專利名稱：一種Exiguobacterium sp. MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因和用Exiguobacterium sp.MY02菌株制備嘧啶核苷磷酸化酶基因的方法。
背景技術(shù)：
近三十年來，在代謝中起著重要作用的核苷類活性物質(zhì)(包括自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸結(jié)構(gòu)類似物和聚合物)是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、愛滋病等不可缺少的臨床藥物，目前已開發(fā)的核苷類抗病毒化合物已有數(shù)千種。5’-脫氧-5-氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine，5’-dFUrd)是一種良好的抗腫瘤新藥，我國于1995年正式用于臨床，臨床效果好，市場需求量大，目前主要采用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)。但是，在化學(xué)生產(chǎn)過程中(1)首先需要將堿基和核糖殘基的部分基團進行保護；(2)產(chǎn)物為多種核苷異構(gòu)體和其它副產(chǎn)品的混合物，需要進一步分離，因此耗時費力、收率很低(約10％)；(3)對環(huán)境污染嚴重。所以，針對已有生產(chǎn)技術(shù)的缺陷，尋求新型方法滿足大量合成5’-dFUrd的需要成為新的研究熱點。
5-氟尿苷是合成抗癌藥物5’-dFUrd的重要中間體，具有一定的抗癌活性。5-氟尿苷中的核糖在5’位上脫氧后即可得到5’-dFUrd，是一個過程比較簡單的化學(xué)合成步驟。因此，如果能夠建立高效、低污染的5-氟尿苷合成新技術(shù)，則建立5’-dFUrd合成新工藝的瓶頸技術(shù)問題迎刃而解。研究表明，某些嘧啶核苷磷酸化酶(pyrimidine nucleotide phosphorylase，PyNPase)可以表現(xiàn)為較高的轉(zhuǎn)移酶活性，如能夠以5-氟尿嘧啶、尿苷等為底物，通過一步反應(yīng)法催化合成5-氟尿苷。該技術(shù)反應(yīng)條件溫和，易于控制，且對環(huán)境污染小。因此，這種具有較高轉(zhuǎn)移酶活性的嘧啶核苷磷酸化酶PyNPase，是建立5-氟尿苷、乃至5’-dFUrd合成新工藝的理想工具，它的開發(fā)具有重要的應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值。
但是，已報道的各類嘧啶核苷磷酸化酶的轉(zhuǎn)移酶活性不高，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，尋找并發(fā)現(xiàn)新的具有較高轉(zhuǎn)移酶活性的嘧啶核苷磷酸化酶及其基因資源成為解決相關(guān)問題的當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因及其制備方法。
本發(fā)明的內(nèi)容是一種嘧啶核苷磷酸化酶基因，其特征在于它是Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因，核苷酸序列為1 atgcgtatgg tagatttgat tgcaacaaaa cgagacggtg gcgaactcgc aacagctgat 6061 attcaagcaa tggtagaagg attcacgaat ggtgagattc cagattacca aatgtcagcg 120121 atgtcgatgg cgattttcta tcaaggaatg tcagatcgtg aaatcgctga tttgacgatg 180181 gcgatggtca actcgggcga cgtgatcgac ctttcacgta tccacggtaa aaaagtcgat 240241 aaacgctcga caggcggtgt tggtgacaag atcagtctga tcgtcgcacc gctcgttgcg 300301 tcaatcggca ttccggttgc gaagatgagc ggtcgtggac tcggtcatac aggtggaacc 360361 atcgacaaac tcgaagcgtt ccctggtttt gacgtcgagc tttctgaaga agcgttcgtc 420421 tcacaagtca acgacatcaa gatggcgatc atcggtcaaa cgggtaacct gacgcctgca 480481 gacaaaaaac tctacgcatt acgtgacgtc acggcgacgg tcaactcgat cccattgatc 540541 gcaagttcaa tcatgtcgaa aaaaatcgca gcaggagcag acagcatcgt actcgacgtc 600601 aagacaggtt ctggtgcctt catgaaatcg tttgaagatg caaaagcact cgcgacagag 660661 atggtttcaa tcggtaagag tgtcaaccgt aagacggttg ctatcattac agacatggat 720721 cagccgctcg gctttgaaat cggaaacgca aacgaagtca aggaagcgat cgaagtcctt 780781 caagggaaag atgtccgtga cttgaaagtc atcgccttga cgattgcatc acacatggcg 840841 gtcctcggtg atttctaccc gacattcgac gaagcatatg cggatctcga aacacgtctc 900901 ggtaacggag cagcacttga cgtcttcaag aagttcatcg cagcgcaagg tggcgacgcg 960961 tcactcgttg acgatatgac aaaagcactt gaaacgaaat acgaaaaaac attcgtcgct 10201021 tcaaaagcag gttatgtctc tgaaatcatc gctgacgaag tcggtgttgc agcaatgatc 10801081 ctcggtgcag gacgcgtgac gaaagcagat gagatcgatc acgcagcaag cgttacgctg 11401141 cacaagaaag tcggcgatcg tgtcgaagtc ggtgatgtca tcgcaacact tcgttcaaac 12001201 aaagatacac tcgatcaagc aatcgaaaaa atggatcacg cgtaccacat cagtgaaacg 12601261 aaaccggaag cacgtccgct cgtccacgct gtcattcaat aa 1302Exiguobacterium sp.MY02菌株的“嘧啶核苷磷酸化酶基因”總長1302bp，根據(jù)原核生物的基因特征進行判斷，前3個字符“atg”是該基因的起始密碼子，根據(jù)三聯(lián)體密碼規(guī)則依次計算，最后3個字符“taa”是該基因的終止密碼子。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是一種嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法，其特征在于采取以下步驟(1)為克隆得到未知的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因，將該菌株在含有NaCl 0.1-0.2mol/L和牛肉膏重量濃度為0.5-1.0％的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為18-37℃，以100-150r/min的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長后期；(2)按照常規(guī)方法離心得到菌體，使用濃度為10mmol/L、pH值為8.0的Tris-EDTA緩沖液重懸菌體，洗滌2遍后，同樣使用該緩沖液重懸菌體并置于4℃，時間6-8h；(3)繼續(xù)加入溶菌酶至終濃度為10-150mg/mL，并震蕩混勻，37℃溫育1-6h；(4)繼續(xù)按照常規(guī)SDS-酚法制備高分子量基因組DNA，經(jīng)過紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)大于1.8；(5)繼續(xù)以高分子量基因組DNA為材料，使用限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A I在37℃進行30-120min的不完全酶切，酶切后的總DNA經(jīng)含有溴化乙啶的重量百分比為0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為5-10kb的產(chǎn)物區(qū)域，使用刀片切出該產(chǎn)物區(qū)域的凝膠，回收其中的DNA片斷；(6)在無菌條件下以限制性核酸內(nèi)切酶BamH I處理商品化的人工克隆載體pUC18的多克隆位點，將其完全酶切成線性，去磷酸化處理；(7)將回收的DNA片斷與線性載體混合，加入T4 DNA連接酶在16℃連接10-14h，形成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌細胞，得到Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因組DNA文庫，所說的感受態(tài)細菌細胞優(yōu)選大腸桿菌，所說的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電擊轉(zhuǎn)化法；
(8)使用氨芐青霉素濃度為100mg/mL的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)上述基因組DNA文庫中的單克隆，溫度為37℃，以100-150r/min的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長后期，分別以每個單克隆的1μL菌液為模板，使用猜測性的簡并引物進行常規(guī)PCR擴增，引物序列如下5’-GGYGTKCCAGTKGCSAAGATG-3’5’-GAASGCRCCSGCGACCSGTCTT-3進行常規(guī)的PCR擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系與用作模板的單克隆對應(yīng)編號，其中PCR反應(yīng)的條件為94℃預(yù)變性2min，隨后以94℃30s、55-63℃30s、72℃30s進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min；(9)將上述不同PCR反應(yīng)的產(chǎn)物分別進行含有溴化乙啶的重量百分比為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確定在電泳結(jié)果中產(chǎn)物大小約400bp的PCR反應(yīng)體系，根據(jù)步驟(8)所述的對應(yīng)編號確定用作該PCR反應(yīng)體系模板的單克隆，認為該單克隆的重組質(zhì)粒中含有嘧啶核苷磷酸化酶基因，測定外源基因的核苷酸序列；(10)通過使用BLAST軟件，對上述方法所得到的基因序列與生物數(shù)據(jù)庫中的信息進行基因和蛋白質(zhì)的同源性比較，初步判定其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因，所說的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫優(yōu)選美國的數(shù)據(jù)庫。
所述嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法中，步驟(10)中所說的初步判斷其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因以后，繼續(xù)采取以下步驟以確認該基因具有編碼嘧啶核苷磷酸化酶的功能(1)根據(jù)該基因的兩端序列設(shè)計一對引物，其中包括和下一步驟相同的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，以原重組質(zhì)粒為模板進行常規(guī)PCR擴增，引物的序列如下5‘GCACCATGGTAA TGCGTATGGTAGATTTG3’(畫橫線處為Nco I的酶切位點)5‘CCGTCTAGAAATTGAATGACAGC GTGGAC’3’(畫橫線處為Xba I的酶切位點)PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，隨后以94℃30s、55-63℃30s、72℃90s進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min；(2)取出PCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)含有溴化乙啶的重量百分比為0.6-1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，用刀片在紫外燈下切割PCR擴增所產(chǎn)生的大小約1.3kb的DNA帶，進行DNA回收；(3)將回收得到的DNA使用Nco I和Xba I在37℃完全酶切，65℃熱浴10-15min結(jié)束反應(yīng)，12,000×g離心2min；同樣方法處理pBAD g III/A載體；(4)將上述DNA與pBAD g III/A載體構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，其反應(yīng)體系為回收的DNA 15μL，pMD18-T載體0.5μL，T4DNA連接酶1-2μL，總體積30μL；將反應(yīng)體系在16℃反應(yīng)2-16h，形成重組質(zhì)粒；(5)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top 10F’，所說的重組質(zhì)粒選用10μL，所說的感受態(tài)大腸桿菌選用50-150μL；(6)將步驟(5)得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有氨芐青霉素50-100μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-24h，挑選單菌落，在含有相同濃度氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-24h，經(jīng)過堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；(7)使用限制性核酸內(nèi)切酶Nco I在37℃酶切重組質(zhì)粒1.0-4h，65℃熱浴10-15min結(jié)束反應(yīng)，經(jīng)含有溴化乙啶的重量百分比為0.6-1.5％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)酶切產(chǎn)物僅有1條大小大于5kb的DNA帶，說明嘧啶核苷磷酸化酶基因已經(jīng)正確插入該重組質(zhì)粒中阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子的下游；(8)將含有上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌Top10F’培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中，在37℃環(huán)境下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入L-阿拉伯糖至終濃度處于0.5-2.0mmol/L之間，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4℃5000×g離心30min收集菌體，重懸于12mL結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.8/0.5M NaCl)；(9)將上述菌液于冰浴環(huán)境下超聲破碎15min，每作用10s暫停10s；
(10)在4℃環(huán)境下12000×g離心30min去除細胞碎片，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾出液上緩沖液預(yù)平衡后的Ni離子親和層析柱，所說Ni離子親和層析柱優(yōu)選Invitrogen公司產(chǎn)品；(11)用結(jié)合緩沖液和沖洗緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.8/0.5M NaCl)沖洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用體積為5mL和pH值分別為4～6的緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液/0.5M NaCl)進行洗脫，SDS-PAGE檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)分布，合并含分子量約46kD的單一蛋白質(zhì)條帶的洗脫液，認為該蛋白質(zhì)是上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼的重組嘧啶核苷磷酸化酶。
(12)用標準Lowry法測定上述重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑的蛋白質(zhì)濃度，分裝后凍存于-80℃。
所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法中，步驟(12)所說的確定重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑的蛋白質(zhì)濃度以后，繼續(xù)采取如下步驟以測定上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼重組嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性和轉(zhuǎn)移酶活性(1)在干燥無菌容器中，在磷酸鉀鹽濃度為25-40mmol/L、β-巰基乙醇濃度為5mmol/L、EDTA濃度為1-10mmol/L、尿苷濃度為10-100mmol/L的混合液反應(yīng)體系中，加入上述重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑至終濃度0.1-20μg/mL，于37-60℃環(huán)境反應(yīng)下3-12h，加入1mol/L的HCl至終濃度0.1mol/L終止反應(yīng)；相同操作條件下，不加上述重組酶制劑的反應(yīng)體系為對照組。
(2)將反應(yīng)液點于GF254硅膠板上，用二氯甲烷/四氫呋喃溶劑系統(tǒng)展開，在254nm紫外光下檢測化合物的斑點，結(jié)果掃描成圖像并進行分析，表明加入了重組嘧啶核苷磷酸化酶的上述反應(yīng)體系中的底物尿苷發(fā)生了明顯變化，并產(chǎn)生了新的化合物尿嘧啶，而對照組中的底物沒有任何明顯變化；認為這是重組嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性的作用結(jié)果。
(3)在干燥無菌容器中，當(dāng)磷酸鉀鹽濃度為15-40mmol/L、尿苷/5-氟尿嘧啶比值為2.4-3.1時，加入上述重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑至終濃度0.1-10μg/mL，于50-65℃環(huán)境反應(yīng)下3-12h；加入1mol/L的HCl至終濃度0.1mol/L終止反應(yīng)；相同操作條件下，不加上述重組酶制劑的反應(yīng)體系為對照組。
(4)將反應(yīng)液點于GF254硅膠板上，用二氯甲烷/四氫呋喃溶劑系統(tǒng)展開，在254nm紫外光下檢測化合物的斑點，結(jié)果掃描成圖像后進行計算分析，表明加入了重組嘧啶核苷磷酸化酶的上述反應(yīng)體系中的底物5-氟尿嘧啶和尿苷被部分轉(zhuǎn)化生成了5-氟尿苷和尿嘧啶，而對照組沒有任何明顯變化，認為這是重組嘧啶核苷磷酸化酶的轉(zhuǎn)移酶活性的作用結(jié)果。
所述的細菌Exiguobacterium sp.MY02菌株，其16S rRNA的基因序列已經(jīng)被GenBank收錄，收錄號為DQ083948；該菌株已經(jīng)于2005年10月8日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心收藏，其地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號中國科學(xué)院微生物研究所，其保藏編號為CGMCC No.1473。
所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法中的步驟(4)中，用常規(guī)SDS-酚法制備的Exiguobacterium sp.MY02菌株的高分子量基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，所制備的基因組DNA分子量是否大于等于21kb，如果大于等于21kb則進入下一步驟，否則應(yīng)重新制備DNA，直至大于等于21kb。
所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法中，步驟(10)中所說的美國的數(shù)據(jù)庫為GenBank。
本發(fā)明所說的基因和Exiguobacterium sp.255-15菌株嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因輸入美國GenBank數(shù)據(jù)庫進行核苷酸同源性比較，結(jié)果如下Query1atgcgtatggtagatttgattgcaacaaaacgagacggtggcgaactcgcaacagctgat 60|||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||| ||||||Sbjct1atgcgtatggtagatttgattgcaacaaaacgagacggcggcgaattacagactgctgat 60
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上述比較顯示，這兩條基因的一致性達到86％(1128/1302)，表明所克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因不同于Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因。
本基因已經(jīng)被美國GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，收錄號為AY736134.
根據(jù)克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因，按照通常的三聯(lián)體密碼規(guī)律推測出它所編碼的酶蛋白質(zhì)序列，再與Exiguobacteriumsp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因進行同源性比較，結(jié)果如下Query1MRMVDLIATKRDGGELATADIQAMVEGFTNGEIPDYQMSAMSMAIFYQGMSDREIADLTM 60MRMVDLIATKRDGGEL TADI+AMVEGFTNG+IPDYQMSAMSMAIFYQGMSDREIADLTMSbjct1MRMVDLIATKRDGGELQTADIKAMVEGFTNGDIPDYQMSAMSMAIFYQGMSDREIADLTM 60
Query61 AMVNSGDVIDLSRIHGKKVDKRSTGGVGDKISLIVAPLVASIGIPVAKMSGRGLGHTGGT 120AMV SGDVIDLSRIHGKKVDK STGGVGDKISLIVAPLVASIGIPVAKMSGRGLGHTGGTSbjct61 AMVESGDVIDLSRIHGKKVDKHSTGGVGDKISLIVAPLVASIGIPVAKMSGRGLGHTGGT 120Query121 IDKLEAFPGFDVELSEEAFVSQVNDIKMAIIGQTGNLTPADKKLYALRDVTATVNSIPLI 180IDKLEAFPGFDVELSEEAFVSQVNDIKMAIIGQTGNLTPADKKLYALRDVTATVNSIPLISbjct121 IDKLEAFPGFDVELSEEAFVSQVNDIKMAIIGQTGNLTPADKKLYALRDVTATVNSIPLI 180Query181 ASSIMSKKIAAGADSIVLDVKTGSGAFMKSFEDAKALATEMVSIGKSVNRKTVAIITDMD 240ASSIMSKKIAAGADSIVLDVKTGSGAFMKSFEDAKALATEMVSIGKSVNRKT+A+ITDMDSbjct181 ASSIMSKKIAAGADSIVLDVKTGSGAFMKSFEDAKALATEMVSIGKSVNRKTIAVITDMD 240Query241 QPLGFEIGNANEVKEAIEVLQGKDVRDLKVIALTIASHMAVLGDFYPTFDEAYADLETRL 300QPLG EIGNANEVKEAIEVLQGKDVRDLKVIALTIASHMAVLG+FYPTFDEAYADLETRLSbjct241 QPLGNEIGNANEVKEAIEVLQGKDVRDLKVIALTIASHMAVLGEFYPTFDEAYADLETRL 300Query301 GNGAALDVFKKFIAAQGGDASLVDDMTKALETKYEKTFVASKAGYVSEIIADEVGVAAMI 360NGAALDVFKKFIAAQGGDASLVDDMTKALETK+EK FVASKAGYVSEIIADEVGVAAMISbjct301 ANGAALDVFKKFIAAQGGDASLVDDMTKALETKFEKDFVASKAGYVSEIIADEVGVAAMI 360Query361 LGAGRVTKADEIDHAASVTLHKKVGDRVEVGDVIATLRSNKDTLDQAIEKMDHAYHISET 420LGAGR TK D IDHAASVTL KKVGD+VEVGDVIATLRSNK+TLDQAIEKMDHAYHISETSbjct361 LGAGRATKTDVIDHAASVTLFKKVGDKVEVGDVIATLRSNKETLDQAIEKMDHAYHISET 420Query421 KPEARPLVHAVIQ 433KPEARPLVHAVIQSbjct421 KPEARPLVHAVIQ 433其中，Query為克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因推測的氨基酸序列；Sbjct為Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因推測的氨基酸序列；相同的氨基酸以字母表示。
上述比較顯示兩條氨基酸序列的相似性為95％(415/433)，表明Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼的氨基酸序列不同于Sbjct為Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼的氨基酸序列。
將上述結(jié)構(gòu)基因與表達載體連接形成重組載體，轉(zhuǎn)化受體細胞，誘導(dǎo)表達后，純化重組嘧啶核苷磷酸化酶，發(fā)現(xiàn)該基因表達的重組蛋白在聚丙烯酰胺變性凝膠電泳中分子量大約為46kD，與理論推測值相符。
嘧啶核苷磷酸化酶是嘧啶核苷補救代謝途徑中的關(guān)鍵酶。在正磷酸存在下，這類酶能可逆地催化嘧啶核苷磷酸化為游離的堿基和核糖-1-磷酸，這些降解產(chǎn)物被有機體用作碳源、能源及核酸合成中的嘧啶堿基的來源。少數(shù)微生物所含有嘧啶核苷磷酸化酶可以表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移酶活性，如能夠以5-氟尿嘧啶、尿苷及磷酸鹽緩沖液等為底物，通過一步反應(yīng)法催化合成具有較強抗癌活性的化合物5-氟尿苷。因此，具有轉(zhuǎn)移酶活性的嘧啶核苷磷酸化酶具有較高的潛在應(yīng)用價值。
本發(fā)明所提供的嘧啶核苷磷酸化酶基因，所編碼的嘧啶核苷磷酸化酶的轉(zhuǎn)移酶活性高，具有工業(yè)化應(yīng)用的價值，可以彌補已有的同類基因所編碼嘧啶核苷磷酸化酶的轉(zhuǎn)移酶活性不高的不足。


附圖1為權(quán)利要求3所述步驟(2)中所說的1.3kb的嘧啶核苷磷酸化酶基因的DNA帶；附圖2為權(quán)利要求3所述步驟(11)中所說的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼的約36kD大小的單一條帶的重組嘧啶核苷磷酸化酶；附圖3為權(quán)利要求4所述步驟(2)中所說的結(jié)果掃描成的圖像，其中“1”泳道是尿嘧啶的標準品的層析結(jié)果，“2”泳道是所說對照組的層析結(jié)果，“3”泳道是所說加入了重組嘧啶核苷磷酸化酶的反應(yīng)體系的層析結(jié)果；附圖4為權(quán)利要求4所述步驟(4)中所說的結(jié)果掃描成的圖像，其中“1”泳道是5-氟尿嘧啶標準品的層析結(jié)果，“2”泳道是尿嘧啶標準品的層析結(jié)果，“3”泳道是5-氟尿苷標準品的層析結(jié)果，“4”泳道是尿苷標準品的層析結(jié)果，“5”泳道是所說對照組的層析結(jié)果，“6”泳道是所說加入了重組嘧啶核苷磷酸化酶的反應(yīng)體系的層析結(jié)果。
具體實施例方式
以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1嘧啶核苷磷酸化酶基因的克隆和測序通過PCR技術(shù)對Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因組DNA文庫進行篩選，克隆未知的嘧啶核苷磷酸化酶基因，具體操作為在含NaCl重量百分濃度為1％的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Exiguobacterium sp.MY02至對數(shù)末期，提取基因組DNA。使用Sau3A I對該基因組DNA進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收5～8kb的片斷，與用BamH I完全酶切并經(jīng)去磷酸化處理的pUC18質(zhì)粒片段連接。然后將連接產(chǎn)物按照標準的氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞中，在LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素、X-gal、IPTG)上培養(yǎng)。挑取白斑重組菌落，在LB液體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)中培養(yǎng)后，對應(yīng)每個白斑菌落進行編號，分別取1μL菌液用作模板進行PCR反應(yīng)，使用特定引物對UpperA(5’ATGCGTATGGTAGATTTGAT 3’)和LowerA(5’TTATTGAATGACAGCGTGGA 3’)，條件為94℃預(yù)變性2min，隨后以94℃30s、60℃30s、72℃90s進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在1.3kb處顯示有一特異條帶。則根據(jù)上述編號確定含有嘧啶核苷磷酸化酶基因基因的陽性轉(zhuǎn)化子。大量培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子并使用標準堿裂解法提取重組質(zhì)粒，Sanger雙脫氧末端終止法測序。最終通過生物信息學(xué)分析，確定其中存在的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因的核苷酸序列，序列全長1302bp，編碼一個含有433個氨基酸的蛋白質(zhì)序列。
實施例2大腸桿菌表達載體的構(gòu)建根據(jù)所得到的嘧啶核苷磷酸化酶基因序列設(shè)計上游引物(5‘GCACCATGGTAA TGCGTATGGTAGATTTG3’)和下游引物(5‘CCGTCTAGAAATTGAATGACAGCGTGGAC’)，通過PCR擴增得到嘧啶核苷磷酸化酶基因全序列。該PCR的條件為94℃預(yù)變性2min，隨后以94℃30s、60℃30s、72℃90s進行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳顯示1.3kb處有一特異條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下，用Nco I和Xba I酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收1.3kb的DNA片斷。
將大腸桿菌表達載體pBAD gIII/A同樣用Nco I和Xba I酶切，瓊脂糖電泳分離，回收4.1kb的DNA片段，將其與上述所得1.3kp的DNA片段連接后，按照標準的氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用標準的堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoI和Xba I酶切得到1.3kb和4.1kb兩個片段，分別與嘧啶核苷磷酸化酶基因和表達載體pBADgIII/A大小相同，證明嘧啶核苷磷酸化酶基因pynp已經(jīng)克隆到表達載體pBAD gIII/A中，將此重組質(zhì)粒命名為pPNP-A。
實施例3能高效表達嘧啶核苷磷酸化酶的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建將表達載體pPNP-A按照標準的氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10F’中，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用標準的堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoI和Xba I酶切得到1.3kb和4.1kb兩個片段，分別與嘧啶核苷磷酸化酶基因和表達載體pBAD gIII/A大小相同，證明獲得了能高效表達嘧啶核苷磷酸化酶的大腸桿菌重組株pLyase-A/Top10F’。
實施例4利用大腸桿菌重組株生產(chǎn)重組嘧啶核苷磷酸化酶挑取大腸桿菌重組株pPNP-A/Top10F’單克隆接種在2mL含有100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶50接種至100mL含有100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入L-阿拉伯糖至終濃度處于0.5-2.0mmol/L之間，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4℃5000×g離心30min收集菌體，重懸于12mL結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.8/0.5mol/L NaCl)。將菌懸液于冰上超聲破碎細胞15min，每作用10s暫停10s。4℃12000×g離心30min去除細胞碎片，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾出液上緩沖液預(yù)平衡后的PreBondTM column(Invitrogen商品)。用結(jié)合緩沖液和沖洗緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.8/0.5mol/L NaCl)沖洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用5mL pH為6、4等值的緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液/0.5mol/L NaCl)進行洗脫，SDS-PAGE檢測洗脫液中蛋白分布，合并含單一目的條帶的洗脫液。用標準Lowry法測定目的蛋白濃度，分裝后凍存于-80℃。
實施例5利用重組嘧啶核苷磷酸化酶生產(chǎn)5-氟尿苷在玻璃試管等容器中，當(dāng)磷酸鹽濃度為15-40mmol/L，尿苷/5-氟尿嘧啶比值介于2.4-3.1之間時，加入上述實施例4所得到的重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑至終濃度0.1-10μg/mL，于50-65℃環(huán)境反應(yīng)下3-12h，通過高效液相儀檢測并進行計算分析，轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成物5-氟尿苷的最高產(chǎn)率為68％。
權(quán)利要求
1.一種嘧啶核苷磷酸化酶基因，其特征在于它是Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因，核苷酸序列為1atgcgtatgg tagatttgat tgcaacaaaa cgagacggtg gcgaactcgc aacagctgat 6061 attcaagcaa tggtagaagg attcacgaat ggtgagattc cagattacca aatgtcagcg 120121 atgtcgatgg cgattttcta tcaaggaatg tcagatcgtg aaatcgctga tttgacgatg 180181 gcgatggtca actcgggcga cgtgatcgac ctttcacgta tccacggtaa aaaagtcgat 240241 aaacgctcga caggcggtgt tggtgacaag atcagtctga tcgtcgcacc gctcgttgcg 300301 tcaatcggca ttccggttgc gaagatgagc ggtcgtggac tcggtcatac aggtggaacc 360361 atcgacaaac tcgaagcgtt ccctggtttt gacgtcgagc tttctgaaga agcgttcgtc 420421 tcacaagtca acgacatcaa gatggcgatc atcggtcaaa cgggtaacct gacgcctgca 480481 gacaaaaaac tctacgcatt acgtgacgtc acggcgacgg tcaactcgat cccattgatc 540541 gcaagttcaa tcatgtcgaa aaaaatcgca gcaggagcag acagcatcgt actcgacgtc 600601 aagacaggtt ctggtgcctt catgaaatcg tttgaagatg caaaagcact cgcgacagag 660661 atggtttcaa tcggtaagag tgtcaaccgt aagacggttg ctatcattac agacatggat 720721 cagccgctcg gctttgaaat cggaaacgca aacgaagtca aggaagcgat cgaagtcctt 780781 caagggaaag atgtccgtga cttgaaagtc atcgccttga cgattgcatc acacatggcg 840841 gtcctcggtg atttctaccc gacattcgac gaagcatatg cggatctcga aacacgtctc 900901 ggtaacggag cagcacttga cgtcttcaag aagttcatcg cagcgcaagg tggcgacgcg 960961 tcactcgttg acgatatgac aaaagcactt gaaacgaaat acgaaaaaac attcgtcgct 10201021 tcaaaagcag gttatgtctc tgaaatcatc gctgacgaag tcggtgttgc agcaatgatc 10801081 ctcggtgcag gacgcgtgac gaaagcagat gagatcgatc acgcagcaag cgttacgctg 11401141 cacaagaaag tcggcgatcg tgtcgaagtc ggtgatgtca tcgcaacact tcgttcaaac 12001201 aaagatacac tcgatcaagc aatcgaaaaa atggatcacg cgtaccacat cagtgaaacg 12601261 aaaccggaag cacgtccgct cgtccacgct gtcattcaat aa1302Exiguobacterium sp.MY02菌株的“嘧啶核苷磷酸化酶基因”總長1302bp，根據(jù)原核生物的基因特征進行判斷，前3個字符“atg”是該基因的起始密碼子，根據(jù)三聯(lián)體密碼規(guī)則依次計算，最后3個字符“taa”是該基因的終止密碼子。
2.權(quán)利要求1所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法，其特征在于采取以下步驟(1)為克隆得到未知的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因，將該菌株在含有NaCl 0.1-0.2mol/L和牛肉膏重量濃度為0.5-1.0％的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為18-37℃，以100-150r/min的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長后期；(2)按照常規(guī)方法離心得到菌體，使用濃度為10mmol/L、pH值為8.0的Tris-EDTA緩沖液重懸菌體，洗滌2遍后，同樣使用該緩沖液重懸菌體并置于4℃，時間6-8h；(3)繼續(xù)加入溶菌酶至終濃度為10-150mg/mL，并震蕩混勻，37℃溫育1-6h；(4)繼續(xù)按照常規(guī)SDS-酚法制備高分子量基因組DNA，經(jīng)過紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應(yīng)大于1.8；(5)繼續(xù)以高分子量基因組DNA為材料，使用限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A I在37℃進行30-120min的不完全酶切，酶切后的總DNA經(jīng)含有溴化乙啶的重量百分比為0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為5-10kb的產(chǎn)物區(qū)域，使用刀片切出該產(chǎn)物區(qū)域的凝膠，回收其中的DNA片斷；(6)在無菌條件下以限制性核酸內(nèi)切酶BamH I處理商品化的人工克隆載體pUC18的多克隆位點，將其完全酶切成線性，去磷酸化處理；(7)將回收的DNA片斷與線性載體混合，加入T4DNA連接酶在16℃連接10-14h，形成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌細胞，得到Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因組DNA文庫，所說的感受態(tài)細菌細胞優(yōu)選大腸桿菌，所說的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電擊轉(zhuǎn)化法；(8)使用氨芐青霉素濃度為100mg/mL的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)上述基因組DNA文庫中的單克隆，溫度為37℃，以100-150r/min的速度震蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長后期，分別以每個單克隆的1μL菌液為模板，使用猜測性的簡并引物進行常規(guī)PCR擴增，引物序列如下5’-GGYGTKCCAGTKGCSAAGATG-3’5’-GAASGCRCCSGCGACCSGTCTT-3進行常規(guī)的PCR擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系與用作模板的單克隆對應(yīng)編號，其中PCR反應(yīng)的條件為94℃預(yù)變性2min，隨后以94℃30s、55-63℃30s、72℃30s進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min；(9)將上述不同PCR反應(yīng)的產(chǎn)物分別進行含有溴化乙啶的重量百分比為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確定在電泳結(jié)果中產(chǎn)物大小約400bp的PCR反應(yīng)體系，根據(jù)步驟(8)所述的對應(yīng)編號確定用作該PCR反應(yīng)體系模板的單克隆，認為該單克隆的重組質(zhì)粒中含有嘧啶核苷磷酸化酶基因，測定外源基因的核苷酸序列；(10)通過使用BLAST軟件，對上述方法所得到的基因序列與生物數(shù)據(jù)庫中的信息進行基因和蛋白質(zhì)的同源性比較，初步判定其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因，所說的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫優(yōu)選美國的數(shù)據(jù)庫。
3.如權(quán)力要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法，其特征在于步驟(10)中所說的初步判斷其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因以后，繼續(xù)采取以下步驟以確認該基因具有編碼嘧啶核苷磷酸化酶的功能(1)根據(jù)該基因的兩端序列設(shè)計一對引物，其中包括和下一步驟相同的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，以原重組質(zhì)粒為模板進行常規(guī)PCR擴增，引物的序列如下5‘GCACCATGGTAA TGCGTATGGTAGATTTG3’(畫橫線處為Nco I的酶切位點)5‘CCGTCTAGAAATTGAATGACAGC GTGGAC’3’(畫橫線處為Xba I的酶切位點)PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，隨后以94℃30s、55-63℃30s、72℃90s進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min；(2)取出PCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)含有溴化乙啶的重量百分比為0.6-1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，用刀片在紫外燈下切割PCR擴增所產(chǎn)生的大小約1.3kb的DNA帶，進行DNA回收；(3)將回收得到的DNA使用Nco I和Xba I在37℃完全酶切，65℃熱浴10-15min結(jié)束反應(yīng)，12,000×g離心2min；同樣方法處理pBAD gIII/A載體；(4)將上述DNA與pBAD g III/A載體構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，其反應(yīng)體系為回收的DNA 15μL，pMD18-T載體0.5μL，T4DNA連接酶1-2μL，總體積30μL；將反應(yīng)體系在16℃反應(yīng)2-16h，形成重組質(zhì)粒；(5)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top 10F’，所說的重組質(zhì)粒選用10μL，所說的感受態(tài)大腸桿菌選用50-150μL；(6)將步驟(5)得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有氨芐青霉素50-100μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-24h，挑選單菌落，在含有相同濃度氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-24h，經(jīng)過堿裂解法提取其中的重組質(zhì)粒；(7)使用限制性核酸內(nèi)切酶Nco I在37℃酶切重組質(zhì)粒1.0-4h，65℃熱浴10-15min結(jié)束反應(yīng)，經(jīng)含有溴化乙啶的重量百分比為0.6-1.5％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)酶切產(chǎn)物僅有1條大小大于5kb的DNA帶，說明嘧啶核苷磷酸化酶基因已經(jīng)正確插入該重組質(zhì)粒中阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子的下游；(8)將含有上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌Top10F’培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中，在37℃環(huán)境下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入L-阿拉伯糖至終濃度處于0.5-2.0mmol/L之間，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4℃5000×g離心30min收集菌體，重懸于12mL結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.8/0.5M NaCl)；(9)將上述菌液于冰浴環(huán)境下超聲破碎15min，每作用10s暫停10s；(10)在4℃環(huán)境下12000×g離心30min去除細胞碎片，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾出液上緩沖液預(yù)平衡后的Ni離子親和層析柱，所說Ni離子親和層析柱優(yōu)選Invitrogen公司產(chǎn)品；(11)用結(jié)合緩沖液和沖洗緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.8/0.5M NaCl)沖洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用體積為5mL和pH值分別為4～6的緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液/0.5M NaCl)進行洗脫，SDS-PAGE檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)分布，合并含分子量約46kD的單一蛋白質(zhì)條帶的洗脫液，認為該蛋白質(zhì)是上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼的重組嘧啶核苷磷酸化酶；(12)用標準Lowry法測定上述重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑的蛋白質(zhì)濃度，分裝后凍存于-80℃。
4.如權(quán)利要求3所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法，其特征在于在步驟(12)所說的確定重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑的蛋白質(zhì)濃度以后，繼續(xù)采取如下步驟以測定上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所編碼重組嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性和轉(zhuǎn)移酶活性(1)在干燥無菌容器中，在磷酸鉀鹽濃度為25-40mmol/L、β-巰基乙醇濃度為5mmol/L、EDTA濃度為1-10mmol/L、尿苷濃度為10-100mmol/L的混合液反應(yīng)體系中，加入上述重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑至終濃度0.1-20μg/mL，于37-60℃環(huán)境反應(yīng)下3-12h，加入1mol/L的HCl至終濃度0.1mol/L終止反應(yīng)；相同操作條件下，不加上述重組酶制劑的反應(yīng)體系為對照組；(2)將反應(yīng)液點于GF254硅膠板上，用二氯甲烷/四氫呋喃溶劑系統(tǒng)展開，在254nm紫外光下檢測化合物的斑點，結(jié)果掃描成圖像并進行分析，表明加入了重組嘧啶核苷磷酸化酶的上述反應(yīng)體系中的底物尿苷發(fā)生了明顯變化，并產(chǎn)生了新的化合物尿嘧啶，而對照組中的底物沒有任何明顯變化；認為這是重組嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性的作用結(jié)果；(3)在干燥無菌容器中，當(dāng)磷酸鉀鹽濃度為15-40mmol/L、尿苷/5-氟尿嘧啶比值為2.4-3.1時，加入上述重組嘧啶核苷磷酸化酶制劑至終濃度0.1-10μg/mL，于50-65℃環(huán)境反應(yīng)下3-12h；加入1mol/L的HCl至終濃度0.1mol/L終止反應(yīng)；相同操作條件下，不加上述重組酶制劑的反應(yīng)體系為對照組；(4)將反應(yīng)液點于GF254硅膠板上，用二氯甲烷/四氫呋喃溶劑系統(tǒng)展開，在254nm紫外光下檢測化合物的斑點，結(jié)果掃描成圖像后進行計算分析，表明加入了重組嘧啶核苷磷酸化酶的上述反應(yīng)體系中的底物5-氟尿嘧啶和尿苷被部分轉(zhuǎn)化生成了5-氟尿苷和尿嘧啶，而對照組沒有任何明顯變化，認為這是重組嘧啶核苷磷酸化酶的轉(zhuǎn)移酶活性的作用結(jié)果。
5.權(quán)利要求1所述的細菌Exiguobacterium sp.MY02菌株，其特征在于已經(jīng)于2005年10月8日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心收藏，保藏編號為CGMCC No.1473。
6.如權(quán)利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法，其特征在于步驟(4)中，用常規(guī)SDS-酚法制備的Exiguobacterium sp.MY02菌株的高分子量基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，所制備的基因組DNA分子量是否大于等于21kb，如果大于等于21kb則進入下一步驟，否則應(yīng)重新制備DNA，直至大于等于21kb。
7.如權(quán)利要求2中所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制備方法，其特征在于步驟(10)中所說的美國的數(shù)據(jù)庫為GenBank。
全文摘要
一種嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因，其特征在于它是編碼Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因。制備該基因時，首先使用PCR法篩選Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因組DNA文庫并測序，初步確定嘧啶核苷磷酸化酶的基因序列；進一步在大腸桿菌中重組表達該基因、純化重組酶并測定活性，結(jié)果表明所發(fā)明的嘧啶核苷磷酸化酶基因能編碼生產(chǎn)重組嘧啶核苷磷酸化酶，且重組酶不僅具有磷酸化活性還具有較高轉(zhuǎn)移酶活性，具有工業(yè)應(yīng)用價值。
文檔編號C07H21/00GK1800409SQ200510021829
公開日2006年7月12日 申請日期2005年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月9日
發(fā)明者阮期平, 韓文君, 古靜燕, 趙麗 申請人:綿陽師范學(xué)院