專利名稱：治療化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列為三環(huán)內(nèi)酰胺吲哚類和三環(huán)內(nèi)酰胺苯并咪唑類的衍生物并且抑制聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的衍生化合物及其在治療癌癥，特別是乳腺癌中的應(yīng)用。
已經(jīng)證實(shí)同源重組(HR)在修復(fù)哺乳動物細(xì)胞中DNA復(fù)制叉上出現(xiàn)的損害中起重要作用(2)。因此，HR缺陷型細(xì)胞表現(xiàn)出生長停滯并且表現(xiàn)出較高水平的遺傳不穩(wěn)定性。據(jù)信因人體癌癥中HR修復(fù)喪失而導(dǎo)致的遺傳不穩(wěn)定性明顯地造成了這些細(xì)胞中發(fā)生癌癥(1)。
通過對DNA鏈斷裂反應(yīng)的聚(ADP-核糖基)化對核內(nèi)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾DNA修復(fù)、編程性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)和維持基因組穩(wěn)定性方面起重要作用。
聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1)是PARP酶家族中的主要成員且為哺乳動物細(xì)胞中的豐富核蛋白。PARP-1催化使用NAD+作為底物的聚(ADP-核糖)(PAR)聚合物形成。一旦DNA受損，PARP-1快速結(jié)合DNA單鏈斷裂部分(SSB)并且催化帶負(fù)電荷的PAR鏈添加到其自身(自動修飾)和其它蛋白上[有關(guān)綜述參見(3，4)]。據(jù)信PARP-1與SSB的結(jié)合防止DNA損害進(jìn)一步加工，直至由PAR聚合物產(chǎn)生的負(fù)電荷蓄積而使PARP-1與斷裂部分分離(5，6)。
盡管PARP-1涉及幾個核過程，諸如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)、DNA-復(fù)制、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄、PARP-1敲除小鼠發(fā)育正常(7)。從這些小鼠中分離的細(xì)胞表現(xiàn)出超重組表型和增加水平的姊妹染色質(zhì)交換(SCE)、小核和四倍性形式的遺傳不穩(wěn)定性(8，10)。遺傳不穩(wěn)定性也可以通過端?？s短、染色體融合頻率增加和非整倍體而發(fā)生在這些PARP-1敲除小鼠中(11)，不過，所有這些結(jié)果可能都無法在另一組PARP-1敲除小鼠中再現(xiàn)(12)。在前一種小鼠敲除中，PARP-1無效突變挽救了SCID小鼠中受損的V(D)J重組(13)。
這些結(jié)果支持了Lindahl和合作者建議的觀點(diǎn)，即PARP-1對重組具有保護(hù)作用(5)。提出了PARP-1與ssDNA斷裂部分結(jié)合防止了重組結(jié)構(gòu)識別和加工DNA損害，或者，聚(ADP-核糖基)化后蓄積的負(fù)電荷排斥相鄰的重組基因DNA序列。僅后一種模型與抑制PARP-1自身和顯性失活突變體PARP-1的表達(dá)一致，包括SCE、基因擴(kuò)增和同源重組(14-18)。
基于用PARP-1抑制劑治療細(xì)胞或來源于PARP-1敲除小鼠的細(xì)胞的研究表明，抑制PARP-1活性增加了細(xì)胞對DNA損傷劑的敏感性并且抑制鏈斷裂再結(jié)合(3、4、8-11、19、20)。
已經(jīng)將PARP-1活性抑制劑與傳統(tǒng)的癌癥治療方案，諸如放療和化療結(jié)合使用(21)。當(dāng)將所述抑制劑與甲基化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶毒物和電離輻射聯(lián)用時，發(fā)現(xiàn)它們可以促進(jìn)這些治療形式的有效性。然而，這類治療是非選擇性的，并且照此可以對非癌性或“健康”細(xì)胞造成損害并使其死亡。此外，已知這類治療可以產(chǎn)生令人不愉快的副作用。
因此，非常需要提供一種治療癌癥的方法，該方法可以有效和有選擇性地殺傷癌細(xì)胞并且不需要與放療或化療聯(lián)合給予。令人意外地發(fā)現(xiàn)，同源重組(HR)缺陷型細(xì)胞相對于野生型細(xì)胞而言對PARP抑制劑高度敏感。
因此，本發(fā)明的第一個方面提供了具有式I的用于抑制PARP活性的化合物及其藥物上可接受的鹽 本發(fā)明的第二個方面提供了具有式II的用于抑制PARP活性的化合物及其藥物上可接受的鹽
本發(fā)明的第三個方面提供了具有式III的用于抑制PARP活性的化合物及其藥物上可接受的鹽 可以基于WO 00/42040和WO 01/16136中披露的那些合成途徑制備本文所述的化合物。
可以理解當(dāng)指本說明書中式I-III化合物時，應(yīng)將所指視為也可以擴(kuò)展到其藥物上可接受的鹽和其它藥物上可接受的生物前體(前體藥物形式)。本說明書中使用的術(shù)語“前體藥物”用于表示在體內(nèi)可生物降解或修飾的藥物活性化合物的修飾形式或衍生物，以便在哺乳動物治療過程中的給藥后，尤其是在口服或靜脈內(nèi)給藥后轉(zhuǎn)化成所述的活性化合物。通常選擇這類前體藥物是因?yàn)樗诤橘|(zhì)中提高的溶解度有助于克服制劑中的問題，并且在某些情況中，使活性劑相對緩慢或受控釋放。
本文涉及的藥物上可接受的鹽包括金屬鹽、磷酸鹽和季胺類。金屬鹽可以與堿金屬，諸如鋰、鈉或鉀形成。
優(yōu)選以具有下式的藥物上可接受的磷酸鹽形式給予上述式I式I-磷酸鹽 本發(fā)明還涉及本文所述的化合物的治療應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或病患的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或病患的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或病患的藥物中的應(yīng)用。
因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病和病患包括，但不限于癌癥，特別是乳腺癌。
本文涉及的″癌癥″或″腫瘤″包括，但不限于肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、腦癌或皮膚癌。
PARP抑制劑的應(yīng)用特別適合于治療因基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的癌癥，其中所述的基因介導(dǎo)同源重組。這種類型的癌細(xì)胞趨向于HR缺陷。
HR缺陷型腫瘤對PARP抑制的特異性敏感性指的是患者體內(nèi)帶有足量HR的正常分裂的″健康″細(xì)胞基本上不受治療的影響。
使用PARP抑制劑治療的另一個優(yōu)點(diǎn)在于PARP抑制劑不需要作為聯(lián)合療法與常規(guī)化療或放療一起給予，由此避免了與這些常用治療形式相關(guān)的副作用。
介導(dǎo)同源重組的基因中的缺陷可能因編碼涉及HR的蛋白質(zhì)的基因不存在或其表達(dá)缺陷下的突變所致。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式I的化合物在制備用于誘導(dǎo)HR缺陷細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式II的化合物在制備用于誘導(dǎo)缺陷細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式III的化合物在制備用于誘導(dǎo)缺陷細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式I的化合物在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式II的化合物本發(fā)明的另一個方面提供了在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式III的化合物在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
適合于用本文所述的化合物治療的癌細(xì)胞可以為在HR中部分或完全缺陷的。優(yōu)選所述細(xì)胞為在HR中完全缺陷的。
本文所述的化合物可以用于治療遺傳形式的癌癥，其中所治療的患者具有對癌癥的家族因素。然而，所述的化合物特別適合于治療與基因相關(guān)的遺傳性癌，并且最特別的是與基因相關(guān)的遺傳性乳腺癌。
在優(yōu)選的方面中，PARP抑制劑用于治療涉及HR的基因表達(dá)缺陷的癌細(xì)胞。具有在HR中提示的功能的基因包括XRCC1、ADPRT(PARP-1)、ADPRTL2、(PARP02)CTPS、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51β、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCCR、XRCC3、BRCA1、BRCA2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM KU70、RU80、ATM、ATR CHK1、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1、RAD9[參見(2、3、5、22-28)的綜述]。
涉及HR的基因可以為腫瘤抑制基因。本發(fā)明由此提供了治療腫瘤抑制基因表達(dá)缺陷型細(xì)胞的方法。優(yōu)選所述的腫瘤抑制基因?yàn)锽RCA1或BRCA2。
乳腺癌是西方世界婦女中最常見類型的癌癥。某些家族具有強(qiáng)乳腺癌遺傳因素，通常是因BRCA1或BRCA2的一個等位基因遺傳性突變所致。不過，一個功能性等位基因得到維持。因此，具有所述突變的個體正常發(fā)育并且沒有來自這種突變的表型化后果。然而，在一種細(xì)胞中，功能性等位基因可能缺失，使得該細(xì)胞成為癌性且同時HR缺陷。該步驟對腫瘤發(fā)作而言是關(guān)鍵的(1)。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式I的化合物在制備用于治療BRCA1和/或BRCA2表達(dá)缺陷型癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式II的化合物在制備用于治療BRCA1和/或BRCA2表達(dá)缺陷型癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了治療有效量的式III的化合物在制備用于治療BRCA1和/或BRCA2表達(dá)缺陷型癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
所治療的癌細(xì)胞可以為在BRCA1或BRCA2表達(dá)上部分或完全缺陷的?？梢允褂枚嘀豍CR技術(shù)、芯片技術(shù)(29，30)或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它篩選鑒定這類缺陷。特別有用的技術(shù)包括實(shí)時定量RT-PCR、RNA印跡、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡(31、32)。
因此，本發(fā)明的化合物在治療一定范圍選擇的癌瘤方面具有特別的意義，并且本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療患有癌癥的患者的方法。
可以通過有效靶向癌細(xì)胞的任意合適的途徑給予治療有效的無毒性用量的本文所述的化合物。合適的給藥途徑包括，但不限于任意下列途徑口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、鼻內(nèi)或局部。
本文所述的化合物的治療有效量一般為足以獲得所需作用并且可以根據(jù)疾病情況的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及化合物的功效的不同進(jìn)行改變的用量。應(yīng)理解可以將不同濃度用于預(yù)防而非治療活動性疾病。
為了對哺乳動物且特別是對人給藥，預(yù)計活性劑的每日劑量水平在小鼠中為0.01-50mg/kg，而在人中為0.01mg/m2-50mg/m2體表面積。不過，最終給予的活性組分的量和給藥頻率由臨床醫(yī)師決定。
有利的情況是，僅需要極低劑量的抑制PARP的化合物就可以在治療癌癥中具有治療作用，由此減少了化合物的全身蓄積并且將任何相關(guān)的毒性作用減小到最低限度。
盡管能夠?qū)⒈疚乃龅幕衔镒鳛椤湓稀浠衔锝o予，但是優(yōu)選所述化合物存在于藥物組合物中。
制備這類藥物組合物的所有配制方法一般包括將本文所述的化合物之一與構(gòu)成一種或多種輔助組分的載體混合的步驟。通常通過均勻和緊密地將式I的化合物與液體載體或與固體載體細(xì)粉或它們兩者混合，且并且隨后如果必要，使產(chǎn)物形成所需制劑來制備制劑。
可以將適合于口服給藥的本發(fā)明制劑制成分散單位，諸如膠囊、扁囊劑、片劑或錠劑，它們各自含有預(yù)定量的本文所述的化合物之一；制成粉劑或顆粒；或在含水液體或非水液體中的混懸液，諸如糖漿劑、酏劑、乳劑或飲劑。還可以將本文所述的化合物中的任意一種制成大丸劑、藥糖劑或糊劑。
可以通過可選地用一種或多種輔助組分壓制或模制制備片劑。可以通過下列步驟制備壓制片在合適的機(jī)器上壓制自由流動形式的本文所述的化合物，諸如粉末或顆粒，它們可選地混有粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑?？梢酝ㄟ^在合適的機(jī)器上模制本文所述的粉狀化合物中的任意一種與任意合適的載體的混合物來制備模制片。
可以通過將本文所述的化合物添加到例如蔗糖這類糖的濃水溶液中，向其中加入任意所需的輔助組分來制備糖漿劑。這類輔助組分可以包括矯味劑、延緩糖結(jié)晶的試劑或增加任意其它組分的溶解度的試劑，諸如多元醇，例如甘油或山梨醇。
可以將直腸給藥用制劑制成含有常用載體，諸如可可脂的栓劑。
適合于非腸道給藥的制劑便利地包括本文所述化合物中的任意一種的優(yōu)選與接受者血液等滲的無菌含水制劑。
除上述組分外，本發(fā)明的制劑，例如軟膏劑、霜劑等還可以包括一種或多種輔助組分，例如稀釋劑、緩沖劑、矯味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑和/或防腐劑(包括抗氧化劑)或其它藥物上惰性的賦形劑。
還可以將本發(fā)明的化合物制成脂質(zhì)體制劑用于給藥，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法制備脂質(zhì)體制劑。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了藥物組合物，它包括式I的化合物或其藥物上可接受的鹽作為活性組分。
本發(fā)明的另一個方面提供了藥物組合物，它包括式II的化合物或其藥物上可接受的鹽作為活性組分。
本發(fā)明的另一個方面提供了藥物組合物，它包括式III的化合物或其藥物上可接受的鹽作為活性組分。
所述的藥物組合物可以進(jìn)一步包括至少一種其它提供相容性藥物上可接受的添加劑、載體、稀釋劑、載體或賦形劑的組分，并且可以制成單位劑型。
載體必須是藥物上可接受的，其含義是與制劑中的其它組分相容且對其接受者而言無害。
可能的制劑包括那些適合于口服、直腸、局部和非腸道(包括皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))給藥或的對肺或另一吸收部位，諸如鼻道給藥的制劑。
可以將本文涉及的化合物與其它抗癌化合物聯(lián)合給藥。
本發(fā)明還包括治療哺乳動物癌癥的方法，通過給予本文所述的化合物及其藥物上可接受的鹽來進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了治療哺乳動物癌癥的方法，包括給予式I的化合物或其藥物上可接受的鹽。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了治療哺乳動物癌癥的方法，包括給予式II的化合物或其藥物上可接受的鹽。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了治療哺乳動物癌癥的方法，包括給予式III的化合物或其藥物上可接受的鹽。
現(xiàn)在僅通過實(shí)施例并參照附圖來描述本發(fā)明，其中

圖1是表示在有式III的PARP抑制劑存在下的AA8細(xì)胞系、IsrISF細(xì)胞系和CxR3細(xì)胞系中細(xì)胞存活率的示意圖；圖2是表示在有式III的PARP抑制劑存在下的V79細(xì)胞系、VC8細(xì)胞系和VC8B2細(xì)胞系中細(xì)胞存活率的示意圖；圖3是表示在有式I的PARP抑制劑存在下的V79細(xì)胞系、VC8細(xì)胞系和VC8B2細(xì)胞系中細(xì)胞存活率的示意圖；圖4是表示在有式III的PARP抑制劑存在下的VC8、V79、VC8#13和VC8、VC8#13和VC8+B2細(xì)胞系中PARP活性的直方圖；圖5是表示在有式I和III的PARP抑制劑存在下的透入(上圖)和完整(下圖)L1210細(xì)胞中細(xì)胞PARP活性抑制的一對示意圖；圖6是表示在帶有SW620異種移植物的小鼠中使用1mg/kg(上)和10mg/kg(下)式I-磷酸鹽的血液和腫瘤藥動學(xué)和藥效學(xué)的一對直方圖；圖7是表示在帶有SW620異種移植物的小鼠中使用式III的藥動學(xué)和藥效學(xué)的直方圖；圖8是表示在帶有SW620異種移植物的小鼠中用式III與替莫唑胺組合(TMZ)和單獨(dú)使用TMZ治療后腫瘤生長(中位相對腫瘤體積)的示意圖；圖9是表示在帶有SW620異種移植物的小鼠中用式I-磷酸鹽與替莫唑胺組合(TMZ)以及單獨(dú)使用式I-磷酸鹽和TMZ治療后腫瘤生長(中位相對腫瘤體積)的示意圖；圖1表示在用不同濃度的式III化合物治療時，AA8、IrSISF和CxR3細(xì)胞系的存活百分比。發(fā)現(xiàn)式III對缺乏XRCC3的IrSISF最具活性，具有的LC50(殺傷50％細(xì)胞的活性成分濃度)為100nM。
圖2表示在用不同濃度的式III化合物治療時，V79-Z、VC8和VC8B2細(xì)胞系的存活百分比。發(fā)現(xiàn)式III對缺乏BRCA2的VC8細(xì)胞系最具活性，具有的LC50值為43nM，并且LC90(殺傷90％細(xì)胞的活性成分濃度)為1200nM。
圖3表示在用不同濃度的式I化合物治療時，V79-Z、VC8和VC8B2細(xì)胞系的存活百分比。發(fā)現(xiàn)式I對缺乏BRCA2的VC8細(xì)胞系最具活性，具有的LC50值為12nM，LC90為27nM。
圖4表示在用不同濃度的式III化合物治療時各種細(xì)胞系中的PARP活性。將圖3的示意圖分成各相應(yīng)細(xì)胞系的四個結(jié)果組。每組的第一個棒形圖表示背景PARP活性(無寡存，所以PARP活性取決于內(nèi)源性DNA斷裂)，第二個棒形圖為總體可刺激的(通過寡)PARP活性，并且第三和第四個棒形圖表示在有式III化合物存在下的PARP活性。
圖5表示式I和III化合物對PARP活性的影響。
使用于獲得圖5中所示結(jié)果的細(xì)胞透入洋地黃皂甙且然后在有和沒有式I和式III的PARP抑制劑存在下檢測總體可刺激(通過寡)的PARP活性或在透化前接觸所述PARP抑制劑之一20分鐘并檢測總體可刺激PARP活性。
在加入抑制劑前透化細(xì)胞時，式I和式III的化合物在PARP抑制活性方面沒有差異，但式I的化合物在完整細(xì)胞內(nèi)更為有效，可能是因?yàn)樗诩?xì)胞內(nèi)蓄積的程度較高所致。
圖6表示在腹膜內(nèi)給予式I化合物的磷酸鹽后不同時間時，式I化合物的血漿和腫瘤濃度及其對小鼠外周血液淋巴細(xì)胞(pbl parp)和SW620異種移植物(腫瘤PARP)的藥動學(xué)作用。式I化合物的磷酸鹽增加了式I的溶解度。然而，在對動物(包括人)給藥時，血漿磷酸酶將式I的磷酸鹽(式I-磷酸鹽)打斷成母體化合物，即式I。
從圖6中顯然看出在給予10mg/kg的式I-磷酸鹽30分鐘后，在血漿和腫瘤中檢測到了高水平的母體化合物。式I化合物的濃度在血漿中比在腫瘤中更為快速地隨時間下降，并且在給藥后24小時時，在腫瘤中可以檢測到顯著水平，而在血漿中不能檢測到。在pbls和腫瘤中存在PARP活性的顯著和持續(xù)抑制＜50％對照長達(dá)24小時。
在給予1mg/kg的式I-磷酸鹽后，在血漿和腫瘤中均可以發(fā)現(xiàn)較低水平的式I的化合物，且由此存在對PARP活性顯著性較低的作用。
圖7表示在腹膜內(nèi)給予10mg/kg式III的化合物后不同時間時，式III化合物的血漿和腫瘤濃度及其對SW620異種移植物(腫瘤PARP起作用)的藥動學(xué)作用。該化合物還充分分布至腫瘤且優(yōu)選隨時間保留并且類似地抑制腫瘤中的PARP活性。
圖8表示從給予替莫唑胺(temolozomide)20天(每天68mg/g x5)以來，腫瘤異種移植物在尺寸上逐步減小。然而，此后不久腫瘤尺寸開始增加。當(dāng)將式III的化合物與替莫唑胺聯(lián)合給藥(每天5mg/kgx5)時，腫瘤顯著收縮了約15天，直到不可檢測到的尺寸，腫瘤尺寸不可檢測到又保持了50天，此后，它在尺寸上開始增加。當(dāng)給予較大劑量的式III(每天15mg/kg x5)時，腫瘤尺寸不可檢測到又保持了80天，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，此時，在尸檢時不可檢測到腫瘤，即腫瘤完全消退。
圖9表示給予式I-磷酸鹽(0.1mg/kg和1.0mg/kg)與替莫唑胺后圖8中觀察到類似的模式。
表1.本研究中使用的細(xì)胞系基因型和來源
材料和方法PARP抑制劑對HR缺陷型(XRCC3或BRCA2)細(xì)胞的細(xì)胞毒性細(xì)胞培養(yǎng)AA8、irslSF和CXR3細(xì)胞系由Larry Thompson提供[41]。
VC-8、VC-8+B2、VC-8#13為來自Malgorzata Zdienicka的贈品[42]。本研究中所有細(xì)胞系在37℃下和含有5％CO2的氣體中均生長在含有10％胎牛血清和青霉素(100U/ml)和硫酸鏈霉素(100μg/mL)的Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。
毒性試驗(yàn)-克隆形成的存活試驗(yàn)使在6-孔平板中的呈指數(shù)生長的細(xì)胞在培養(yǎng)基中接觸圖2中所示濃度的在1％DMSO中的式III的化合物，或單獨(dú)的1％DMSO，24小時。
胰蛋白酶消化收集細(xì)胞、計數(shù)并以不同密度接種在10cm平皿內(nèi)沒有藥物存在的新鮮培養(yǎng)基中以便菌落形成。
7-10天后，給平皿內(nèi)固定3∶1甲醇∶乙酸并用0.4％結(jié)晶紫染色。
對菌落進(jìn)行計數(shù)并計算相對于1％DMSO對照組治療細(xì)胞的存活率。
PARP活性試驗(yàn)使呈指數(shù)生長的細(xì)胞接觸培養(yǎng)基中的1％DMSO(對照組)，或使圖4中所示濃度的在1％DMSO中的式I或III的化合物接觸用洋地黃皂甙透化的細(xì)胞，或在洗滌和洋地黃皂甙透化前接觸完整細(xì)胞20分鐘。通過在添加平端化寡核苷酸刺激后將[32P]標(biāo)記的NAD+底物引入TCA可沉淀的聚合物，測定PARP活性，并且與非寡核苷酸刺激的細(xì)胞比較。按照相同方式測定來自式III-治療的小鼠的腫瘤勻漿的PARP活性(1∶40等滲緩沖液中)。通過使用10H抗體對聚合物進(jìn)行免疫檢測來測定來自式I-治療的小鼠的pbls和腫瘤勻漿中的PARP活性。簡單的說，將在等滲緩沖液中最高稀釋至1∶1000的腫瘤勻漿與350μM NAD一起保溫6分鐘并印跡在硝酸纖維膜上。在與針對PAR的10H抗體和二抗-小鼠抗體一起保溫后，通過使用Fuji LAS3000UV發(fā)光器進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，經(jīng)參照PAR標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液來對聚(ADP-核糖)(PAR)聚合物形成進(jìn)行定量。通過參照勻漿的測定蛋白含量將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。
當(dāng)然，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于僅通過實(shí)施例描述的上述實(shí)施方案的詳細(xì)描述。
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序列表序列1-PARP-1的人cDNA序列1 cgcccgccca gccccggggg cagggaaagc ctaaattacg gaattaccgc gagcaaggag61 cgcggaatcg gggagcgtcc ggagctagct ggatcctcta ggcaggatgg tgatgggaat121ctttgcaaat tgtatcttct gtttgaaagt gaagtactta cctcagcagc agaagaaaaa181gctacaaact gacattaagg aaaatggcgg aaagttttcc ttttcgttaa atcctcagtg241cacacatata atcttagata atgctgatgt tctgagtcag taccaactga attctatcca301aaagaaccac gttcatattg caaacccaga ttttatatgg aaatctatca gagaaaagag361actcttggat gtaaagaatt atgatcctta taagcccctg gacatcacac cacctcctga421tcagaaggcg agcagttctg aagtgaaaac agaaggtcta tgcccggaca gtgccacaga481ggaggaagac actgtggaac tcactgagtt tggtatgcag aatgttgaaa ttcctcatct541tcctcaagat tttgaagttg caaaatataa caccttggag aaagtgggaa tggagggagg601ccaggaagct gtggtggtgg agcttcagtg ttcgcgggac tccagggact gtcctttcct661gatatcctca cacttcctcc tggatgatgg catggagact agaagacagt ttgctataaa721gaaaacctct gaagatgcaa gtgaatactt tgaaaattac attgaagaac tgaagaaaca781aggatttcta ctaagagaac atttcacacc tgaagcaacc caattagcat ctgaacaatt841gcaagcattg cttttggagg aagtcatgaa ttcaagcact ctgagccaag aggtgagcga901tttagtagag atgatttggg cagaggccct gggccacctg gaacacatgc ttctcaagcc961agtgaacagg attagcctca acgatgtgag caaggcagag gggattctcc ttctagtaaa1021 ggcagcactg aaaaatggag aaacagcaga gcaattgcaa aagatgatga cagagtttta1081 cagactgata cctcacaaag gcacaatgcc caaagaagtg aacctgggac tattggctaa1141 gaaagcagac ctctgccagc taataagaga catggttaat gtctgtgaaa ctaatttgtc1201 caaacccaac ccaccatccc tggccaaata ccgagctttg aggtgcaaaa ttgagcatgt1261 tgaacagaat actgaagaat ttctcagggt tagaaaagag gttttgcaga atcatcacag1321 taagagccca gtggatgtct tgcagatatt tagagttggc agagtgaatg aaaccacaga1381 gtttttgagc aaacttggta atgtgaggcc cttgttgcat ggttctcctg tacaaaacat1441 cgtgggaatc ttgtgtcgag ggttgctttt acccaaagta gtggaagatc gtggtgtgca1501 aagaacagac gtcggaaacc ttggaagtgg gatttatttc agtgattcgc tcagtacaag1561 tatcaagtac tcacacccgg gagagacaga tggcaccaga ctcctgctca tttgtgacgt1621 agccctcgga aagtgtatgg acttacatga gaaggacttt tccttaactg aagcaccacc1681 aggctacgac agtgtgcatg gagtttcaca aacagcctct gtcaccacag actttgagga1741 tgatgaattt gttgtctata aaaccaatca ggttaaaatg aaatatatta ttaaattttc1801 catgcctgga gatcagataa aggactttca tcctagtgat catactgaat tagaggaata1861 cagacctgag ttttcaaatt tttcaaaggt tgaagattac cagttaccag atgccaaaac1921 ttccagcagc accaaggccg gcctccagga tgcttctggg aacttggttc ctctggagga1981 tgtccacatc aaagggagaa tcatagacac tgtagcccag gtcattgttt ttcagacata2041 cacaaataaa agtcacgtgc ccattgaggc aaaatatatc tttcctttgg atgacaaggc2101 cgctgtgtgt ggcttcgaag ccttcatcaa tgggaagcac atagttggag agattaaaga2161 gaaggaagaa gcccagcaag agtacctaga agccgtgacc cagggccatg gcgcttacct2221 gatgagtcag gatgctccgg acgtttttac tgtaagtgtt ggaaacttac cccctaaggc2281 taaggttctt ataaaaatta cctacatcac agaactcagc atcctgggca ctgttggtgt2341 ctttttcatg cccgccaccg tagcaccctg gcaacaggac aaggctttga atgaaaacct2401 tcaggataca gtagagaaga tttgtataaa agaaatagga acaaagcaaa gcttctcttt
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權(quán)利要求
1.具有式I的用于抑制PARP活性的化合物及其藥物上可接受的鹽
2.具有式II的用于抑制PARP活性的化合物及其藥物上可接受的鹽
3.具有下式的用于抑制PARP活性的化合物及其藥物上可接受的鹽
4.權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物為下式的磷酸鹽形式式I-磷酸鹽
5.治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備藥物中的應(yīng)用。
6.治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備藥物中的應(yīng)用。
7.治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備藥物中的應(yīng)用。
8.治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或病患的藥物中的應(yīng)用。
9.治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或病患的藥物中的應(yīng)用。
10.治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療因介導(dǎo)同源重組的基因中的遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病或病患的藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求8-10中任意一項所述的應(yīng)用，其中所述的缺陷在于編碼參與同源重組的蛋白質(zhì)的基因。
12.如權(quán)利要求8-10中任意一項所述的應(yīng)用，其中所述的缺陷是編碼參與同源重組的蛋白質(zhì)的基因的缺失。
13.如權(quán)利要求8-10中任意一項所述的應(yīng)用，其中所述的缺陷存在于編碼參與同源重組的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。
14.治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于誘導(dǎo)同源重組缺陷細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
15.治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于誘導(dǎo)缺陷細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
16.治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于誘導(dǎo)缺陷細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
17.治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
18.治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
19.治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求15-17中任意一項的化合物的應(yīng)用，其中所述的癌癥為與基因相關(guān)的遺傳性癌。
21.治療有效量的式I的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療BRCA1和/或BRCA2表達(dá)缺陷型癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
22.治療有效量的式II的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療BRCA1和/或BRCA2表達(dá)缺陷型癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
23.治療有效量的式III的化合物及其藥物上可接受的鹽在制備用于治療BRCA1和/或BRCA2表達(dá)缺陷型癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求21-23中任意一項的化合物的應(yīng)用，其中待治療的癌細(xì)胞在BRCA1和/或BRCA2表達(dá)上是部分或完全缺陷的。
25.藥物組合物，其包含式I的化合物及其藥物上可接受的鹽作為活性組分。
26.藥物組合物，其包含式II的化合物及其藥物上可接受的鹽作為活性組分。
27.藥物組合物，其包含式III的化合物及其藥物上可接受的鹽作為活性組分。
28.權(quán)利要求25-27中任意一項的藥物組合物，其中該組合物進(jìn)一步包含至少一種稀釋劑和/或載體以及至少一種填充劑。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物，其中所述的載體和/或稀釋劑選自下列單獨(dú)的或組合形式中的任一種鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油和乙醇。
30.治療哺乳動物癌癥的方法，包括給予如權(quán)利要求1中所述的式I的化合物或其藥物上可接受的鹽。
31.治療哺乳動物癌癥的方法，包括給予如權(quán)利要求2中所述的式II的化合物或其藥物上可接受的鹽。
32.治療哺乳動物癌癥的方法，包括給予如權(quán)利要求3中所述的式III的化合物或其藥物上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及三環(huán)內(nèi)酰胺吲哚衍生物和三環(huán)內(nèi)酰胺苯并咪唑衍生物及其在抑制PARP酶活性中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及這些化合物在制備藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07D223/00GK1856313SQ200480027318
公開日2006年11月1日 申請日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者T·赫勒戴, N·柯廷 申請人:癌癥研究技術(shù)有限公司