性，否則宿主細胞核酸就會對核酸酶攻擊敏 感。這通過所謂的"免疫蛋白"的共表達克服，"免疫蛋白"是大腸菌 素的抑制劑，其結合大腸菌素核酸酶結構域以中和其活性。免疫蛋白和 大腸菌素的復合物被分泌到細胞外環(huán)境中，且是此復合物結合耙細胞。 一旦轉移開始，免疫蛋白解離，不再保護靶細胞免受大腸菌素的作用。 這類免疫蛋白的例子是以極高親和力結合大腸菌素E9的核酸內切酶 (DNA酶)結構域的Im9,其中，在pH7和25。C下復合物的Kd為10"6M (Wallis et al (1995) Biochemistry 34， 13743)。另 一個例子是免疫蛋白Im3, 其結合大腸菌素E3的核糖核酸酶(RNA酶)結構域，其中在pH 7和25 。C 下復合物的Kd為1(T12M (Walker etal (2003) Biochemistry 42, 4161)。這些 非常高的親和性使得核酸酶-免疫蛋白復合物成為理想的基于親和性的 純化模塊。
在基于親和性的純化中使用大腸菌素DNA酶-Im蛋白復合物的其 它吸引因素是DNA酶結構域對其同源Im蛋白伙伴顯示類似的高水平特 異性，而高度區(qū)別出非同源Im蛋白(Li et al (2004) J. Mol. Biol. 337, 743)。 例如，對大腸菌素E7的DNA酶結構域特異的Im7蛋白以約10—4M的 結合非同源的E9DNA酶結構域，該結合比相同條件下同源免疫蛋白Im9 弱12個數(shù)量級。因此，如下文中所述，能夠構建雙免疫蛋白融合物，其 中對大腸菌素核酸酶柱的結合是對同源伙伴關系特異的。
我們在本文中公開親和純化方法，其利用免疫蛋白對大腸菌素核酸 酶的非常高的親和性和特異性。
根據(jù)本發(fā)明的方面，提供包含與至少一種異源多肽連接的免疫多肽 的嵌合融合蛋白。
優(yōu)選地，所述免疫多肽與所述異源多肽通過接頭分子連接。 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述接頭包含可切割的肽接頭。 根據(jù)本發(fā)明的方面，提供編碼嵌合多肽的核酸分子，該核酸分子包
含
i) 第一部分，其由

圖1或圖2所示的、編碼至少一個多肽或其活性 結合部分的核酸序列組成，該多肽或其活性結合部分具有與免疫蛋白相 連的活性；或者其由變體核酸分子組成，該變體核酸分子與圖1或圖2 所示的、編碼具有免疫多肽相關活性的多肽的核酸分子雜交；以及
ii) 第二部分，其由編碼異源多肽的核酸序列組成，其中所述第一和 第二部分相連接。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述第一和第二核酸分子通過接頭分 子連接。優(yōu)選地，所述接頭編碼可切割的肽接頭。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述雜交條件是嚴緊條件。 當兩個互補核酸序列經歷一定數(shù)量的相互的氫鍵結合時，發(fā)生核酸 分子的雜交。雜交的嚴緊性可以隨圍繞核酸的環(huán)境條件、雜交方法的性
質以及所用的核酸分子的組成和長度而變化。在Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實'瞼室手冊)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY， 2001);和Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I， Chapter 2 (生物化學和分子 生物學中的實驗室技術-使用核酸探針的雜交，第1部分，第2章) (Elsevier, New York, 1993)中討論了關于獲得特定嚴緊性程度所要求的雜 交條件的計算。Tm是50%的核酸分子給定鏈與其互補鏈雜交時的溫度。 下文是示例性的雜交條件，且是非限制性的
非常高的嚴緊性(允許具有至少90%同 一性的序列雜交)
雜交5xSSC， 65。C下進行16小時
洗滌兩次2xSSC，室溫(RT)，每次15分鐘
洗滌兩次0.5xSSC， 65°C，每次20分鐘
高嚴緊性(允許具有至少80%同一性的序列雜交)
雜交5x-6xSSC， 65°C-70°C下進行16-20小時
洗滌兩次2xSSC， RT，每次5-20分鐘
洗滌兩次lxSSC， 55°C-70°C，每次30分鐘
低嚴緊性(允許具有至少50%同 一性的序列雜交)
雜交6xSSC， RT至55。C下進行16-20小時
洗涂至少兩次2x-3xSSC， RT至55。C，每次20-30分鐘。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述第一部分包含由編碼至少一種大 腸菌素DNA酶免疫多肽的核酸序列組成的核酸分子。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述免疫多肽由表1A所示的核酸序列 編碼或是表1B所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述免疫多肽選自Im2、 Im7、 Im8和Im9。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述第一部分包含由編碼至少一 種大腸菌素RNA酶免疫多肽的核酸序列組成的核酸分子。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述免疫多肽由表2A所示的核^列 編碼或是表2B所示的氨基斷列。
優(yōu)選地，所述免疫多肽選自Im3、 Im4、 Im5和Im6。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子編碼包含至少兩種 免疫多肽的嵌合多肽，其中所述多肽為符合讀框的翻譯融合。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子編碼兩種結合類似大腸 菌素多肽的免疫多肽。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子編碼兩種結合不類 似的大腸菌素多肽的免疫多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述可切割的接頭包含至少一個蛋白 S^:感位點。優(yōu)選地，所述位點是煙草蝕紋病毒蛋白酶的切割位點。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供由本發(fā)明的核酸分子編碼的嵌合多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述嵌合多肽包括至少一個包含變體 M酸序列的部分。
變體多肽可以通過可以任何組合存在的一個或多個替代、添加、缺 失、截短而在氨基酸序列上不同。在優(yōu)選的變體中有那些通過保守氨基 酸替代而與參照多肽不同的。這些替代是用另 一個具有相似特性的氨基 酸替代給定氨基酸。下文的非限制性氨基酸名單被認為是保守替換(相似 的)a)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺 和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和纈氨 酸；以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最優(yōu)選的是保留或增強與參照 多肽相同的生物功能和活性的變體，所述變體是從該參照多肽變化而來 的。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述嵌合多肽序列與本文公開的多肽 具有40%或更高的序列同一性，且其保留與所述多肽相關的生物活性， 例如大腸菌素核酸酶活性或免疫蛋白活性。
本發(fā)明顯示所述嵌合多肽序列的部分與本文公開的多肽序列或其片 段或功能等價多肽具有至少75%的同一性。在一個實施方案中，所述多 肽與本文公開的氨基酸序列具有至少85%的同一性，優(yōu)選至少90%的同 一性，更優(yōu)選至少95%的同一性，甚至更優(yōu)選至少97%的同一性，最優(yōu)
選至少99%的同一性且其保留要求的生物活性。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供包含本發(fā)明的核酸分子或多肽的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供包含本發(fā)明的核酸分子的載體。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子與控制所述嵌合多肽的 表達的啟動子可操作地連接。
優(yōu)選地，所述核酸分子適應于真核表達。通常，所述適應包括，示 例但非限制，提供介導細胞/組織特異性表達的轉錄控制序列(啟動子序 列)。這些啟動子序列可以是細胞/組織特異性的、可誘導的或組成型的。 "啟動子，，是本領域公認的術語，為了清楚的目的，包括以下僅為 示例性的特征。增強子是經常在基因的轉錄起始位點的5'發(fā)現(xiàn)的順式作 用核酸序列(增強子還能夠在基因序列的3'發(fā)現(xiàn)，或者甚至存在于內含子 序列中)。增強子作用以提高與增強子連接的基因的轉錄率。增強子活性 是響應反式作用轉錄因子的，已經顯示反式作用轉錄因子特異結合增強 子元件。轉錄因子的結合/活性(請參見David S Latchman所著的Eukaryotic Transcription Factors (真核轉錄因子),Academic Press Ltd, San Diego)響應 許多生理/環(huán)境信號，其包括，示例但非限制，中間代謝物(例如葡萄糖)、 環(huán)境效應物(例如熱)。
啟動子元件還包括所稱的TATA盒和起選擇轉錄起始位點的RNA聚 合酶起始選擇序列。這些序列也結合多肽，該多肽起輔助RNA聚合酶選 擇轉錄起始的作用以及其它作用。
適應還包括提供選擇標志物和輔助在真核細胞或原核宿主中保持所 述載體的自主復制序列。自主保持的載體被稱為游離型載體。
列。這還包括提供內部核糖體進入位點(IRES)，其作用為最大化由載體編 碼的、以雙順反子或多順反子表達盒排列的基因的表達。
這些適應為本領域公知。有大量關于通常的表達載體構建和重組 DNA技術的出版文獻。請參見，Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY及其中的參考文獻；Marston， F (1987)
DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III (DNA克隆技術實 踐方法，第3巻)IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning (DNA克隆)F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)4戈分子生4勿學手 冊)，John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
載體可以是基于病毒的且可以衍生自包括腺病毒、逆轉錄病毒、腺 相關病毒、皰滲病毒、十曼病毒、牛痘病毒和4干狀病毒在內的病毒。 才艮據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供經本發(fā)明的核酸或載體轉染的細胞。 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述細胞是真核細胞。 優(yōu)選地，所述真核細胞是哺乳動物細胞。 在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述細胞是植物細胞。 在本發(fā)明的其它優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是酵母細胞。 在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述細胞是原核細胞。 根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供本發(fā)明的嵌合多肽在分離生物分子復 合物中的用途。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述生物分子復合物包括包含至少一 種蛋白的復合物。優(yōu)選地，所述復合物是蛋白分子的復合物。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供從多種生物分子中分離生物分子復合 物的方法，該方法包括提供包含多種生物分子的制劑和至少一種本發(fā)明
件下孵育所述制劑，以及分離與所述嵌合多肽相連的生物分子的復合物。 才艮據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供從多種生物分子中分離生物分子復合 物的方法，該方法包4舌
i) 提供包含多種生物分子的制劑和至少一種本發(fā)明嵌合多肽，并且 在允許所述制劑中的生物分子與所述嵌合多肽相連的條件下孵育所述制
劑；
ii) 將該混合物與包含所述嵌合多肽的結合伙伴的第 一親和基質接 觸以允許至少部分所述嵌合多肽與所述基質結合，并且洗滌所述基質以
除去與所述嵌合多肽和所述基質非特異結合的生物分子；
iii) 從所述基質洗脫結合的嵌合多肽和相連的生物分子；
iv) 將所述洗脫的嵌合多肽與包含所述嵌合多肽的第二結合伙伴的
第二親和基質接觸以允許所述嵌合多肽的不同部分與所述第二親和基質
結合；以及
v)從所述第二基質洗脫所述嵌合多肽并且任選地釋放與所述嵌合多 肽相連的所述生物分子。
對本領域技術人員來說顯而易見的是可以通過本領域公知的方法 完成嵌合多肽和相連的生物分子的洗脫，例如，通過pH、離子條件的改 變或者通過與諸如化學試劑或蛋白酶的試劑 一起孵育，該蛋白酶將結合 的嵌合多肽從基質上切割下來。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述制劑包含適于表達本發(fā)明的嵌合多肽 的細胞，所述細胞提供所述多種生物分子。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述復合物包含至少一種蛋白分子。優(yōu)選 地，所述復合物包含蛋白分子的復合物。
顯而易見的是本發(fā)明的方法可以適于從混合物中分離生物分子的復 合物。這些復合物可以是蛋白復合物或，例如，蛋白和核酸的混合物， 例如染色質。所述方法還可以用于從復合物混合物中分離細胞器或者甚 至完整細胞或細胞膜。所述復合物還可以形成于從細胞提取物形成的體 外轉錄和/或翻譯測定。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述第一親和基質包含結合其同源免疫多 肽的大腸菌素多肽。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選的方法中，所述第二親和基質包含與所述第一 親和基質的大腸菌素多肽不同的大腸菌素多肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，通過與蛋白酶一起孵育獲得所述洗脫，該 蛋白酶切割所述接頭以釋放與所述第 一基質結合的所述嵌合多肽。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選的方法中，所述嵌合多肽包括第二蛋白酶敏感 位點，對其的切割從所述第二親和基質釋放所述嵌合多肽。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選的方法中，所述大腸菌素選自E2、 E7、 E8和E9。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選的方法中，所述大腸菌素選自E3、 E4、 E5和E6。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供包含底物和與其相連的、交聯(lián)的或結
合的至少一種多肽的親和基質，該多肽由包含選自下列的核酸序列的核
酸分子編碼
i) 由圖5A或圖5B所示的核酸序列組成的核酸分子；
ii) 由與(i)中的核酸分子雜交且編碼具有核酸酶活性的多肽的核^ 列組成的核酸分子；
iii) 由于遺傳密碼的原因與上述(i)和(ii)定義的序列簡并的核酸分子。 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述核酸酶是大腸菌素DNA酶。 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述大腸菌素DNA酶選自E2、 E7、
E8和E9。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案中，所述核酸酶是RNA酶。 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述RNA酶選自E3、 E4、 E5和E6。 根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供將至少一種大腸菌素多肽與底物偶聯(lián) 的方法，其包括步驟
i) 提供包含大腸菌素多肽和基質材料的制劑；以及
ii) 提供使得所述大腸菌素能夠與所述底物相連、交聯(lián)或結合的條件。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述底物是親和基質材料。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供試劑盒，其包括本發(fā)明的核酸或載 體或本發(fā)明的多肽；切割本發(fā)明的所述嵌合多肽中的可切割接頭的試劑； 以及分離所述嵌合多肽所需的親和基質材料。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供包含與至少 一種異源多肽連接的大腸 菌素的嵌合融合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供編碼嵌合多肽的核酸分子，該核酸分 子包含
i) 第一部分，其由如圖5A或5B所示的、編碼至少一個多肽或其部 分的核酸序列組成，該多肽或其部分具有核酸酶活性；或者由變體核酸 分子組成，該變體核酸分子雜交如圖5A或5B所示的、編碼至少一種具 有核酸酶活性的多肽的核酸分子；以及
ii) 由編碼異源多肽的核酸序列組成的第二部分，其中所述第一和第 二部分相連接。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述嵌合多肽是具有降低的核酸酶活 性的變體多肽。優(yōu)選地，所述嵌合多肽是缺乏核酸酶活性的變體。
適用于包含免疫多肽的嵌合多肽的方面、實施方案、用途和方法等 同地適用于包含嵌合多肽的大腸菌素。
貫穿本說明書的描述和權利要求，詞語"包含"和"含有，，以及諸
如"包含(comprising)"和"包含(comprises)"的該詞語的變化指"包括 但不限于"，且不旨在(不)排除其它部分、添加物、組分、整體或步驟。
貫穿本說明書的描述和權利要求，除非上下文另行要求，則單數(shù)包 括復數(shù)，具體地，當使用不定冠詞時，本說明書應當被理解為涉及復數(shù) 以及單數(shù)，除非上下文另行要求。
在本發(fā)明特定方面、實施方案或實例中描述的特征、整體、特性、
實施方案或實例，除非與它們不相容。
參考以下附圖描述本發(fā)明的實施方案，該描述僅為示例性的
圖1是編碼DNA酶免疫蛋白Im9的核酸序列；
圖2是編碼RNA酶免疫蛋白Im3的核酸序列；
圖3是雙免疫蛋白標簽的示意圖，顯示dlmP79的基因構建，其中Im7 和lm9被融合且被切割接頭分開。trs:基于高度奸蟲傳播的TEV蛋白酶 的TEV蛋白酶識別序列；
圖4顯示在大腸菌素DNA酶(E9和E7)的存在下以及單獨時(最后一 條泳道)TEV蛋白酶切割dlmP79的16% SDS-PAGE。 & Imp79和單獨的 Imp79經受TEV蛋白酶切割；
圖5A是大腸菌素DNA酶結構域E9的核酸序列；圖5B是大腸菌素 RNA酶結構域E3的核酸序列；
圖6顯示使用Im9作為融合純化標簽的純化步驟的16%SDS-PAGE。 1: pNC3/BL21 DE3的未誘導細胞；2:誘導的、過表達的融合至34個殘 基的肽序列(Im9Gol)的Im9; 3&4:分別為細胞破碎后的沉淀和上清液。 將上清液(泳道4)上樣到連接有E9 DNA酶的sepharose 4B柱上；5:上樣 期間流出柱的流出液；6&7:柱的高鹽洗出液；8:經洗脫和透析的蛋白 Im9Go1。 *，表示融合蛋白的降解產物；
表1A (M酸)和IB (DNA)圖示說明DNA酶家族的免疫蛋白的比 對，基于Im9蛋白顯示高于40%的序列同一性。顯示每一亞家族的代表 性蛋白，例如OrfUl代表具有至少94%序列同一性的OrfUl蛋白的家族。 使用的程序是BLAST (在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和ClustalW (在http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi畫bin/align clustalw.pl);
表2A (氨基酸)和2B (DNA)圖示說明來自RNA酶免疫家族的蛋白的 比對，基于Im3蛋白顯示高于40%的序列同一性。此家族還包括來自熒 光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的蛋白(比對未顯示)， (http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/align clustalw.pl);
表3A (氨基酸)和3B (DNA)圖示說明DNA酶家族的比對，基于E9 DNA酶蛋白顯示高于40%的序列同一性。顯示每一亞家族的代表性蛋白， 例如Uro—Ecoli代表具有至少78%序列同一性的致腎盂腎炎特異性蛋白的 家族。使用的程序是BLAST (在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和 ClustalW (在http:〃npsa畫pbil.ibcp.fr/cgi-bin/align clustalw.pl); 以及
表4A (氨基酸)和4B (DNA)圖示說明基于與E3 RNA酶的同源性的 RNA酶比對，其中根據(jù)具有高于40%同源性來鑒定蛋白。顯示每一亞家 族的代表性蛋白，例如來自熒光假單胞菌的蛋白是該家族的典型。使用 的程序是BLAST (在http:〃w麗.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和ClustalW (在 http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi畫bin/align clustalw.pl)。
材料和方法
構建雙免n因和變體
質粒pRJ347 & pRJ345 (分別編碼z'mm7 & /mm9基因)被用作模板。雙 標簽的5'基因被工程化為包括符合基因讀框的M/el和5amM限制性位 點。3'基因被設計為包括位于終止密碼子后的Wal和I限制性位點。 設計引物以擴增基因，包括突出端以編碼基于HAT TEV蛋白酶的中心 TEV蛋白酶識別序列。構建體的5'基因的終止密碼子被除去，使得能夠 直接連讀。最初兩輪PCR產物被用在后面的PCR中，其中兩種產物均被 用來彼此退火。純化最終PCR產物并克隆至Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen)中，并用來轉化五.co/Z TOP 10感受態(tài)細月包
(Invitrogen)。 PCR菌落篩選鑒定了具有正確長度的基因片段。擴增這些 菌落并純化質粒(Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit)。 DNA測序證實了序 列。為進一步減弱第二標簽與E9 DNA酶樹脂的任何可能的相互作用， 使用全質粒定點位點突變按照制造商的說明(Stratagene， Pfii Turbo DNA 聚合酶)構建標簽的Im7變體(D52A, Im7編號)。通過此方法構建的基因 包括dlmP97 (!>ww9-trs-z>wm7)、 dlmP97a、 dlmp79和dlmP7a9。下文顯示 基因構建的示意。
純化和測定dlmP標簽
通過使用A^/el、 fcoi I將基因從克隆載體中切出，連接到類似地限 制的pET22b (Novagen)中并轉化感受態(tài)五.co/z' BL21 DE3，來測定dlmP 標簽的體外存活性。通過菌落PCR篩選鑒別含有插入物的載體，并將這 些質粒命名為pIMP79、 pIMP7a9、 pIMP97和pIMP97a。在蛋白純化前進 行蛋白表達的試-瞼。dlmP蛋白產生在于37 。C下培養(yǎng)在LB-amp (100/ig/ml) 中且在對數(shù)生長期間用lmMIPTG誘導的五.co/z'中。收集細胞，聲波處 理并就免疫蛋白來說基本純化(Wallis et al., 1992)。純化的蛋白被透析至 20mMTEA， pH 7.5中，急速冷凍并保存在-20。C。
在同源DNA酶結構域的存在或不存在下TEV蛋白酶切割dlmP
對E9-Imp79、 E7-Imp79 & Imp79進行蛋白酶切割以評估與同源DNA 酶組成復合體中的dlmP的切割。在30 。C下，在緩沖液(50 mM Tris-HCl， pH7.5, 100 mM NaCl)中，將約40 /xg的Imp79 (在與E7 DNA酶結構域組 成的復合體中、在與E9 DNA酶結構域組成的復合體中或單獨)與20 U的 TEV蛋白酶一起孵育1小時40分鐘。
交聯(lián)E-DNA酶與瓊脂糖
按照制造商指南將純化的E9和E7 DNA酶結構域(Garinot-Schneider et al., 1996)交聯(lián)至CNBr活化的Sepharose 4B珠(Amersham Biosciences)。 也以類似方式將Im9交聯(lián)至樹脂。 去污劑存在下的復合物
作為在去污劑存在下復合物形成的試驗，在去污劑中
(j3-octylglucoside高至1% w/v; Triton X100高至1% v/v)進行了 E9 DNA 酶-Im9和E3 RNA酶-Im3復合物，并通過大小排阻層析分析了復合物 形成。去污劑不破壞核酸酶結構域與其免疫蛋白的復合物化。這些實驗 顯示復合物不凈皮加入的去污劑破壞，并且當在復合物形成之前加入去污 劑時也形成復合物。對于E9DNA酶交聯(lián)的瓊脂糖使用去污劑NP40的緩 沖液溶液(高至0.5% v/v)并加入dlmP蛋白標簽。在去污劑的存在下，該 標簽依然與樹脂結合。
免疫蛋白作為多肽的純化融合標簽
工程化/mm9基因以延伸其序列以包括TEV蛋白酶識別位點C末端。 設計基因構建體以包括用于將靶蛋白3，克隆至該蛋白酶位點的限制位 點。試驗系統(tǒng)是Im9Go1融合蛋白，其中Gol是噬菌體排除系統(tǒng)的35個 氨基酸的多肽共活化物。限制位點是(5，-3，)
M/eI(>/ww9)(trs)^oIi/z> fflI(go/)^"wM。將該基因構建體連接至pETllc 和pET15b載體(Novagen)。使用陰離子交換層析或E9 DNA酶交聯(lián)的樹 脂進行*達產物的純化。
權利要求
1.包含與至少一種異源多肽連接的免疫多肽的嵌合融合蛋白。
2. 根據(jù)權利要求1所述的蛋白，其中所述免疫多肽通過接頭分子 與所述異源多肽連接。
3. 根據(jù)權利要求2所述的蛋白，其中所述接頭包含可切割的肽接頭。
4. 編碼嵌合多肽的核酸分子，所述核酸分子包含i) 第一部分，其由圖l或圖2所示的、編碼至少一種多肽或其活性 結合部分的核酸序列組成，該多肽或其活性結合部分具有免疫蛋白相關 活性；或者其由變體核酸分子組成，該變體核酸分子雜交圖1A或圖1B 所示的、編碼具有免疫多肽相關活性的多肽的核酸分子；以及ii) 第二部分，其由編碼異源多肽的核酸序列組成，其中所述第一和 第二部分相連接。
5. 根據(jù)權利要求4所述的核酸分子，其中所述第一和第二核酸分 子通過接頭分子連接。
6. 根據(jù)權利要求5所述的核酸分子，其中所述接頭編碼可切割的 肽接頭。
7. 根據(jù)權利要求4-6中任一權利要求所述的核酸分子，其中所述 第一部分包含由編碼至少一種大腸菌素DNA酶免疫多肽的核酸序列 組成的核酸分子。
8. 根據(jù)權利要求7所述的核酸分子，其中所述免疫多肽選自Im2、 Im7、 Im8和Im9。
9. 根據(jù)權利要求4-6中任一權利要求所述的核酸分子，其中所述 第一部分包含由編碼至少一種大腸菌素RNA酶免疫多肽的核酸序列 組成的核酸分子。
10. 根據(jù)權利要求9所述的核酸分子，其中所述免疫多肽選自 Im3、 Im4、 Im5和Im6。
11. 根據(jù)權利要求4-10中任一權利要求所述的的核酸分子，其編 碼包含至少兩種免疫多肽的嵌合多肽，其中所述多肽為符合讀框的翻 譯融合。
12. 根據(jù)權利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼兩 種結合類似大腸菌素多肽的免疫多肽。
13. 根據(jù)權利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼兩 種結合不類似的大腸菌素多肽的免疫多肽。
14. 根據(jù)權利要求6-13中任一權利要求所述的核酸分子，其中所 述可切割的接頭包含至少一個蛋白酶敏感位點。
15. 才艮據(jù);f又利要求14所述的核酸，其中所述位點是煙草蝕紋病毒 蛋白酶的切割位點。
16. 權利要求4-15中任一權利要求所述的核酸分子編碼的嵌合多肽。
17. 包含權利要求1-16中任一權利要求所述的核酸分子或多肽的 組合物。
18. 包含權利要求4-15中任一權利要求所述的核酸分子的載體。
19. 經權利要求4-15中任一權利要求或權利要求18所述的核酸 或載體轉染的細胞。
20. 根據(jù)權利要求19所述的細胞，其中所述細胞是真核細胞。
21. 根據(jù)權利要求20所述的細胞，其中所述真核細胞是哺乳動物 細胞。
22. 根據(jù)權利要求20所述的細胞，其中所述細胞是植物細胞。
23. 根據(jù)權利要求20所述的細胞，其中所迷細胞是酵母細胞。
24. 根據(jù)權利要求19所述的細胞，其中所述細胞是原核細胞。
25. 權利要求1-3中任一權利要求或權利要求16所述的嵌合多肽 在分離生物分子復合物中的用途。
26. 根據(jù)權利要求25所述的用途，其中所述生物分子復合物包含 至少一種蛋白的復合物。
27. 根據(jù)權利要求26所述的用途，其中所述復合物是蛋白分子的 復合物。
28. 從多種生物分子中分離生物分子復合物的方法，包括提供 包含多種生物分子的制劑和至少一種權利要求1-3中任一權利要求或 權利要求16所述的嵌合多肽，以及在允許所述制劑中的生物分子與所 述嵌合多肽相連的條件下孵育所述制劑，以及分離與所述嵌合多肽相 連的生物分子復合物。
29. 從多種生物分子中分離生物分子復合物的方法，包括步驟i) 提供包含多種生物分子的制劑和至少一種權利要求1-3中任一 權利要求或權利要求16所述的嵌合多肽，并且在允許所述制劑中的生 物分子與所述嵌合多肽相連的條件下孵育所述制劑；ii) 將所述混合物與包含所述嵌合多肽的結合伙伴的第 一親和基質 接觸以允許至少部分所述嵌合多肽與所述基質結合，并且洗滌所述基質 以除去與所述嵌合多肽和所述基質非特異結合的生物分子；iii) 從所述基質洗脫結合的嵌合多肽和相連的生物分子；iv) 將所述洗脫的嵌合多肽與包含所述嵌合多肽的第二結合伙伴的 第二親合基質接觸以允許所述嵌合多肽的不同部分與所述第二親和基質 結合；以及v) 從所述第二基質洗脫所述嵌合多肽并且任選地釋放與所述嵌合 多肽相連的所述生物分子。
30. 根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述制劑包含適于表達所 述嵌合多肽的細胞。
31. 根據(jù)權利要求29或30所述的方法，其中所述復合物包含至 少一種蛋白分子。
32. 根據(jù)權利要求31所述的方法，其中所述復合物包含蛋白分子 的復合物。
33. 根據(jù)權利要求29-32中任一權利要求所述的方法，其中所述 第一親和基質包含結合其同源免疫多肽的大腸菌素多肽。
34. 根據(jù)權利要求29-32中任一權利要求所述的方法，其中所述 第二親和基質包含與所述第一親和基質的大腸菌素多肽不同的大腸菌素多肽。
35. 根據(jù)權利要求29-34中任一權利要求所述的方法，其中通過與 蛋白酶一起孵育獲得所述洗脫，所述蛋白酶切割所述接頭以釋放與所述 第 一基質結合的所述嵌合多肽。
36. 根據(jù)權利要求29-35中任一權利要求所述的方法，其中所述嵌 合多肽包括第二蛋白,感位點，對其的切割從所述第二親和基質釋放 所述嵌合多肽。
37. 根據(jù)權利要求33-36中任一權利要求所述的方法，其中所述大 腸菌素多肽選自E2、 E7、 E8和E9。
38. 根據(jù)權利要求33-36中任一權利要求所述的方法，其中所述大 腸菌素多肽選自E3、 E4、 E5和E6。
39. 包含底物和與其相連的、交聯(lián)的或偶聯(lián)的至少一種多肽的親和 基質，所述多肽由包含選自下列的核酸序列的核酸分子編碼i) 由圖5A或圖5B所示的核酸序列組成的核酸分子；ii) 由與(i)中的核酸分子雜交且編碼具有核酸酶活性的多肽的核^ 列組成的核酸分子；iii) 由于遺傳密碼的原因與上述(i)和(ii)定義的序列簡并的核酸分子。
40. 根據(jù)權利要求39所述的基質，其中所述核酸酶是大腸菌素 DNA酶多肽。
41. 根據(jù)權利要求40所述的基質，其中所述大腸菌素DNA酶多肽 選自E2、 E7、 E8和E9。
42. 根據(jù)權利要求39所述的基質，其中所述核酸酶是大腸菌素 RNA酶多肽。
43. 根據(jù)權利要求42所述的基質，其中所述RNA酶多肽選自E3、 E4、 E5和E6。
44. 將至少一種大腸菌素多肽與底物偶聯(lián)的方法，所述方法包括步驟ii) 提供包含大腸菌素多肽和基質材料的制劑；以及iii) 提供使得所述大腸菌素能夠與所述底物相連、交聯(lián)或結合的條件。
45. 根據(jù)權利要求44所述的方法，其中所述底物是親和基質材料。
46. 試劑盒，其包括權利要求4-15中任一權利要求或權利要求 18所述的核酸或載體或權利要求1-3中任一權利要求或權利要求17所 述的多肽；切割所述嵌合多肽中的可切割接頭的試劑；以及分離所述嵌 合多肽所需的親和基質材料。
全文摘要
我們描述包含細菌免疫多肽的融合蛋白及其在蛋白復合物的親和純化中的用途。
文檔編號C07K1/22GK101180309SQ200680017355
公開日2008年5月14日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權日2005年3月17日
發(fā)明者科林·克萊安杜斯, 西奧內·喬治烏 申請人:約克大學