專利名稱：格列美脲和胰島素誘導(dǎo)的糖基磷脂酰肌醇－特異的磷脂酶c調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物GPI-PLC(糖基磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C)活性的不同方法。
對(duì)哺乳動(dòng)物質(zhì)膜GPI-PLC特異的抑制劑GPI2350的合成是基于關(guān)于細(xì)菌和錐蟲(G)PI-PLC的(晶體)結(jié)構(gòu)、底物要求、GPI識(shí)別和切割機(jī)制以及迄今對(duì)它們描述的抑制劑的背景知識(shí)。對(duì)于錐蟲GPI-PLC，GPI和PI分別是有效的和效力很差的底物，而對(duì)于細(xì)菌PI-PLC卻剛好相反。細(xì)菌PI-PLC具有與80個(gè)殘基的錐蟲GPI-PLC相似的蛋白質(zhì)序列區(qū)(“Kuppe等人(1989)J.Bacteriol.1716077-6083”)。為了分析GPI識(shí)別，最近已經(jīng)測(cè)定了來自蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC與葡糖胺(glucosaminyl)(α1→6)-肌醇(GMI)的絡(luò)合物在2.2分辨率下的三維結(jié)構(gòu)并且揭示GMI的肌醇部分占據(jù)與游離肌醇相同的位置，而葡糖胺部分在催化部位入口處暴露于溶劑(“Heinz等人，(1995)EMBO J.143855-3863”，和“Heinz等人，(1996)Biochemistry 359496-9504)。核心四糖的剩余部分幾乎不與PI-PLC接觸，這可以解釋所接受的GPI錨內(nèi)核心聚糖的顯著的結(jié)構(gòu)多樣性。總之，當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明細(xì)菌PI-PLC對(duì)PI和GPI切割的催化機(jī)理和錐蟲GPI-PLC對(duì)GPI切割的催化機(jī)理都是相似的。然而，考慮到哺乳動(dòng)物PI-PLC不能產(chǎn)生第二信使肌醇-三磷酸來接受GPI錨和細(xì)菌PI-PLC不能切割磷酸化的PI，不知道脂肪細(xì)胞質(zhì)膜GPI-PLC是否也具有相似的催化機(jī)制。
以前用PI類似物和GMI衍生物已經(jīng)檢查了細(xì)菌和錐蟲(G)PI-PLC的底物要求。催化需要在肌醇2位上的自由OH基。在用來自布魯斯錐蟲(T.bruei)的含有肉豆蔻酸的VSG進(jìn)行的研究中，通過GMI的2-脫氧-肌醇類似物競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷(G)PI-PLC，表明肌醇-2-OH盡管是催化所需的，但是對(duì)于底物識(shí)別不是必要的。此外，底物識(shí)別需要在肌醇-1位的帶電的磷?；?即，膦酸酯或者磷酸二酯)(“Morris，J.C.，等人，(1996)J.Biol.Chem.27115468-15477”)。從而，肌醇-1位和肌醇-2位的OH基都參與催化，然而僅僅磷?；坪跏堑孜镒R(shí)別所需的。有趣的是，葡糖胺(α1→6)-肌醇-1，2-環(huán)磷酸原來對(duì)于錐蟲GPI-PLC是比GMI-1-磷酸更好的抑制劑，而對(duì)于細(xì)菌PI-PLC卻不是這樣的，表明環(huán)狀形式可以作為前者的產(chǎn)物類似物。此外，發(fā)現(xiàn)GMI-1-磷酸的膦酸衍生物是更有效的抑制劑，這最可能是因?yàn)樗鼈兪欠乔懈畹牡孜镱愃莆?。這些數(shù)據(jù)滿足對(duì)細(xì)菌PI-PLC作用所提出的兩步機(jī)制，其中PI首先被切割而產(chǎn)生環(huán)狀肌醇-1，2-磷酸(cIP)結(jié)構(gòu)，其然后水解成肌醇-1-磷酸。有趣的是，cIP結(jié)構(gòu)當(dāng)暴露于來自布魯斯錐蟲的GPI-PLC時(shí)，可以在免疫學(xué)上鑒定為所稱作的錐蟲VSG中的交叉反應(yīng)決定簇，表明在錐蟲GPI-PLC催化期間第一個(gè)步驟(環(huán)化)而不是第二個(gè)步驟(去環(huán)化)在運(yùn)行。暫時(shí)或者穩(wěn)定cIP形成的需要與如下發(fā)現(xiàn)相一致它們的肌醇?xì)埢?-或者2-位被棕櫚?；腉PI錨，如人紅細(xì)胞AChE的GPI錨抗磷脂酶切割。
發(fā)現(xiàn)對(duì)于錐蟲的GPI-PLC，GMI-1-十二烷基膦酸酯比對(duì)應(yīng)的己基衍生物更具抑制性，錐蟲的GPI-PLC也是膜結(jié)合的(“Morris，J.C.等人(1995)J.Biol.Chem.2702517-2524”)。有趣的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌醇上缺少糖類取代基(例如，葡糖胺)時(shí)，肌醇-1-磷酸的非切割的類似物，如肌醇-1-O-十二烷基磷酸酯抑制錐蟲GPI-PLC。當(dāng)用2-氟取代取代2-脫氧-肌醇-1-O-十二烷基膦酸酯的2-位時(shí)，該類型的抑制劑的效力顯著增加，所述2-氟取代物競(jìng)爭(zhēng)性抑制錐蟲GPI-PLC，IC50為10-90μM(“Morris，J.C.等人，(1996)J.Biol.Chem.27115468-15477”)。迄今報(bào)導(dǎo)的GPI-PLC的最有效的抑制劑在2-脫氧肌醇的2-位有氟基，在1-位有十二烷基-膦酸，該抑制劑比肌醇-1-O-十二烷基膦酸的抑制能力強(qiáng)至少5倍(Morris，J.C.等人(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.244873-867”)。有趣的是，這些化合物的一些對(duì)來自蠟狀芽孢桿菌和布魯斯錐蟲的(G)PI-PLC的差別抑制證明這兩種酶代表(G)PI-PLC的機(jī)械子類。
不幸地，還沒有從哺乳動(dòng)物GPI-PLC得到類似數(shù)據(jù)。令人驚奇地，新合成的肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基膦酸(GPI-2350)結(jié)果是細(xì)菌以及脂肪細(xì)胞GPI-PLC的有效抑制劑。
細(xì)菌磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)從膜雙層釋放堿性磷酸酶(aP)，這一初步觀察導(dǎo)致鑒定了涉及共價(jià)偶聯(lián)糖基磷脂酰肌醇(GPI)脂類的蛋白質(zhì)的另一類型的膜附著。
對(duì)來自布魯斯錐蟲(Trypanosome brucei)的表面糖蛋白變體(VSG)首次闡明了GPI錨的完整結(jié)構(gòu)。
核心四糖由三個(gè)甘露糖殘基和非乙?；钠咸前方M成，一端為通過磷酸乙醇胺橋連接到蛋白質(zhì)部分的酰胺，另一端通過糖苷鍵連接到磷脂酰肌醇(PI)的6-羥基。PI由特異性C和D的(G)PI-特異的磷脂酶([G]PI-PLC/D)切割，分別釋放二酰基甘油和磷脂酸，在蛋白質(zhì)部分剩下末端(磷酸)肌醇聚糖(PIG)結(jié)構(gòu)。
自那以后，多種來源的細(xì)菌PI-PLC已經(jīng)常用于檢測(cè)GPI-錨定的蛋白質(zhì)(GPI-蛋白質(zhì))。
認(rèn)為布魯斯錐蟲需要GPI-PLC對(duì)由GPI-錨定的VSG組成的保護(hù)性表面外殼的脂解釋放以實(shí)現(xiàn)抗原性變異來逃避宿主的免疫系統(tǒng)。
因?yàn)槎鄶?shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織表達(dá)GPI-蛋白質(zhì)，它們的多數(shù)將它們的GPI錨包埋在質(zhì)膜的外部小葉中，內(nèi)源性(G)PI/PI-PLC/D可以控制它們細(xì)胞表面表達(dá)的特異下調(diào)和同時(shí)增加循環(huán)中可溶性蛋白質(zhì)部分。
已經(jīng)檢測(cè)到GPI蛋白質(zhì)的可溶形式在血流中循環(huán)，這些可溶形式為例如5-核苷酸酶(5’-Nuc)、Thy-1、堿性磷酸酶(aP)、和CD16受體。還可以在人嗜中性粒細(xì)胞、牛腦、大鼠腸和人癌細(xì)胞系中鑒定GPI-PLC。來自大鼠肝臟的GPI-PLC已經(jīng)純化均勻。已經(jīng)描述了一種內(nèi)源性GPI-PLC，其能夠從豬最大小管(maximal tubule)釋放腎二肽酶。
然而，仍然沒有闡明GPI-PLC的結(jié)構(gòu)或者基因。
而哺乳動(dòng)物GPI-PLC是膜結(jié)合的，可以從不同物種(人、大鼠、牛)的所有類型的組織材料以及器官(胎盤、腦、肝、血清)回收哺乳動(dòng)物GPI-PLD。
GPI-PLD的主要角色可能是內(nèi)吞后降解GPI蛋白質(zhì)的GPI錨和運(yùn)輸?shù)饺苊阁w。
哺乳動(dòng)物組織含有兩種不同的GPI-PLD，它們?cè)谘搴图?xì)胞表面有活性，具有不同的功能性。
一些GPI蛋白質(zhì)，如酵母和嚙齒動(dòng)物脂肪細(xì)胞中的5’-Nuc和aP，當(dāng)它們的GPI錨被GPI-PLC在體外或者體內(nèi)脂解切割時(shí)，似乎不從細(xì)胞表面以可溶形式釋放。
分離顆粒級(jí)分/細(xì)胞后，需要額外的溫和鹽和/或胰蛋白酶切割來回收可溶性級(jí)分/介質(zhì)中某些脂解切割的GPI-蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)級(jí)分，表明存在受體蛋白質(zhì)。
在這些情況中，GPI-PLC的活性不影響GPI蛋白質(zhì)的定位或者拓?fù)鋵W(xué)，但是在它們從兩親性向親水形式轉(zhuǎn)化的過程中修飾功能(催化/結(jié)合)特征。完整GPI錨的存在影響附著到它的蛋白質(zhì)級(jí)分的構(gòu)象和行為。
對(duì)于5’-Nuc和Gce1，當(dāng)與包埋在膜或者重建成去污劑微團(tuán)或者脂質(zhì)體的完整形式比較時(shí)，在脂解切割的GPI-蛋白質(zhì)中催化和結(jié)合效率增加。
真核生物中的許多GPI-PL受到營(yíng)養(yǎng)信號(hào)的上調(diào)，例如，在酵母中受到葡萄糖的上調(diào)，其中GPI蛋白質(zhì)的脂解加工似乎在細(xì)胞壁的生物發(fā)生中起作用，并且在嚙齒動(dòng)物脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞中受到葡萄糖以及某些激素、生長(zhǎng)因子和藥物(例如，胰島素、格列美脲)的上調(diào)。
格列美脲是一種抗糖尿病藥物，其主要通過刺激胰島素從胰細(xì)胞的釋放降低血糖，而且但是在較小程度上通過模擬外周組織中代謝的胰島素作用，如活化肌細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制脂肪細(xì)胞中的脂解作用來降低血糖。
磺脲類格列美脲的血糖降低效果部分是通過經(jīng)由IRS-PI3K途徑的胰島素受體獨(dú)立的活化刺激脂肪和肌細(xì)胞中非氧化性葡萄糖代謝來引起的。在分離的大鼠脂肪細(xì)胞中，已經(jīng)闡明格列美脲作用的分子機(jī)理涉及脂類膜筏(raft)結(jié)合的信號(hào)傳遞組分，如?；姆鞘荏w酪氨酸激酶pp59Lyn和一些GPI蛋白質(zhì)的重新分布和相伴的活化，以及質(zhì)膜糖基磷脂酰肌醇-特異的GPI-PLC的刺激，其也由胰島素適度活化。
格列美脲是磺脲類活性劑，其刺激胰島素從胰腺β細(xì)胞釋放并且可以通過胰腺外機(jī)制發(fā)揮作用。將它每天一次施用于患有2型(非胰島素依賴型)糖尿病的患者(在該患者中糖血(glycaemia)不是僅受到飲食和鍛煉的控制)，并且可以與胰島素組合用于二次磺脲類失敗(secondary sulphonylureafailure)的患者。
格列美脲的最大降血糖效果發(fā)生在劑量后前4小時(shí)內(nèi)。格列美脲對(duì)心血管變量的影響比格列本脲(優(yōu)降糖)的更少并且更小。在年老患者或者腎臟或者肝臟疾病患者中藥物動(dòng)力學(xué)基本不變。已經(jīng)記載了格列美脲的很少的藥物相互作用。
在2型糖尿病患者中，格列美脲具有0.5到8mg/天的有效劑量范圍，盡管在4和8mg/天劑量之間有很小的功效差異。在1年的研究中，格列美脲與格列本脲和格列吡嗪的功效相似。然而，在前幾周的治療中，格列美脲似乎比格列吡嗪更快地降低血糖。在14周的研究中在基線時(shí)具有良好的糖血控制的患者中比較了格列美脲和格列齊特，發(fā)現(xiàn)它們的效果之間沒有差異。格列美脲加上胰島素在幫助具有二次磺脲類失敗的患者達(dá)到≤7.8mmol/L的禁食血糖目標(biāo)水平中與胰島素加上安慰劑一樣有效，盡管用格列美脲看到了較低的胰島素劑量和對(duì)糖血的更快的作用。
盡管格列美脲單一療法通常是良好耐受的，但是在治療≤1年的10-20％患者和接受6個(gè)月的伴隨葡萄糖的≤50％的患者中發(fā)生低血糖。合并的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示格列美脲可能比格列本脲具有更低的低血糖發(fā)生率，尤其在前1個(gè)月治療中。劑量通常以1mg/天開始，以1到2周的間隔對(duì)糖血控制逐步增加劑量到1到4mg/天的常規(guī)劑量范圍(在英國(guó)最大6mg/天，或者在美國(guó)最大8mg/天)。
格列美脲主要通過刺激胰島素從胰腺β細(xì)胞的釋放并且在較小程度上通過模擬外周組織中代謝的胰島素作用，如活化肌細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制脂肪細(xì)胞中的脂解作用來降低葡萄糖。
已經(jīng)證明當(dāng)用藥理學(xué)濃度的格列美脲處理原代或者培養(yǎng)的嚙齒動(dòng)物脂肪細(xì)胞時(shí)，格列美脲通過活化GPI-PLC而有效誘導(dǎo)一小組GPI-蛋白質(zhì)，如5’-Nuc、aP和Gce1的兩親性向親水性的轉(zhuǎn)化。
肌醇衍生物GPI-2350在本發(fā)明中首次公開，它以高效力(IC50＝0.2-10μM)和選擇性抑制細(xì)菌、錐蟲和血清GPI-PLC和GPI-PLD。GPI-2350幾乎完全下調(diào)完整大鼠脂肪細(xì)胞中的GPI-PLC。而GPI-PLC在代謝胰島素信號(hào)傳遞中不起作用，GPI-PLC的活化對(duì)于格列美脲的胰島素模擬效應(yīng)是必不可少的，通過從富含去污劑不溶性糖脂的脂類膜筏結(jié)構(gòu)域(DIG)到胰島素受體底物-1(IRS-1)的胰島素受體獨(dú)立的串話產(chǎn)生格列美脲的所述胰島素模擬效應(yīng)。
DIG在許多終末分化細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞的質(zhì)膜中大量表達(dá)，是特別的膜微型結(jié)構(gòu)域，其作為膜介導(dǎo)的生物學(xué)過程的平臺(tái)，所述生物學(xué)過程包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)輸和蛋白質(zhì)與脂類的分選。
它們?cè)谕赓|(zhì)小葉(exoplasmic leaflet)中富含膽固醇和(糖)鞘脂類并且在內(nèi)部小葉中富含具有飽和?；湹牧字湍懝檀?，在雙層內(nèi)形成脂類有序相。DIG的特征是在冷的1％ Triton X-100中不溶和當(dāng)進(jìn)行蔗糖梯度離心時(shí)具有低的浮力密度?；谶@些標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些GPI-錨定的、酰化的和跨膜信號(hào)蛋白在質(zhì)膜的DIG對(duì)非DIG區(qū)域中富集。此外，具有較高膽固醇含量的DIG(hcDIG)和較低膽固醇含量的DIG(IcDIG)可以基于它們的較低和較高浮力密度相互區(qū)別。
某些GPI-錨定以及?；男盘?hào)蛋白自hcDIG向IcDIG的依賴刺激的重新分布受到GPI-2350的阻斷。
GPI-2350通過脂類膜筏-相關(guān)的GPI-PLC減小GPI-蛋白質(zhì)，如Gce1和5’-Nuc從完整大鼠脂肪細(xì)胞的基礎(chǔ)脂解釋放和格列美脲/胰島素誘導(dǎo)的脂解釋放(IC50＝5-10μM)。GPI-2350(50μM)對(duì)GPI-PLC的抑制導(dǎo)致幾乎完全阻斷(i)pp59Lyn和Gce1從小窩蛋白的解離，(ii)它們從hcDIG向IcDIG的重新分布，(iii)pp59Lyn和IRS-1的酪氨酸磷酸化，(iv)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激和(v)響應(yīng)格列美脲的脂解作用的抑制。
GPI-PLC的胰島素活化對(duì)脂類膜筏分布具有適度影響，并且它在代謝的胰島素信號(hào)傳遞中的較小作用(如果存在)僅在GPI-2350的存在下闡明，因?yàn)樗?例如，IRS-1的酪氨酸磷酸化和脂解作用的抑制)僅僅受到微小地減小。
格列美脲誘導(dǎo)的GPI-PLC產(chǎn)生的脂解切割的GPI-蛋白質(zhì)保持與hcDIG結(jié)合而不是像它們的未切割的兩親性形式以及pp59Lyn那樣重新分布到IcDIG中。
在大鼠脂肪細(xì)胞中，通過重新分布和活化的pp59Lyn經(jīng)過IRS酪氨酸磷酸化引起格列美脲與胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)的串話需要hcDIG-相關(guān)的GPI-PLC的活化。
本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物GPI-PLC的活性的化合物的方法，其中a]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞與格列美脲溫育；b]制備a]的細(xì)胞的hcDIG；c]將來自b]的hcDIG與化合物溫育；d]測(cè)定來自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
根據(jù)該方法的步驟a]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞屬于嚙齒動(dòng)物或者狗的細(xì)胞。嚙齒動(dòng)物是例如，小鼠、大鼠或者豚鼠。該方法還涉及人的細(xì)胞，或者類人猿，例如，黑猩猩、大猩猩或者狒狒。此類細(xì)胞為例如，胰細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。還可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞的獲取、graving、收獲和加工，使用常規(guī)技術(shù)(例如，Current Protocols in Cell Biology；John Wiley&Sons；0-471-24108-3-Loseleaf；0-471-24105-9-CD-ROM)。
來自根據(jù)本發(fā)明方法的步驟c]的hcDIG的GPI-PLC的活性的測(cè)定通過測(cè)量pp59Lyn從hcDIG的解離，或者通過測(cè)量pp59Lyn和/或Gce1從hcDIG向IcDIG的重新分布，或者通過測(cè)量pp59Lyn和/或IRS-1的磷酸化的改變，或者通過測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激和/或脂解作用的抑制來進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及可以通過前面公開的本發(fā)明方法鑒定的化合物。此類化合物為例如，本發(fā)明公開的式I的化合物或者其衍生物。
本發(fā)明還涉及處于所有立體異構(gòu)形式的式I化合物 其中R1、R2、R3和R4相互獨(dú)立地為OH或F并且R5為(C1-C20)-烷基或者(C2-C20)-烯基，和其所有比例的混合物，和它的生理學(xué)上可耐受的鹽。
本發(fā)明還涉及如前面提到的式I化合物，其中R1、R2、R3和/或R4的任意兩個(gè)相互獨(dú)立地為F。
本發(fā)明還涉及如前面提到的式I化合物，其中R1、R2、R3和R4在每種情況中為OH。
本發(fā)明還涉及如前面提到的式I化合物，其中R5為C12-烷基。
本發(fā)明的此類化合物具有例如下面的通式，包括其所有立體異構(gòu)形式 或者本發(fā)明的此類化合物具有例如下面的通式
本發(fā)明的此類化合物可以例如命名為肌醇-1，2-環(huán)十二烷基膦酸，包括其所有立體異構(gòu)形式。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(C1-C20)-烷基將涉及所有立體異構(gòu)構(gòu)型(conformation)的直鏈或者支鏈的下列基團(tuán)甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(C2-C20)-烯基將包括所有立體異構(gòu)構(gòu)型(conformation)的直鏈或者支鏈的下列基團(tuán)乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基。
本發(fā)明還涉及制備肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基-膦酸的方法，其包括a]磷酸化外消旋的1，4，5，6-四-O-芐基-肌醇得到四-O-芐基-肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基-膦酸。
b]四-O-芐基-肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基膦酸的催化氫化。
所述制備方法可以應(yīng)用于通過使用包含如上述的R1、R2、R3、R4和/或R5的適宜的原料制備本發(fā)明的任意其他化合物。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含至少一種式I的化合物和/或其生理學(xué)上可耐受的鹽和/或其前體藥物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及式I化合物和其生理學(xué)上可耐受的鹽和/或其前體藥物的用途，用于改變用于治療糖尿病的藥物的副作用。這種藥物為例如格列美脲。副作用為例如，格列美脲的錯(cuò)誤劑量導(dǎo)致的低血糖。
本發(fā)明還涉及式I化合物的用途，用于生產(chǎn)處理用于治療糖尿病的藥物(例如，格列美脲)的副作用的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及鑒定調(diào)節(jié)格列美脲活性的化合物的方法，其中a]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞與格列美脲和化合物的混合物溫育；b]制備a]的細(xì)胞的hcDIG；c]測(cè)定來自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
本發(fā)明上下文中的化合物將表示任意有機(jī)和/或含碳化合物，其通過化學(xué)合成產(chǎn)生或者從天然來源分離并且具有50到50000道爾頓的分子量。格列美脲活性的調(diào)節(jié)將表示該活性受到刺激，或者抑制或者保持，即保持活性在某一水平上。
在鑒定調(diào)節(jié)格列美脲活性的化合物的方法的步驟a]中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞將包括嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，如大鼠或者小鼠的細(xì)胞，狗的細(xì)胞或者人的細(xì)胞。這種細(xì)胞可以是例如胰細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞或者脂肪細(xì)胞。還可以使用細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，原代細(xì)胞培養(yǎng)物)的細(xì)胞。根據(jù)鑒定調(diào)節(jié)格列美脲活性的化合物的方法中的步驟c]的GPI-PLC的活性的測(cè)定可以通過測(cè)量pp59Lyn從hcDIG的解離，或者通過測(cè)量pp59Lyn和/或Gce1從hcDIG向IcDIG的重新分布，或者通過測(cè)量pp59Lyn和/或IRS1的磷酸化的改變，或者通過測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激和/或脂解作用的抑制來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于來自根據(jù)鑒定調(diào)節(jié)格列美脲活性的化合物的方法中的步驟c]的hcDIG的GPI-PLC的活性減小的情況，所鑒定的化合物失活或者減小格列美脲的活性。對(duì)于GPI-PLC的活性增強(qiáng)的情況，所鑒定的化合物刺激或者支持格列美脲的活性。
具有藥學(xué)上可接受的陰離子的式I化合物的鹽同樣可以包括在本發(fā)明范圍中作為產(chǎn)生或者純化藥學(xué)上可接受的鹽的中間物和/或用于非治療性的應(yīng)用，例如，體外應(yīng)用。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的常規(guī)方法制備式I化合物的鹽。例如，通過將式I化合物與無機(jī)或者有機(jī)酸或者堿在溶劑或者稀釋劑中化合可以制備鹽。
此處所用的術(shù)語“生理學(xué)功能衍生物”涉及根據(jù)本發(fā)明的式I化合物的生理學(xué)上可接受的衍生物，例如，酯，其當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物，如人時(shí)，能夠(直接或者間接)形成式I化合物或者其活性代謝物。
生理學(xué)功能衍生物還包括根據(jù)本發(fā)明化合物的前體藥物。此類前體藥物可以在體內(nèi)代謝成根據(jù)本發(fā)明的化合物。這些前體藥物可以自身是有活性或無活性的。
根據(jù)本發(fā)明的化合物可以以多種多晶型形式存在，例如，作為無定形或者結(jié)晶的多晶型形式存在。根據(jù)本發(fā)明的化合物的所有多晶型形式包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且是本發(fā)明的另一方面。
下面對(duì)“根據(jù)式I的化合物”的所有參考都表示如上述的一種/多種式I化合物，和它們的鹽、溶劑合物和如本文描述的生理學(xué)功能衍生物。
為了實(shí)現(xiàn)所希望的生理學(xué)效果，根據(jù)式I化合物的必需的量取決于多種因素，例如，所選的特定化合物、計(jì)劃的用途、施用方式和患者的臨床狀況。通常，日劑量為0.3mg到100mg(通常3mg到50mg)/天/千克體重，例如，3-10mg/kg/天。靜脈內(nèi)劑量可以為例如，0.3mg到1.0mg/kg，其可以適宜地作為10ng-100ng/千克體重/分鐘注射液施用。用于這些目的的合適的輸注溶液可以含有例如，每毫升0.1ng到10mg，通常1ng到10mg。單獨(dú)劑量可以含有例如，1mg到10g活性化合物。從而，用于注射的安瓿劑可以含有例如，1mg到100mg，經(jīng)口施用的單獨(dú)的劑量劑型，例如片劑或者膠囊劑，可以含有例如，1.0到1000mg，通常10到600mg。對(duì)于藥學(xué)上可接受的鹽，上面提及的重量細(xì)節(jié)涉及來自該鹽的二氫噻唑離子的重量。對(duì)于上述狀況的預(yù)防或者治療，根據(jù)式I的化合物可以自身用作化合物，但是它們優(yōu)選與可耐受的賦形劑以藥物組合物的形式存在。賦形劑當(dāng)然必須是可耐受的，即它與組合物中的其他成分相容并且對(duì)患者的健康無害。賦形劑可以是固體或者液體或者兩者并且優(yōu)選與該化合物配制成單獨(dú)劑量，例如，作為片劑，其可以含有按重量計(jì)0.05％到95％的活性化合物。還可以存在其他藥學(xué)活性物質(zhì)，包括根據(jù)式(I)的其他化合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以通過一種已知的制藥方法制備，該方法基本上包括將成分與藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或輔劑混合。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物為適于口服、直腸、局部、經(jīng)口(例如，舌下)和腸胃外(例如，皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)或者靜脈內(nèi))施用的那些藥物組合物，然而每個(gè)個(gè)體情況中最合適的施用方式取決于所治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性和用于每個(gè)病例的根據(jù)式(I)的化合物的性質(zhì)。糖包衣的制劑和糖包衣的緩釋制劑也包括在本發(fā)明的范圍中。優(yōu)選酸抗性和經(jīng)腸制劑。適宜的腸包衣包括鄰苯二甲酸醋酸纖維素、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和異丁烯酸和異丁烯酸甲酯的陰離子聚合物。
用于經(jīng)口施用的適宜的藥物化合物可以存在于單獨(dú)的單位，如膠囊劑、扁囊劑、錠劑或者片劑，其在每種情況中含有一定量的根據(jù)式(I)的化合物；作為粉劑或者顆粒；作為在水性或者非水性液體中的溶液劑或者混懸劑；或者作為水包油或者油包水乳劑。如已經(jīng)提到的，可以通過任何適宜的制藥方法制備這些組合物，所述方法包括其中將活性化合物和賦形劑(其可以由一種或多種額外成分組成)接觸的步驟。通常，通過將活性化合物與液體和/或細(xì)分的固體賦形劑均勻并且同質(zhì)地混合，之后如果需要，將產(chǎn)物成形，可以制備組合物。從而，例如，可以通過將化合物的粉劑或者粒劑與(如果合適)一種或多種額外成分壓片或者成形可以制備片劑?？梢栽谶m宜的機(jī)器中，將自由流動(dòng)形式的化合物，如粉劑或者顆粒(如果合適)與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑和/或一種(多種)表面活性劑/分散劑混合后壓片，可以制備壓片的片劑。通過在合適的機(jī)器中將用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉狀化合物成形可以制備成形的片劑。
適于經(jīng)口(舌下)施用的藥物組合物包括錠劑，其含有根據(jù)式I的化合物與調(diào)味劑、常規(guī)蔗糖和阿拉伯膠或者西黃蓍膠；和軟錠劑，其包括惰性基質(zhì)，如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯膠中的化合物。
用于腸胃外施用的適宜的藥物組合物優(yōu)選包括根據(jù)式I化合物的無菌水性制劑，其優(yōu)選與預(yù)期的受者的血液等滲。這些制劑優(yōu)選靜脈內(nèi)施用，然而也可以在皮下、肌內(nèi)或者皮內(nèi)作為注射劑進(jìn)行施用。通過混合該化合物與水并使得所得溶液無菌并且與血液等滲，可以優(yōu)選制備這些制劑。根據(jù)本發(fā)明的可注射的組合物通常含有按重量計(jì)0.1到5％活性化合物。
用于直腸施用的適宜的藥物組合物優(yōu)選作為單獨(dú)的劑量栓劑存在。將根據(jù)式(I)的化合物與一種或多種常規(guī)固態(tài)賦形劑，例如，可可脂混合，并將所得混合物成形，可以制備這些組合物。
用于局部應(yīng)用在皮膚的適宜的藥物組合物優(yōu)選作為軟膏劑、乳膏劑、洗劑、糊劑、噴霧劑、氣溶膠或者油存在。可以使用的賦形劑為礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、醇和兩種或者多種這些物質(zhì)的組合?；钚曰衔锿ǔＲ园凑战M合物的重量計(jì)0.1到15％，例如，0.5到2％的濃度存在。
經(jīng)皮施用也是可能的。用于經(jīng)皮施用的適宜的藥物組合物可以作為單獨(dú)的貼劑存在，其適于與患者的表皮長(zhǎng)期緊密接觸。此類貼劑適宜地含有任選緩沖的水性溶液中、溶解和/或分散在粘合劑或者分散在聚合物中的活性化合物。適宜的活性化合物濃度為例如約1％到35％，優(yōu)選約3％到15％。作為特定可能性，活性化合物可以由電轉(zhuǎn)運(yùn)或者離子電滲療法釋放，如Pharmaceutical Research，2(6)318(1986)中描述。
實(shí)施例材料和方法人重組胰島素PIG41(公開在“Frick，W.等人，(1998)Biochemistry37，13421-13436”)和格列美脲(商品名Amaryl)由Aventis PharmaGermany(Frankfurt，Germany)的藥物化學(xué)和合成部(medicinal chemistryand synthesis departments)提供。如Müller等人，(1997)Biochem.Biophys.Acta 134723-39中描述的合成12-((7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑-4-基)氨基)十二酸(NBD-FA)。膠原酶(Worthington，CLS，I型，250單位/mg)由Biochrom(Berlin，Germany)提供。來自牛奶的脂蛋白脂肪酶(LPL，親和純化的)、磷脂酶A2(蜜蜂毒液)、粗品豬胰脂肪酶(PL)、重組PC-和PI-PLC(蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus))、粗品PLD(卷心菜)和脫脂BSA(級(jí)分V)由Sigma/Aldrich(Deisenhofen，Germany)供應(yīng)，粗品PI-PLC(大鼠肝臟)和蛋白酶抑制劑從Roche Molecular Biochemicals(Mannheim，Germany)購買。重組GPI-PLC(布魯斯錐蟲)從Oxford Glycosystems(Oxford，UK)得到。PLA2(AACOCF3)和PLC(U73122)的抑制劑來自Tocris(Avonmouth，UK)。Bisbodipy-C11-PC從Molecular Probes(Eugene，OR)購買。脂類從Avanti Polar Lipids(Birmingham，AL)購買。用于小窩蛋白-1的免疫沉淀的抗體(克隆C060)和小窩蛋白-1的的免疫印跡的抗體(兔)和pp59Lyn的免疫印跡的抗體(克隆32)來自Transduction Laboratories(Lexington，KY)。用于磷酸酪氨酸的的免疫印跡的抗體(克隆4G10)從Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)得到。用于IRS-1的免疫印跡的抗體(兔，親和純化的)(昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的抗總的人重組蛋白)、5’-Nuc(大鼠)和aP(牛)的免疫印跡的抗體由Biotrend(Cologne，Germany)制備。ECL Renaissance化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒從NEN/DuPont(Bad Homburg，Germany)得到。Sprague-Dawley大鼠由Charles-River Laboratories(UK)提供。
GPI-2350的合成(也參見圖1中的草案)通過如“Zhai，H.-X.等人(1995)Tetrahedron Lett.367403-7406”中公開的方法制備原料外消旋1，4，5，6-四-O-芐基-肌醇(下文中化合物1)。然后在三乙胺和二甲基-氨基吡啶的存在下用十二烷基膦酰二氯磷酸化化合物1，得到四-O-芐基-肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基膦酸(下文中化合物2)。通過用10％批鈀木炭催化氫化，將化合物2脫芐基得到肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基膦酸(下文中化合物3或者GPI-2350)，其為非對(duì)映體混合物。為了合成化合物2(圖1)，將1g(1.8mmol)化合物1溶解在60ml二氯甲烷中，并加入1ml三乙胺、200mg二甲基-氨基吡啶和1g(10mmol)十二烷基膦酰二氯。讓反應(yīng)溶液靜置(45分鐘，室溫下)。然后加入50ml乙酸乙酯并在硅膠上過濾混合物。濃縮溶劑后，通過急驟層析(正庚烷/乙酸乙酯，1/1，按體積計(jì))純化殘?jiān)??；衔?產(chǎn)率580mg(43％)白色無定形固體。TLC正庚烷/乙酸乙酯(1/1，按體積計(jì))，Rf＝0.7.MS(M+Li)+＝761.4，計(jì)算的C60H59O7P，M＝754.9。為了合成化合物3(圖1)，將505mg(0.67mmol)化合物2溶解在5ml乙酸乙酯和15ml甲醇的混合物中。加入700mg披鈀(10％)木炭后，將反應(yīng)混合物氫化(6h，1大氣壓H2)。將Pd在硅膠上過濾并用100ml甲醇洗滌。濃縮溶劑后，通過急驟層析(二氯甲烷/甲醇，5/1，按體積計(jì))純化殘?jiān)??；衔?的產(chǎn)率179mg(68％)白色無定形固體。TLC二氯甲烷/甲醇(5/1，按體積計(jì))，Rf＝0.15.MS(M+Li)+＝401.2，計(jì)算的C18H35O7P，M＝394.4?；衔?在酸性溶劑比在堿性溶劑中的穩(wěn)定性低。它在甲醇中穩(wěn)定數(shù)天并且作為干燥的無定形固體在4℃穩(wěn)定數(shù)年。
大鼠脂肪細(xì)胞的制備和溫育通過消化從雄性大鼠(120-140g，隨意喂養(yǎng)，見Ref.53)的附睪脂肪墊分離的脂肪細(xì)胞在含有1％(w/v)BSA的KRH(20mM Hepes/KOH，pH7.4，1.2mM KH2PO4，140mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mMMgSO4)中洗滌兩次，然后在補(bǔ)充100μg/ml慶大霉素，100nM 1-甲基-2-苯基乙基腺苷，0.5U/ml腺苷脫氨酶，1mM丙酮酸鈉和5mM D-葡萄糖，不存在或者存在GPI-2350(制備成DMSO中的10mM貯存液，體外和脂肪細(xì)胞溫育中的最終DMSO在任意抑制劑濃度下保持恒定在0.5％)、胰島素或者格列美脲(如“Müller等人(1994)J.Cell.Biol.1261267-1276”中描述的制備)的相同介質(zhì)中，在37℃搖動(dòng)水浴中，以5％CO2/95％O2不斷冒泡的情況下溫育所指示的時(shí)間，最終滴定度為每ml溫育體積100μl收集細(xì)胞體積(通過將少量等分試樣抽吸到毛細(xì)血球壓積管中并在微量血細(xì)胞比容離心機(jī)中離心60秒以測(cè)定脂肪細(xì)胞在懸浮液中占據(jù)的分?jǐn)?shù)來進(jìn)行測(cè)定，10％ cytocrit對(duì)應(yīng)于約1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml)。
質(zhì)膜和lc/hcDIG的制備從在裂解緩沖液(25mM嗎啉代乙磺酸[MES]，pH6.0，140mM NaCl，2mM EDTA，0.5mM EGTA，0.25M蔗糖，50mM NaF，5mM焦磷酸鈉，10mM甘油-3-磷酸，1mM原釩酸鈉和蛋白酶抑制劑)中用馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的Teflon-in-glass勻漿器勻漿(10次沖程)預(yù)處理然后洗滌的脂肪細(xì)胞的核后infranatant制備質(zhì)膜和DIG。將脫脂肪的核后infranatant差速離心，然后通過如前描述(48，53)的通過蔗糖和Percoll墊層上兩次順序離心純化，最后以2mg蛋白質(zhì)/ml懸浮在25mM Tris/HCl(pH7.4)，0.25M蔗糖，1mM EDTA上得到質(zhì)膜。通過如“Müller，G.等人(2002)Mol.Med.8120-136”中報(bào)導(dǎo)的去污劑方法和不連續(xù)蔗糖梯度離心方法得到hc/IcDIG。在15-22％(級(jí)分4-5)和28-35％(級(jí)分8-9)蔗糖界面的光散射的乳白色帶分別收集為hcDIG和lcDIG，用折射率測(cè)量密度。用25mM MES(pH6.5)，1％ Triton X-100，150mM NaCl將合并的梯度級(jí)分稀釋3倍后通過離心(50,000xg，30min，4℃)收集hc/lcDIG，然后通過如“Müller，G.等人(2002)Mol.Med.8120-136”和/或“Müller，G.等人(2001)Mol.Cell.Biol.214553-4587”中描述的通過相關(guān)標(biāo)記的富集/喪失進(jìn)行表征(免疫印跡、酶測(cè)定法)，或者進(jìn)行Triton X-114分配(見下文)。對(duì)于小窩蛋白的免疫沉淀，將DIG溶解(1h，4℃)在10mM Tris/HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1％ TritonX-100，60mM β-辛基葡糖苷，0.3％脫氧膽酸，5mM EDTA，0.5mMEGTA，1mM原釩酸鈉，50mM NaF，1μM微囊藻素(microcystine)和蛋白質(zhì)抑制劑)中并離心(50,000xg，30min)。為了直接免疫印跡，將DIG溶解在2倍Laemmli樣品緩沖液中并離心(10,000xg，5min)。使用上清液。
GPI-PLC/D測(cè)定法根據(jù)“Hari等人(1997)Biochim.Biophys.Acta 1355293-302”等人的測(cè)定法，通過與100μl 200mM Tris/馬來酸鹽(pH7.0)中的10μl人胎盤aP溶液(10mM Hepes/NaOH，pH7.0，150mM NaCl中100U/ml)和1％Nonidet P-40在37℃溫育10分鐘，然后加入0.4ml冰預(yù)冷的終止緩沖液(10mM Hepes/NaOH，pH7.0，150mM NaCl，0.1mM MgCl2和0.01mM乙酸鋅)來測(cè)定GPI-PLD(大鼠血清)。如“Mensa-Wilmot等人(1995)MethodsEnzymol.250641-655”中描述的，通過將50μl 50mM Tris/HCl(pH8.0)中的5μl人胎盤aP溶液(見上文)，0.25％ Nonidet P-40和5mM EDTA在37℃溫育30分鐘，隨后加入0.45ml終止緩沖液結(jié)束反應(yīng)來測(cè)定GPI-PLC(布魯斯錐蟲)。通過與100μl 20mM Hepes/KOH(pH7.8)，144mM NaCl，0.1％ TX-100，0.2mM MgCl2中的10μl牛紅細(xì)胞乙酰膽堿酯酶(AChE)溶液(10mM Tris/HCl，pH7.4，144mM NaCl，0.1％ TX-100中12U/ml)在25℃溫育1小時(shí)并隨后加入5μl冰乙酸，然后加入0.4ml 10mMTris/HCl(pH7.4)，144mM NaCl來測(cè)定PI-PLC(蠟狀芽孢桿菌)和脂肪細(xì)胞GPI-PLC(5-25μg質(zhì)膜或者h(yuǎn)c/lcDIG)。每種反應(yīng)混合物進(jìn)行TX-114分配(見下文)。從在TX-114耗竭的相中測(cè)量的親水a(chǎn)P或AChE的活性與分配前測(cè)量的總活性的比率，并對(duì)通過缺少(G)PI-PLC/D的空白溫育揭示的TX-114耗竭的相中非酶背景(占總活性的10-20％)進(jìn)行校正后，計(jì)算GPI-PLC/D活性。
其他脂肪酶測(cè)定法用如“Vertesy等人，(2002)Journal Antibiotics 55480-494”中描述的放射標(biāo)記的油酸甘油酯小滴乳劑測(cè)量激素敏感的脂肪酶(HSL)和脂蛋白脂肪酶(LPL)。將2ml 5mM Tris/HCl(pH6.5)，6mM?；敲撗跄懰徕c，150mM NaCl，1mM CaCl2中的0.25mmol丁酸甘油酯與相同緩沖液中的豬PL和輔脂肪酶溫育，使用pH調(diào)節(jié)到6.5的記錄pH固定計(jì)(在25℃以1000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌)測(cè)定胰脂肪酶(PL)。將0.2ml 10mM二棕櫚酰卵磷脂，0.1ml10mM SDC和0.1ml 0.03M CaCl2與細(xì)菌PC-PLC(50mM Tris/HCl，pH7.5，0.1％ BSA中)在37℃溫育10分鐘測(cè)定PC-PLC。通過加入0.1ml 50％TCA并隨后加入2.5ml氯仿/甲醇(66/33/1，按體積計(jì))來終止反應(yīng)。離心(1500xg，15min)后，除去上面的甲醇/水相(～1.33ml)的0.2ml部分，補(bǔ)加0.5ml 60％ HClO4，然后在170℃加熱1小時(shí)并最后分析無機(jī)磷酸。通過在37℃溫育0.1ml 10mM PI，0.1ml 0.8％去氧膽酸鈉，0.1％ BSA，0.2ml100mM硼酸鈉(pH7.5)和大鼠肝PI-PLC 20分鐘來測(cè)量哺乳動(dòng)物PI-PLC。終止反應(yīng)并且如對(duì)PC-PLC描述的進(jìn)一步處理。用250μl 40mMHepes/KOH(pH6.0)，4mM CaCl2和卷心菜PLD中的1.6mM[U-14C]磷脂酰膽堿(～2000-4000dpm/nmol)測(cè)定PLD。在37℃溫育30分鐘后，加入含有載體磷脂酸的5ml氯仿/甲醇(2/1，按體積計(jì))終止反應(yīng)。除去水溶性物質(zhì)后，將最終洗滌的下面的氯仿相中含有的脂類轉(zhuǎn)移到熱活化的硅膠板中并用氯仿/甲醇/氨(65/35/4，按體積計(jì))在第一維和氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/水(50/20/10/10/5，按體積計(jì))在第二維進(jìn)行二維分離。通過感光成像檢測(cè)放射性磷脂酸。根據(jù)“Kim，T.-S.等人，(1997)J.Biol.Chem.2722542-2550”用由1-棕櫚酰-2-棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿/bisbodipy-C11-PC/磷脂?；?甘油/膽固醇(10/0.05/2/3，按體積計(jì))組成的單層脂質(zhì)體底物測(cè)定PLA2。用Marquardt-Levenberg非線性最小二乘法對(duì)濃度反應(yīng)曲線進(jìn)行擬合。當(dāng)在對(duì)數(shù)線性軸上作圖時(shí)，該方程得到S形曲線(SigmaPlot軟件，JandelScientific)。
小窩蛋白的免疫沉淀將溶解的DIG(見上文，5-20μg蛋白質(zhì))通過與蛋白質(zhì)A/G-Sepharose溫育并隨后離心(10,000xg，5min)預(yù)清除。上清液與1ml 10mM Tris/HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1％ TX-100中的預(yù)先吸附在蛋白質(zhì)A/G-Sepharose上的抗-小窩蛋白-1抗體(1∶1000)在4℃溫育1小時(shí)。將免疫復(fù)合體用相同緩沖液洗滌兩次，然后用缺少TX-100的緩沖液洗滌兩次，最后在無β-巰基乙醇的存在下進(jìn)行SDS-PAGE。膜剝離后，用抗-小窩蛋白抗體對(duì)相同印跡進(jìn)行同源免疫印跡(homologous immunoblotting)歸一化免疫沉淀的小窩蛋白的回收。
免疫印跡用“Müller，G.等人，(2001)Mol.Cell.Biol.214553-4567”中描述的半干方法將SDS-PAGE分離的多肽轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。經(jīng)洗滌的膜用抗-小窩蛋白-1(1∶2000)、抗-pp59Lyn(1∶1250)、抗-aP(1∶500)、抗-5’-Nuc(1∶750)和抗-IRS-1(1∶2000)抗體在15℃溫育4小時(shí)。洗滌的膜用辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的二級(jí)山羊抗-小鼠(1∶2000)或者山羊抗兔IgG(1∶4000)抗體溫育。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光顯示標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
TX-114分配根據(jù)“Bordier，C.，(1981)J.Biol，Chem.2722542-2550”，通過懸浮在1ml冰預(yù)冷的TX-114(1％)，25mM Tris/HCl(pH7.4)，144mM NaCl中或者與0.5ml冰預(yù)冷的TX-114(2％)混合，使用富含TX-114和耗竭TX-114的相之間的分配，將沉淀的hc/lcDIG(10-50μg蛋白質(zhì))或者(G)PI-PLC反應(yīng)混合物(0.5ml)分離到兩親性或者親水蛋白質(zhì)中。在冰上溫育1小時(shí)后，混合物在冰上的0.4ml 0.25M蔗糖和25mM Tris/HCl(pH7.4)的墊層上分層。通過升溫到37℃并隨后離心(10,000xg，1min)誘導(dǎo)相分離。提取下面的富含TX-114的相后，對(duì)合并的上面的TX-114-耗竭相的等分試樣測(cè)量5’-Nuc、aP和AChE活性或者沉淀(15％聚乙二醇4000)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。
葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定如“Müller，G.等人，(1994)J.Cell Biol.1261267-1276”中描述的通過將10,000-20,000個(gè)洗滌的脂肪細(xì)胞與50μl終濃度為50μM(0.33μCi/ml)的2-脫氧-D-[2，6-3H]葡萄糖在不存在或存在20μM細(xì)胞松弛素B的情況下在37℃溫育20分鐘來測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。
其他步驟如“Müller，G.等人，(2000)Mol.Cell.Biol.204708-4723”中描述的進(jìn)行電穿孔。如＂Müller，G.等人，(2003)Biochimie 851245-1256＂描述的將脂解作用測(cè)定為甘油或者熒光NBD-FA從預(yù)標(biāo)記的和異丙基腎上腺素刺激的脂肪細(xì)胞的釋放。通過用8-N3-[32P]cAMP光標(biāo)記溶解的質(zhì)膜或者h(yuǎn)c/lcDIG(10-50μg蛋白質(zhì))并隨后如“Müller，G.等人，(1994)Biochemistry 3312149-12159”中描述的進(jìn)行感光成像來檢測(cè)Gce1。根據(jù)“Eliakim，R.等人，(1990)Biochim.Biophys.Acta 1355293-302”的方法測(cè)量5’-Nuc、aP和AChE活性。用來自Pierce(Rockford，IL)的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒并用BSA作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)。用預(yù)制凝膠(Novex，SanDiego，CA；10％ Bis-Tris分離膠，嗎啉代丙磺酸-SDS電泳緩沖液)進(jìn)行SDS-PAGE。在LumiImager上用LumiImager軟件(Roche Diagnostics)評(píng)估發(fā)光圖像(Lumiimage)。用Storm 860 PhosphorImager系統(tǒng)(Molecular Dynamics，Gelsenkirchen，Germany)處理和定量磷光和熒光圖像。用Adobe Photoshop軟件(Adobe Systems，Mountain View，CA)產(chǎn)生圖。
GPI-2350以高效力和選擇性抑制多種來源的(G)PI-PLC/DGPI-2350對(duì)(純化的或者粗品)蠟狀芽孢桿菌PI-PLC、布魯斯錐蟲GPI-PLC和大鼠血清GPI-PLD的影響通過將它們與部分純化的溶解的GPI蛋白質(zhì)在適宜條件(低或者高去污劑濃度)下，在增加濃度的GPI-2350的存在下溫育來監(jiān)測(cè)。隨后，通過分別測(cè)量TX-114分配時(shí)去污劑耗竭的相中的酶活性和分配前總消化混合物中的酶活性來確定消化混合物中含有脂解切割的GPI錨的親水GPI蛋白質(zhì)相對(duì)于總GPI-蛋白質(zhì)的比(圖2)。GPI-2350分別以10、2和1μM的表觀IC50抑制細(xì)菌、錐蟲和血清(G)PI-PLC/D。使用lcDIG或者h(yuǎn)cDIG作為酶源溶解的質(zhì)膜，AChE作為底物，GPI-2350也阻斷大鼠脂肪細(xì)胞GPI-PLC，IC50為0.2-0.5μM。為了闡明脂肪細(xì)胞GPI-PLC的切割特異性，我們使用從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)球芽制備的GPI-蛋白質(zhì)Gce1，其已經(jīng)用[14C]-肌醇進(jìn)行代謝標(biāo)記。與hcDIG溫育導(dǎo)致產(chǎn)生Gce1的親水和14C-標(biāo)記的形式，其用針對(duì)cIP產(chǎn)生的抗-CRD抗體以依賴濃度和時(shí)間的方式免疫沉淀(數(shù)據(jù)未顯示)。缺少脂肪?；湶⑶液衏IP的GPI-蛋白質(zhì)的依賴hcDIG的產(chǎn)生證明了在大鼠脂肪細(xì)胞的質(zhì)膜中GPI-PLC的表達(dá)。
接著，研究了GPI-2350的選擇性。來自多種來源的一些中性脂肪酶(HSL、PL、LPL)和不同特異性的PC/PI-特異的磷脂酶(A2、C、D)以及牛AChE都已知通過所稱作的催化三聯(lián)體運(yùn)轉(zhuǎn)，它們?cè)谧钄嗉?xì)菌、錐蟲、血清和大鼠脂肪細(xì)胞GPI-PLC/D 60到95％的條件(50μM)下沒有受到顯著影響(圖3)。含有開放的而不是cIP的GPI-2350的兩種衍生物2-脫氧-2-氟-鯊(scyllo)-肌醇-1-O-十二烷基-膦酸(GPI-1793)和肌醇-1-O-十二烷基膦酸甲酯(GPI-2349)在所測(cè)試的最高濃度下對(duì)脂肪細(xì)胞GPI-PLC僅有非常溫和的影響，但是以相似的功效抑制細(xì)菌和錐蟲(G)PI-PLC(表1)。這些發(fā)現(xiàn)證明在涉及穩(wěn)定的或者瞬時(shí)1，2-環(huán)磷酸酯鍵的產(chǎn)生中催化機(jī)制的相似性，但是還證明了在細(xì)菌、錐蟲和脂肪細(xì)胞(G)PI-PLC之間底物識(shí)別的一些差異?？紤]到后者通過cIP中間物運(yùn)行并且基于初步動(dòng)力學(xué)研究，必須假定GPI-2350作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(Ki＝3-20μM)。這可以解釋它的顯著選擇性，因?yàn)橹行灾久负筒溉閯?dòng)物PC/PI-特異的磷脂酶不識(shí)別GPI結(jié)構(gòu)。與競(jìng)爭(zhēng)作用模式相一致，當(dāng)用過量新鮮GPI蛋白質(zhì)底物對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行10倍稀釋時(shí)，GPI-2350對(duì)細(xì)菌和錐蟲(G)PI-PLC的半最大抑制完全逆轉(zhuǎn)。相比，在再分離和充分洗滌前用50μM GPI-2350處理的脂肪細(xì)胞hcDIG在不存在GPI-2350的情況下溫育時(shí)僅顯示出對(duì)純化的溶解的AChE的低脂解切割(數(shù)據(jù)未顯示)。這可以通過兩親性GPI-2350與hcDIG的相互作用來解釋。備選地，GPI-2350可以作為過渡態(tài)類似物并且經(jīng)歷與脂肪細(xì)胞GPI-PLC的活性位點(diǎn)的(瞬時(shí))共價(jià)偶聯(lián)。有趣的是知道GPI-2350的環(huán)狀磷酸酯鍵是否被(G)PI-PLC/D打開。
GPI-2350阻斷分離的DIG和完整脂肪細(xì)胞中GPI-蛋白質(zhì)的胰島素-和格列美脲-誘導(dǎo)的切割基于當(dāng)都存在于單獨(dú)復(fù)合體(分別是去污劑微團(tuán)和DIG)中時(shí)，GPI-2350對(duì)脂肪細(xì)胞質(zhì)膜GPI-PLC對(duì)GPI-蛋白質(zhì)的體外切割的干擾，接下來用內(nèi)源或者外源GPI-蛋白質(zhì)作為底物，研究了GPI-2350對(duì)完整脂肪細(xì)胞和分離的DIG中基礎(chǔ)的和受刺激的GPI-PLC活性的效力(圖4)。在分離的大鼠脂肪細(xì)胞中，GPI-PLC活性(以內(nèi)源5’-Nuc，Gce1和aP的切割通過檢測(cè)它們的兩親性向親水性轉(zhuǎn)化來跟蹤)受到格列美脲和胰島素(分別高達(dá)5倍和3倍)的刺激(欄E、G)。在從這些預(yù)處理的脂肪細(xì)胞制備的hcDIG中刺激被部分保留(分別為3倍和1.7倍)(欄C)。顯著地，從未處理的脂肪細(xì)胞制備的hcDIG與格列美脲的直接溫育激活了GPI-PLC(高達(dá)4倍)，但是與胰島素溫育不能激活GPI-PLC(欄A)。GPI-2350以依賴濃度的方式將基礎(chǔ)的以及格列美脲-和胰島素-刺激的GPI-PLC活性減小到低于分離的hcDIG和完整脂肪細(xì)胞中的基礎(chǔ)的且相似的水平(圖4，所有欄)。顯然，GPI-2350不干擾GPI-PLC的活化，因?yàn)樵撘种苿┰谂c胰島素或者格列美脲溫育前和溫育期間存在(欄C，E)。當(dāng)用完整脂肪細(xì)胞(5-10μM，欄F)測(cè)定時(shí)，GPI-PLC抑制的IC50與分離的完整hcDIG(1μM，欄B，D)以及溶解的hcDIG和質(zhì)膜(0.2-0.5μM，圖2)相比更高。這可以反映當(dāng)包埋在完整脂肪細(xì)胞的質(zhì)膜中的DIG內(nèi)時(shí)與分離的DIG相比，GPI-PLC的催化位點(diǎn)對(duì)GPI-2350的可接近性減小。然而，GPI-2350的細(xì)胞通透性的需要(基于它的兩親性性質(zhì)，預(yù)測(cè)該需要相當(dāng)強(qiáng)烈)大概可以排除，因?yàn)镚PI-PLC的主要底物、GPI脂和蛋白質(zhì)錨都定位于質(zhì)膜的外面小葉，并且GPI-2350可能作為GPI-PLC的催化位點(diǎn)的(競(jìng)爭(zhēng)性)抑制劑(見上文)。相反地，可以想象GPI-2350通過其十二烷基鏈自發(fā)分配到脂肪細(xì)胞質(zhì)膜的非DIG區(qū)(占總細(xì)胞表面的80-90％)，類似于去污劑優(yōu)先分配到非-DIG區(qū)的無序結(jié)構(gòu)域而不是DIG的脂類有序結(jié)構(gòu)域。
在用于分離DIG和質(zhì)膜的實(shí)驗(yàn)條件下，用DIG(即hcDIG加上lcDIG)回收了分離的總質(zhì)膜中65-85％的GPI-PLC活性(測(cè)量為外源AChE的切割)，與脂肪細(xì)胞的處理無關(guān)。對(duì)于典型的DIG標(biāo)記蛋白質(zhì)小窩蛋白-1(70-90％)(如通過免疫印跡測(cè)定)和DIG停留蛋白(resident protein)p115(55-75％)(如通過合成PIG的結(jié)合測(cè)定)觀察到了相似的回收。而且，用DIG(hcDIG加上lcDIG)從差別處理的脂肪細(xì)胞回收的aP、5’-Nuc和Gce1(兩親性加上親水形式)的總量大致恒定(90-140％，基礎(chǔ)值設(shè)置為100％)，表明DIG分離方法在多種條件下的可重復(fù)性。因?yàn)榉蛛x的hcDIG的特征是比lcDIG和非-DIG區(qū)顯著更低的蛋白質(zhì)含量，所以與殘留質(zhì)膜相比，hcDIG高度富含GPI-PLC，與GPI-蛋白質(zhì)底物的定位相一致。
大鼠脂肪細(xì)胞中GPI-PLC作用是DIG內(nèi)GPI-錨定的和?；男盘?hào)蛋白的再分布所需的。
接下來研究了GPI-蛋白質(zhì)的脂解切割是否影響脂肪細(xì)胞質(zhì)膜的DIG內(nèi)GPI-錨定的以及?；男盘?hào)蛋白的定位和依賴刺激物的再分布。為此，從格列美脲刺激前不存在或存在GPI-2350時(shí)溫育的脂肪細(xì)胞制備hc/kcDIG，然后分析幾種GPI-錨定的或者?；男盘?hào)蛋白的存在(圖5)。存在最大有效濃度的GPI-2350時(shí)，pp59Lyn、Gce1和5’-Nuc從hcDIG向lcDIG的有效再分布幾乎被完全消除，所述再分布如它們?cè)趌cDIG中的量增加3到5倍所證明，這對(duì)應(yīng)于與基礎(chǔ)脂肪細(xì)胞相比hcDIG中損失70-90％。相比，相對(duì)于lcDIG在hcDIG中hcDIG停留蛋白、小窩蛋白-1和IRβ的相對(duì)富集以及在hcDIG和lcDIG中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同種型4(Glut4)的相似豐度都不受到格列美脲的影響，該相對(duì)富集和相似豐度在GPI-2350的存在下不顯著改變(圖5)。這表明GPI-PLC的有效抑制特異干擾某些脂類修飾的信號(hào)蛋白，如Gce1和pp59Lyn從hcDIG到lcDIG的依賴刺激的轉(zhuǎn)移，而不是導(dǎo)致DIG結(jié)構(gòu)中的一般性和非特異的改變。
接下來研究了在GPI-PLC作用和GPI蛋白質(zhì)再分布之間推定的因果關(guān)系下的機(jī)理，即在受刺激的分離的大鼠脂肪細(xì)胞中，脂解切割和/或未切割的GPI-蛋白質(zhì)是否實(shí)際上轉(zhuǎn)移到lcDIG。為此，將大鼠脂肪細(xì)胞與或者不與GPI-2350溫育，然后用胰島素或者格列美脲刺激。通過TX-114分配測(cè)定從總質(zhì)膜、hcDIG和lcDIG回收的GPI-蛋白質(zhì)、5’-Nuc、aP和Gce1的親水和兩親性形式的量(表2)。用胰島素和更有效的格列美脲處理導(dǎo)致質(zhì)膜中親水GPI-蛋白質(zhì)的增加，其受到GPI-2350的完全阻斷，表明有效的GPI-PLC抑制。響應(yīng)胰島素和格列美脲，親水性GPI-蛋白質(zhì)的量的增加僅在hcDIG中檢測(cè)到，并且伴隨著相同位置處兩親性形式的減少。在GPI-2350的存在下，這些改變甚至逆轉(zhuǎn)到低于基礎(chǔ)值，表明該兩親性向親水性轉(zhuǎn)化的脂解性質(zhì)。從而，在hcDIG處胰島素/格列美脲刺激的GPI-PLC產(chǎn)生的親水性GPI-蛋白質(zhì)通過不依賴于GPI錨的分子機(jī)理保持與hcDIG結(jié)合(表2)。有趣的是，格列美脲誘導(dǎo)的5’-Nuc、Gce1和aP從hcDIG向lcDIG的再分布(見圖5)局限于它們的未切割的形式，如在lcDIG回收的兩親性GPI-蛋白質(zhì)中升高3到4倍水平，但是在用lcDIG回收的親水性GPI-蛋白質(zhì)中是未改變的低水平，但是仍然被GPI-2350完全消除所反映的(表2)。相比，親水性5’-Nuc、Gce1和aP的胰島素誘導(dǎo)的產(chǎn)生伴隨著它們的兩親性負(fù)體(counterpart)在lcDIG中僅非常溫和的增加(顯著性邊界)，其在GPI-2350的存在下再次被消除。所研究的所有三種GPI-蛋白質(zhì)僅顯示出刺激物依賴的脂解切割和它們的兩親性形式的再分布之間的相關(guān)性，僅存在微小的數(shù)量差異(表2)?？傊?，hcDIG中脂解切割的GPI-蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和積累需要GPI-PLC活化(格列美脲)。
GPI-PLC的抑制干擾GPI-錨定的且?；男盘?hào)蛋白從小窩蛋白的解離最近已經(jīng)證明大鼠脂肪細(xì)胞中信號(hào)蛋白從hcDIG到lcDIG的再分布伴隨著它們從小窩蛋白-1的解離和活化。接著通過抑制GPI-PLC并隨后分析了小窩蛋白-1與Gce1和pp59Lyn的相互作用以及后者的激酶活性，研究了大鼠脂肪細(xì)胞中從小窩蛋白的解離/活化和GPI蛋白質(zhì)的依賴刺激物的脂解切割之間推定的因果關(guān)系(圖6)。來自從分離且溶解的hcDIG制備的小窩蛋白-1免疫沉淀物的pp59Lyn和Gce1的胰島素(35-45％)和格列美脲-(75-85％)誘導(dǎo)的最大損失被GPI-2350完全廢除(50μM；圖6，欄A)，IC50為5-10μM(欄B)。該效價(jià)類似于完整脂肪細(xì)胞中GPI-2350對(duì)GPI-PLC的抑制(圖3)。小窩蛋白-1的支架結(jié)構(gòu)域(SCD)與信號(hào)蛋白(如非受體酪氨酸激酶)的小窩蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的結(jié)合，和反過來，CSD與CBD結(jié)合的減弱已經(jīng)在許多但不是所有情況中表明在體外測(cè)定中分別引發(fā)信號(hào)蛋白的失活和活化。這意味著在質(zhì)膜DIG中進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中CSD-CBD相互作用的調(diào)節(jié)功能。
大鼠脂肪細(xì)胞中GPI-PLC的抑制下調(diào)格列美脲但不下調(diào)胰島素的代謝活性隨后，研究了響應(yīng)胰島素和格列美脲，GPI-PLC抑制對(duì)IRS-1酪氨酸磷酸化的差別效果是否反映在它們?cè)谝葝u素靶細(xì)胞中的代謝活性中。為此，用任一種刺激物刺激前，將分離的大鼠脂肪細(xì)胞用GPI-2350預(yù)處理，然后測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的脂解(圖8)。格列美脲對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激和異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的脂解的抑制在GPI-2350存在下以依賴濃度的方式(IC50＝2-5μM)下降到低于對(duì)照值(50μM)。因此，格列美脲濃度反應(yīng)曲線向右偏移并且GPI-2350對(duì)GPI-PLC的半最大抑制(5μM)過程中與不存在抑制劑時(shí)相比變得平坦。相比，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的胰島素刺激和異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的脂解的抑制(與格列美脲相比高2-3倍)被僅50μM的GPI-2350分別降低達(dá)25％和33％(圖8)。通過分析GPI-2350對(duì)格列美脲和胰島素對(duì)異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的脂解作用抑制的影響，證實(shí)了GPI-PLC抑制的這些差別效果，所述影響測(cè)量為NBD-FA而不是甘油從用該熒光脂肪酸衍生物預(yù)標(biāo)記的大鼠脂肪細(xì)胞的釋放(圖9)。響應(yīng)格列美脲濃度的增加，從異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞釋放的NBD-FA(包括其氧化分解產(chǎn)物)的量的減少(IC50＝3μM)在50μM格列美脲的存在下被完全消除(欄A、B)。相比，NBD-FA(和降解產(chǎn)物)釋放的胰島素抑制僅受到GPI-2350(50μM)的損害達(dá)25-30％，伴隨著胰島素的表觀IC50的微小增加(0.1對(duì)0.3μM)。大鼠肝臟PI-PLC和蜂毒PLA2的抑制劑不能顯著影響基礎(chǔ)的和格列美脲調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂解作用，這證實(shí)了這些GPI-2350介導(dǎo)的效應(yīng)對(duì)于GPI-PLC抑制的特異性(圖8)。
最后，研究了GPI-PLC在胰島素模擬刺激物而不是格列美脲的信號(hào)傳遞途徑中的參與，這些信號(hào)途徑依賴于或者獨(dú)立于GPI-蛋白質(zhì)在DIG中的再分布。在大鼠脂肪細(xì)胞中，用m-β-CD通過膽固醇耗竭對(duì)hcDIG的破壞、通過胰蛋白酶/鹽/NEM處理對(duì)PIG受體p115的失活，或者用合成的配體PIG41對(duì)p115的占據(jù)，都導(dǎo)致lcDIG中Nuc的顯著增加和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活化(表3)。相比，原釩酸鈉以及合成的CBDP刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)而不同時(shí)誘導(dǎo)5’-Nuc向lcDIG的轉(zhuǎn)移。這與它們的作用方式、酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸鹽對(duì)胰島素受體和IRS-1脫磷酸的公知的抑制和CBDP對(duì)pp59Lyn和IRS-1酪氨酸磷酸化的直接刺激相一致。這些刺激物對(duì)IRS-1酪氨酸磷酸化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)都不刺激(表3)在GPI-2350的存在下受到顯著影響，意味著它們?cè)贕PI-PLC下游的一個(gè)點(diǎn)都串話到葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
表格描述表1(G)PI-PLC抑制劑的特征。
表2胰島素、格列美脲和GPI-2350對(duì)hcDIG、lcDIG和總質(zhì)膜上脂解切割的和未切割的GPI-蛋白質(zhì)的定位的影響。
表3GPI-2350對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞中多種胰島素模擬刺激物誘導(dǎo)的5’-Nuc轉(zhuǎn)移和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
表格說明表1來自大鼠脂肪細(xì)胞的hcDIG的GPI-PLC、來自布魯斯錐蟲的GPI-PLC和來自蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC與溶解的且部分純化的牛紅細(xì)胞AChE或者人胎盤aP在不存在或者存在增加濃度的(0.05μM-1mM)所示抑制劑的情況下在合適的條件下(見材料和方法)溫育。從TX-114分配時(shí)用TX-114-耗竭的相回收的親水AChE和aP活性計(jì)算切割率。給出了至少3次獨(dú)立溫育與一式四份的分配/酶測(cè)定得到的平均值+SD。n，a不適用。
表2分離的大鼠脂肪細(xì)胞不用或者用GPI-2350(50μM)處理(5分鐘，37℃)，然后在所示的格列美脲(20μM)或胰島素(10nM)的不存在或存在下溫育(120分鐘，37℃)。制備總的質(zhì)膜(PM)、hcDIG和lcDIG然后進(jìn)行TX-114分配。對(duì)TX-114-富集的和耗竭的相測(cè)定5’-Nuc和aP(活性測(cè)量)和Gce1(光親和標(biāo)記)。相對(duì)于從不存在GPI-2350下的基礎(chǔ)脂肪細(xì)胞制備的總質(zhì)膜和hcDIG中兩親性形式(每種設(shè)置為100任意單位)，計(jì)算兩親性和親水GPI-蛋白質(zhì)的量。親水性和兩親性GPI-蛋白質(zhì)從hcDIG和lcDIG的回收在多種溫育條件下都是相當(dāng)?shù)摹＝o出了至少3次獨(dú)立細(xì)胞溫育與每次一式兩份的活性測(cè)量/凝膠運(yùn)行的平均值±SD。
表3在甲基-β-環(huán)糊精(m-β-CD，10mM，50min)、CBDP(300μM，電穿孔，然后洗滌并隨后溫育30分鐘)、PIG41(10μM，15min)、原釩酸鈉(1mM，15min)、胰蛋白酶(10μg/ml，15min，接著用0.5M NaCl處理并隨后洗滌)和N-乙基-馬來酰亞胺(1mM，5min，然后加入DTT)的存在下溫育分離的大鼠脂肪細(xì)胞。向半份脂肪細(xì)胞懸浮液加入GPI-2350(50μM終濃度)并進(jìn)一步溫育(60min，37℃)后，測(cè)定分離的IcDIG中部分細(xì)胞的5’-Nuc活性。在基礎(chǔ)溫育期間5’-Nuc的增加設(shè)置為100個(gè)任意單位。對(duì)其他部分的細(xì)胞(溫育15分鐘后)測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，其對(duì)于基礎(chǔ)溫育設(shè)置為100個(gè)任意單位。給出了至少3次獨(dú)立細(xì)胞溫育與每次一式三份的活性測(cè)量的平均值+SD。
表1
表2
表3


圖1(G)PI-PLC抑制劑的結(jié)構(gòu)和合成。見材料和方法。
圖2GPI-2350的效力。從蠟狀芽孢桿菌、大鼠血清和布魯斯錐蟲純化的(G)PI-PLC/D以及從分離的大鼠脂肪細(xì)胞制備的總質(zhì)膜(PM)和hc/lcDIG與增加濃度的GPI-2350溫育(10min，30℃)，然后通過TX-114分配測(cè)定AChE和aP的兩親性向親水性轉(zhuǎn)化(見“材料和方法”)。脂解活性計(jì)算為不存在GPI-2350時(shí)對(duì)照反應(yīng)(設(shè)置為100％)的％。給出了至少4次獨(dú)立的溫育與每次一式三份的AChE和aP活性測(cè)量的平均值+SD。
圖3GPI-2350的選擇性。根據(jù)典型的測(cè)定方案(見材料和方法)，在GPI-2350(50μM)不存在或者存在下，測(cè)定了多種(部分)純化的或者重組的脂肪酶(如所指出的不同來源的HSL，激素敏感的脂肪酶；PL，胰脂肪酶；LPL，脂蛋白脂肪酶；PC-PLC，磷脂酰膽堿特異的磷脂酶C；PI-PLC，磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C；PLD，磷脂酶D；PLA2，磷脂酶A2；GPI-PLC，糖基磷脂酰肌醇特異的PLC/D和AChE(乙酰膽堿酯酶)以及從分離的大鼠脂肪細(xì)胞得到的總質(zhì)膜(PM)和hc/lcDIG。給出了至少3次獨(dú)立的溫育與每次一式三份測(cè)量的平均值+SD。
圖4GPI-2350對(duì)胰島素/格列美脲誘導(dǎo)的GPI-PLC對(duì)GPI-蛋白質(zhì)的切割的影響。欄A和BhcDIG從未處理的大鼠脂肪細(xì)胞制備然后不存在或者存在GPI-2350時(shí)溫育(5min，37℃)(欄A，50μM；欄B，增加濃度)，然后不用或者用如所示的胰島素(10nM)或者格列美脲(20μM)處理(120min，30℃)。欄C和D不存在或者存在如所示的胰島素(10nM)或格列美脲(20μM)時(shí)溫育分離的大鼠脂肪細(xì)胞(15min，37℃)。制備hcDIG并隨后與GPI-2350溫育(120min，30℃)(欄C，50μM；欄D，增加濃度)。欄E、F和G不存在或存在GPI-2350(欄E和G，50μM；欄F，增加濃度)時(shí)溫育(5min，37℃)分離的大鼠脂肪細(xì)胞然后如所示的不用或用胰島素(10nM)或格列美脲(20μM)處理(90min，37℃)。制備hcDIG。欄A-D用5’-Nuc作為外源性底物，測(cè)量hcDIG中GPI-PLC的活性，表示為它的親水形式的轉(zhuǎn)化。欄E-G用hcDIG的TX-114-耗竭相回收的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡以檢測(cè)親水5’-Nuc和aP或者通過光親和標(biāo)記分析親水Gce1。給出了3次獨(dú)立的細(xì)胞溫育與每次一式三份的活性測(cè)量和凝膠運(yùn)行(顯示了代表性的一份)的平均值+SE。
圖5GPI-2350對(duì)DIG內(nèi)信號(hào)蛋白的格列美脲誘導(dǎo)的重新分布的影響。分離的大鼠脂肪細(xì)胞不用或者用GPI-2350(50μM終濃度)處理(5min，37℃)，然后不存在或存在所示格列美脲(50μM)時(shí)溫育(120min，37℃)。制備hcDIG和lcDIG并分別通過免疫印跡和光親和標(biāo)記測(cè)定pp59Lyn、5’-Nuc、小窩蛋白-1、胰島素受體β亞基(IRβ)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glut4)和Gce1的存在(見凝膠插圖)。給出相對(duì)于不存在GPI-2350的對(duì)照反應(yīng)(基礎(chǔ)的)(設(shè)為100)，用hc/lcDIG回收的pp59Lyn、Gce1和5’-Nuc的量。給出至少3次獨(dú)立細(xì)胞溫育與一式兩份的凝膠運(yùn)行(顯示的代表性的一份)的平均值+SD。
圖6GPI-2350對(duì)格列美脲/胰島素誘導(dǎo)的信號(hào)蛋白與小窩蛋白解離的影響。分離的大鼠脂肪細(xì)胞不用或者用GPI-2350處理(5min，37℃)(左欄，50μM；右欄，增加的濃度)，然后在不存在或者存在胰島素(10nM)或格列美脲(20μM)時(shí)溫育(120min，37℃)。從脂肪細(xì)胞制備hcDIG然后溶解。分別通過免疫印跡和光親和標(biāo)記測(cè)定從溶解的hcDIG制備的小窩蛋白-1免疫沉淀物中pp59Lyn和Gce1的存在。通過同源免疫印跡(homologousimmunoblotting)對(duì)免疫沉淀的小窩蛋白-1的回收進(jìn)行校正后，給出相對(duì)于不存在GPI-2350時(shí)的對(duì)照反應(yīng)(欄A，基礎(chǔ)值設(shè)為100)或者胰島素-或者格列美脲刺激的狀態(tài)(欄B，設(shè)為100)，pp59Lyn和Gce1的量(見凝膠插圖)。給出了至少4次獨(dú)立的細(xì)胞溫育與一式兩份的凝膠運(yùn)行(顯示了代表性的一份)的平均值+SD。
圖7GPI-2350對(duì)信號(hào)蛋白的格列美脲/胰島素誘導(dǎo)的活化的影響。分離的大鼠脂肪細(xì)胞不用或者用GPI-2350(欄A，50μM；欄B，增加的濃度)處理(5min，37℃)，然后不存在或者存在胰島素(10nM)或者格列美脲(20μM)時(shí)溫育(120min，37℃)。分別從脫脂的核后infranatant(見材料和方法)和溶解的合并的hc/lcDIG免疫沉淀IRS-1和pp59Lyn，然后進(jìn)行免疫印跡來檢測(cè)磷酸酪氨酸。通過同源免疫印跡對(duì)免疫沉淀的IRS-1和pp59Lyn的回收進(jìn)行校正后，給出相對(duì)于不存在GPI-2350時(shí)的對(duì)照反應(yīng)(欄A，基礎(chǔ)值設(shè)為100)或者胰島素-或者格列美脲刺激的狀態(tài)(欄B，每種情況下設(shè)為100)，酪氨酸磷酸化的IRS-1和pp59Lyn的量(見凝膠插圖)。給出了至少4次獨(dú)立的細(xì)胞溫育與一式兩份的凝膠運(yùn)行(顯示了代表性的一份)的平均值+SD。
圖8GPI-2350對(duì)格列美脲/胰島素誘導(dǎo)的代謝活性的影響。分離的大鼠脂肪細(xì)胞不用或者用GPI-2350(欄A，50μM；欄B，增加的濃度；欄C，5μM，50μM)處理(5min，37℃)，然后不存在或者存在胰島素(Ins，10nM)或者格列美脲(Gli，20μM，或者增加的濃度)時(shí)溫育(15min，37℃)。然后對(duì)脂肪細(xì)胞測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的脂解。給出相對(duì)于不存在GPI-2350時(shí)的對(duì)照反應(yīng)(欄A，基礎(chǔ)的)或者胰島素-或者格列美脲刺激態(tài)(欄B和C，設(shè)為100)的活性。給出了至少5次獨(dú)立的細(xì)胞溫育與一式三份的活性測(cè)量的平均值+SD。
圖9分離的大鼠脂肪細(xì)胞用0.5mM NBD-FA(60min，37℃)標(biāo)記，洗滌，然后不存在(欄B，D)或者存在GPI-2350(50μM；欄A，C)時(shí)溫育(5min，37℃)，然后用增加濃度的格列美脲(欄A，B)或者胰島素(欄C，D)刺激。不用或者用如所示的異丙基腎上腺素(1μM)溫育(120min，37℃)后，用氯仿/庚烷/甲醇/0.1N HCl(3/3/2/1，按體積計(jì))提取總細(xì)胞懸浮液。通過薄層層析(二乙醚/石油醚/乙酸78/22/1，按體積計(jì))分析有機(jī)相并用NBD-FA作為標(biāo)記平行地進(jìn)行熒光成像。顯示了兩次獨(dú)立的標(biāo)記和溫育的典型實(shí)驗(yàn)，得到了相似結(jié)果。TAG，三?；视汀?br> 圖10GPI蛋白質(zhì)在大鼠脂肪細(xì)胞質(zhì)膜的非DIG區(qū)、hcDIG和lcDIG之間的重新分布機(jī)理，GPI蛋白質(zhì)受到胰島素、格列美脲和膽固醇耗竭的調(diào)節(jié)(涉及GPI-PLC和推定的GPI蛋白質(zhì)受體p115)和它經(jīng)過小窩蛋白、pp125Fak和pp59Lyn到IRS-1的與下游代謝信號(hào)的偶聯(lián)的工作模型。經(jīng)過GPI-PLC和p115的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)在hcDIG的拓?fù)鋵W(xué)、膜取向和錨定類型是假設(shè)的。然而，基于所證明的多數(shù)GPI-蛋白質(zhì)的細(xì)胞表面位置，強(qiáng)烈表明活性位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)分別朝向DIG的細(xì)胞外小葉。小窩蛋白通過鉤狀TM和羧基末端的三倍棕櫚?；?triple paltimoylation)埋入hcDIG的細(xì)胞質(zhì)小葉中，pp59Lyn是通過氨基末端的雙倍酰化作用(dual acylation)埋入的。
權(quán)利要求
1.鑒定調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物GPI-PLC活性的化合物的方法，其中a]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞與格列美脲溫育；b]制備a]的細(xì)胞的hcDIG；c]將來自b]的hcDIG與化合物溫育；d]測(cè)定來自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
2.如權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中步驟a]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物或者狗的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2中要求保護(hù)的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠或者大鼠。
4.如權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中所述步驟a]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人的細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1到4之一中要求保護(hù)的方法，其中所述細(xì)胞是胰細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞或者脂肪細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來自細(xì)胞培養(yǎng)物。
7.如權(quán)利要求1到6中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量pp59Lyn從hcDIG的解離測(cè)定GPI-PLC的活性。
8.如權(quán)利要求1到6中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量pp59Lyn和/或Gce1從hcDIG到IcDIG的重新分布測(cè)定GPI-PLC的活性。
9.如權(quán)利要求1到6中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量pp59Lyn和/或IRS-1的磷酸化的改變測(cè)定GPI-PLC的活性。
10.如權(quán)利要求1到6中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激和/或脂解作用的抑制測(cè)定GPI-PLC的活性。
11.處于所有立體異構(gòu)形式的式I的化合物 其中R1、R2、R3和R4相互獨(dú)立地為H或者OH或F并且R5為(C1-C20)-烷基或者(C2-C20)-烯基，和其所有比例的混合物，和它的生理學(xué)上可耐受的鹽。
12.如權(quán)利要求11中要求保護(hù)的式I的化合物，其中R1、R2、R3和/或R4的任意兩個(gè)相互獨(dú)立地為F。
13.如權(quán)利要求11或12中要求保護(hù)的式I的化合物，其中R1、R2、R3和R4為OH。
14.如權(quán)利要求11、12或13中要求保護(hù)的式I的化合物，其中R5為C12-烷基。
15.如權(quán)利要求11、12、13或14中要求保護(hù)的化合物的制備方法，其包括a]磷酸化外消旋的1，4，5，6-四-O-芐基-肌醇得到四-O-芐基-肌醇-1，2-環(huán)十二烷基-膦酸，b]四-O-芐基-肌醇-1，2-環(huán)-十二烷基膦酸的催化氫化成各自化合物。
16.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求11到14的一項(xiàng)或多項(xiàng)要求保護(hù)的至少一種式I化合物和/或其生理學(xué)上可耐受的鹽和/或前體藥物和藥學(xué)上可接受的載體。
17.如權(quán)利要求11到14的一項(xiàng)或多項(xiàng)要求保護(hù)的式I化合物和/或其生理學(xué)上可耐受的鹽和/或其前體藥物的用途，用于改變用于治療糖尿病的藥物的副作用。
18.如權(quán)利要求17要求保護(hù)的式I化合物的用途，其中所述藥物是格列美脲。
19.如權(quán)利要求11到14的一項(xiàng)或多項(xiàng)要求保護(hù)的式I化合物用于生產(chǎn)藥物組合物的用途，該藥物組合物用于治療用于糖尿病治療的藥物的副作用。
20.如權(quán)利要求19要求保護(hù)的式I化合物的用途，其中所述藥物是格列美脲。
21.鑒定調(diào)節(jié)格列美脲活性的化合物的方法，其中a]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞與格列美脲和化合物的混合物溫育；b]制備a]的細(xì)胞的hcDIG；c]測(cè)定來自c]的hcDIG的GPI-PLC的活性。
22.權(quán)利要求21中要求保護(hù)的方法，其中步驟a]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物或者狗的細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22中要求保護(hù)的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物是小鼠或者大鼠。
24.權(quán)利要求21中要求保護(hù)的方法，其中所述步驟a]的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人的細(xì)胞。
25.權(quán)利要求21到24之一中要求保護(hù)的方法，其中所述細(xì)胞是胰細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、腦細(xì)胞或者脂肪細(xì)胞。
26.權(quán)利要求21中要求保護(hù)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來自細(xì)胞培養(yǎng)物。
27.權(quán)利要求21到26中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量pp59Lyn從hcDIG的解離測(cè)定GPI-PLC的活性。
28.權(quán)利要求21到26中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量pp59Lyn和/或Gce1從hcDIG到IcDIG的重新分布測(cè)定GPI-PLC的活性。
29.權(quán)利要求21到26中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量pp59Lyn和/或IRS-1的磷酸化的改變測(cè)定GPI-PLC的活性。
30.權(quán)利要求21到26中要求保護(hù)的方法，其中通過測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激和/或脂解作用的抑制測(cè)定GPI-PLC的活性。
31.如權(quán)利要求11到14之一要求保護(hù)的式I化合物的用途，用于鑒定跨越脂肪細(xì)胞的質(zhì)膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)期間DIG中的信號(hào)蛋白。
32.如權(quán)利要求11到14之一要求保護(hù)的式I化合物的用途，用于鑒定和表征哺乳動(dòng)物的GPI-PLC突變體和/或相關(guān)的信號(hào)因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物GPI－PLC活性的化合物的方法，其中a]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞與格列美脲溫育；b]制備a]的細(xì)胞的hcDIG；c]將來自b]的hcDIG與化合物溫育；d]測(cè)定來自c]的hcDIG的GPI－PLC的活性。
文檔編號(hào)C07F9/6571GK1981048SQ200580004356
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月20日
發(fā)明者G·米勒, W·弗里克, R·施奈德 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬特德國(guó)有限公司