專利名稱：植物源性醇溶蛋白基質(zhì)薄膜的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用植物源成份的醉溶蛋白基質(zhì)薄膜的用途，可以用作為生物材料。
背景技術(shù)：
醇溶蛋白為谷物中儲(chǔ)存蛋白。該蛋白及其樹(shù)脂具有韌性，疏水性，可降解性，抗菌性等。目前，玉米醇溶蛋白已得到了商業(yè)化應(yīng)用。在醫(yī)療上，有Coleman(2185110，2298548)生產(chǎn)的黏合劑，包扎工具；Cuca(WO94/121578)和Meyer et al(5609909)發(fā)明的口服藥物的掩味劑；化妝品方面，有Avalle(EP 882443)創(chuàng)制的化裝粉，食品上如Glasser(EP 90559)和Wasa et al(WO 99/14076)研制的食品包裝材料；科研領(lǐng)域，有Mathiowitz et al設(shè)計(jì)成功的微球體等。另外，玉米醇溶蛋白的應(yīng)用還涉及口香糖Campbell et al(5164210)、油漆Reiners et al(3840515)、打印油墨Leckley(2570353)、膠卷Wang et al(EP 886177)、可降解性塑料(Lai et al，1997)染發(fā)劑Morawsky et al(5518717)、光纖Freeman(WO 95/01728)和紡織品(Cuq et al，1999)等諸多方面。
目前，有機(jī)合成材料用于組織工程領(lǐng)域，但它們或是機(jī)械性能差；或是吸收速度不合適；或是不容易降解；或是降解后，其產(chǎn)物容易引起機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)。如PLGA，其酸性降解物引起了機(jī)體的炎癥反應(yīng)[Hollinger et al.，1996]；PLA和PGA植入人體后也有遲發(fā)性炎癥反應(yīng)[Bergsma et al.，1995]；HA，在生物體內(nèi)很難被吸收。而一些天然生物性材料多數(shù)不具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，也不能同時(shí)為移植細(xì)胞提供良好的環(huán)境[Hubbell，1995]。目前這類材料如膠原(Nakahara et al.1989)、纖維蛋白(Kawamura et al.，1988)、明膠和甲殼素等作為生物材料，特別是在組織的修復(fù)和再生方面的應(yīng)用已被廣泛研究[Grzesiaket al.，1997；sofia et al.，2001；Pamela et al.，2002；Coombes et al.，2002]，但它們自身多數(shù)機(jī)械強(qiáng)度差，往往須經(jīng)修飾或同其它材料形成復(fù)合物，來(lái)增加機(jī)械強(qiáng)度和生物穩(wěn)定性，但這同時(shí)又不期引起了機(jī)體的免疫反應(yīng)。如用戊二醛修飾后的膠原，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)引起了心臟瓣膜的鈣化[Schoen et al.，1984]。
玉米醇溶蛋白具有極好的機(jī)械強(qiáng)度，用120℃高溫處理3小時(shí)后，經(jīng)圓二相色散和電泳分析得其組成沒(méi)有發(fā)生變化，證明了玉米醇溶蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，可以承受苛刻的加工工藝。此外，玉米醇溶蛋白經(jīng)過(guò)修飾、加工形成可降解的薄膜，要比直接應(yīng)用具有更強(qiáng)的韌性[Padgett et al.，1998]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)薄膜的用途，是利用體外培養(yǎng)技術(shù)鑒定植物源性醇溶蛋白的生物相容性，提供一種利于細(xì)胞貼附，增殖和分化的新型植物源的生物相容性的生物醫(yī)用材料。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)薄膜是一種適合細(xì)胞生長(zhǎng)需要的可降解的生物相容性材料。用作細(xì)胞生長(zhǎng)的生物醫(yī)用材料和細(xì)胞因子載體。所述的細(xì)胞因子是刺激細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)和分化的各類細(xì)胞因子。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)薄膜形態(tài)是微粒子聯(lián)成一片的膜。
所述的微粒子為50-2000nm的微粒子。
所述的植物源性醇溶蛋白是米、小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白。這是玉米醇溶蛋白。
所述的醇是C1-4的醇，推薦乙醇。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白的醇溶液薄膜制備方法可以采用一次加醇或多次加醇的方法分別制得將植物源性醇溶蛋白中加入20-60％醇的水溶液，每毫升溶液中含有0.5-10mg的植物源性醇溶蛋白，最好是每毫升溶液中含有0.5-5mg的植物源性醇溶蛋白，該溶液在板或片上，經(jīng)干燥，形成圓形微粒子。或者將植物源性醇溶蛋白溶解在40-100％的醇溶液中，每毫升溶液中含有0.5-20mg的植物源性醇溶蛋白，再加1-100倍10-40％的醇，最好加入2-10倍10-40％的醇，形成50-500nm微粒子。
將植物源性醇溶蛋白溶解在50-90％的乙醇(0.5-100mg/ml)中，再加2-5倍50-90％的乙醇。超聲波室溫處理2-10分鐘。離心2-10分鐘，干燥形成微粒子聯(lián)成一片的膜，是一種由50-2000nm的微粒子連成一片的膜。
所述的離心機(jī)為100-800rpm。
所述的板可以是玻璃板、陶瓷板、不銹鋼板等，也可以是生物技術(shù)所用的培養(yǎng)板，如24孔培養(yǎng)板，50-300μl/孔。


圖1、L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上3小時(shí)的貼壁率。
圖2、L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上活力(A)3天，(B)6天。
圖3、L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上活力(a)細(xì)胞培養(yǎng)板，(b)顆粒型基質(zhì)，(c)顆粒型膜基質(zhì)。
附圖1表示L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上的對(duì)貼壁率，其中；縱坐標(biāo)-相對(duì)貼壁率，橫坐標(biāo)-0.康尼細(xì)胞培養(yǎng)板，基質(zhì)準(zhǔn)備過(guò)程中，植物源性醇溶蛋白在乙醇中的濃度分別為1.200ul 0.2％(w/v)；2.200ul 0.4％(w/v)；3.200ul 0.8％(w/v)；4.200ul 1.6％(w/v)。
附圖2中采用含有不同濃度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液形成基質(zhì)后，L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上3天(3-1)和6天(3-2)后的活力。其中縱坐標(biāo)-相對(duì)活性，橫坐標(biāo)不同濃度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液-1. 200ul 0.2％(w/v)；2. 200ul 0.4％(w/v)；3. 200ul 0.8％(w/v)；4. 200ul；0. 1.6％(w/v)。
附圖1和2中，小顆粒表示顆粒型基質(zhì)，大顆粒表示顆粒型膜基質(zhì)。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)是一種適合細(xì)胞生長(zhǎng)需要的可降解的生物相容性材料。具體地說(shuō)，利用體外培養(yǎng)技術(shù)鑒定植物源性醇溶蛋白的生物相容性，提供一種利于細(xì)胞貼附，增殖和分化的新型植物源的生物相容性的生物醫(yī)用材料。該材料的原料來(lái)源廣、價(jià)格低廉、工藝要求低。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1玉米醇溶蛋白薄膜制備及細(xì)胞黏附將玉米蛋白溶解在80％的乙醇中配制濃度成2、4、8、16mg/ml，加4倍體積20％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔 供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片 供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成小顆粒型基質(zhì)膜。
將玉米蛋白溶解在70％的乙醇中配制濃度成2、4、8、16mg/ml，加三倍體積70％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔 供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片 供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成大顆粒型基質(zhì)膜。
用含10％FBS，100μg/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝細(xì)胞。將培養(yǎng)至滿瓶的細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化4分鐘，收集細(xì)胞，活細(xì)胞染色和記數(shù)將1滴細(xì)胞懸液與2滴臺(tái)盼藍(lán)混合，滴到記數(shù)板上，2分鐘后記數(shù)。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。用RPMI-1640調(diào)細(xì)胞密度至2.5×105個(gè)細(xì)胞/ml。1ml/孔的細(xì)胞懸液接種到含有上述玉米醇溶蛋白基質(zhì)膜的24孔板中，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于3小時(shí)MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，計(jì)算黏附率(結(jié)果見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例2
玉米醇溶蛋白膜制備及細(xì)胞生長(zhǎng)將玉米蛋白溶解在80％的乙醇中配制成2、4、8、16mg/ml，加4倍體積20％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成小顆粒型基質(zhì)膜。
將玉米蛋白溶解在70％的乙醇中配制成2、4、8、16mg/ml，加三倍體積70％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成大顆粒型基質(zhì)膜。
用含10％FBS，100μg/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝細(xì)胞。將培養(yǎng)至滿瓶的細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化4分鐘，收集細(xì)胞，活細(xì)胞染色和記數(shù)將1滴細(xì)胞懸液與2滴臺(tái)盼藍(lán)混合，滴到記數(shù)板上，2分鐘后記數(shù)。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。用RPMI-1640調(diào)細(xì)胞密度至2.5×105個(gè)細(xì)胞/ml。1ml/孔的細(xì)胞懸液接種到含有上述玉米醇溶蛋白基質(zhì)膜的24孔板中，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于3天、6天用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力(結(jié)果見(jiàn)圖2)。
權(quán)利要求
1一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)薄膜的用途，該薄膜為50-2000nm的微粒子連成一片的薄膜，其特征是用作細(xì)胞生長(zhǎng)的生物醫(yī)用材料和細(xì)胞因子載體。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)植物源性醇溶蛋白基質(zhì)薄膜的用途，其特征是所述的細(xì)胞因子是刺激細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)和分化的各類細(xì)胞因子。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性蛋白基質(zhì)薄膜的用途，其特征是所述的植物源性蛋白是小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性蛋白基質(zhì)薄膜的用途，其特征是所述的植物源性醇溶蛋白薄膜是用醇溶解所述的植物源性醇溶，并在醇溶液中形成微粒子再成膜；或者將上述醇溶解液，在板上干燥后成膜。
4根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物源性蛋白基質(zhì)薄膜的用途，其特征是將上述的溶解植物源性醇溶蛋白的醇溶液用超聲波處理或離心的方法。
5根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物源性蛋白基質(zhì)薄膜的用途，其特征在于下述加醇或多次加醇的方法1)將植物源性醇溶蛋白中加入20-60％醇的水溶液，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，該溶液在板或片上，干燥；2)或者將植物源性醇溶蛋白溶解在40-100％的醇溶液中，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，再加1-100倍10-40％的醇，形成50-500nm的圓形微粒子，干燥；或者；3)將植物源性醇溶蛋白溶解在50-90％的乙醇(0.5-100mg/ml)中，再加2-5倍50-90％的乙醇，超聲波室溫處理2-10分鐘，離心2-10分鐘，干燥。
6根據(jù)權(quán)利要求5述的植物源性蛋白基質(zhì)薄膜的用途，其特征是所述的板是玻璃板、陶瓷板、不銹鋼板或生物技術(shù)所用的培養(yǎng)板。
全文摘要
本發(fā)明是一種將包括小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米在內(nèi)的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)用于細(xì)胞生長(zhǎng)的生物醫(yī)用材料和細(xì)胞因子載體。該蛋白基質(zhì)系由所述的植物源性醇溶蛋白用醇溶解，并進(jìn)一步在醇溶液中形成微粒子，或者將上述醇溶解液，在板上干燥后成膜。本發(fā)明的原料來(lái)源廣、價(jià)格低廉、工藝要求低，提供了一種新的可降解，低免疫原性，抗菌性，具有適當(dāng)機(jī)械強(qiáng)度生物材料。
文檔編號(hào)C07K17/02GK1727471SQ20051007932
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月20日
發(fā)明者王瑾曄, 董鍵 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所