專利名稱:一種高效分離制備高純度紫杉醇半合成前體的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及紫杉醇半合成前體的分離方法。
背景技術(shù):
紫杉醇(Taxol)是60年代美國(guó)化學(xué)家Wall和Wani首先從太平洋紫杉(短葉紅豆杉Taxus brevifolia)樹(shù)皮中分離出的一種天然二萜類化合物。它由四個(gè)環(huán)組成,分子中具有11個(gè)手性中心和多個(gè)取代基團(tuán),在13位羥基上還帶有一個(gè)氨基醇類的側(cè)鏈,其化學(xué)式如式1所示。
式1由于紫杉醇是一種高效細(xì)胞毒素,具有抑制癌細(xì)胞的生物活性,且作用機(jī)理與一般抗癌藥物不同,近年來(lái)倍受藥物化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注,并且作為一種療效顯著的抗癌藥物在臨床上的使用越來(lái)越廣泛。但是目前紫杉醇僅靠從紅豆杉樹(shù)皮中提取,不僅含量較低,僅約0.01%,每提取1kg紫杉醇就要砍伐1000~2000棵樹(shù),且紅豆杉生長(zhǎng)較緩慢,資源有限,即便將全部天然資源采伐,也只能滿足短期需要。因此,人們長(zhǎng)期以來(lái)一直在研究獲取紫杉醇的其它途徑。概括起來(lái),大致有以下四種途徑①全合成紫杉醇結(jié)構(gòu)復(fù)雜,母核中有9個(gè)手性中心,側(cè)鏈有2個(gè)手性中心,因此應(yīng)有2048個(gè)非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體,它的合成對(duì)有機(jī)化學(xué)家是一種挑戰(zhàn)。雖然經(jīng)過(guò)20多年的努力全合成最終獲得了成功,并具有很重要的學(xué)術(shù)價(jià)值,但是由于合成路線復(fù)雜,步驟煩瑣,大約有30多步,因此目前用全合成的方法提供藥源不太可能。②組織培養(yǎng)該方法是一個(gè)有前途的方法。但總的來(lái)說(shuō),組織培養(yǎng)法還處于研究開(kāi)發(fā)階段,要實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)關(guān)鍵在于想辦法提高細(xì)胞產(chǎn)率。③真菌發(fā)酵在附生于紅豆杉樹(shù)皮的真菌中發(fā)現(xiàn)紫杉醇,是近年來(lái)紫杉醇研究的重要進(jìn)展。就目前的技術(shù)水平而言,從真菌培養(yǎng)液中僅能獲得納克級(jí)的紫杉醇,若要達(dá)到商業(yè)生產(chǎn),必須達(dá)到毫克級(jí)水平。因此,若干技術(shù)問(wèn)題尚需解決。④半合成法紫杉醇的半合成主要是將紅豆杉植物中的紫杉烷成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,得到紫杉醇或具有生物活性的紫杉醇衍生物。較為成功的即是以如式2所示的10-deacetylbaccatinIII(又簡(jiǎn)稱為“10-DAB”)為前體進(jìn)行的紫杉醇半合成首先將10-deacetylbaccatinIII的C7位羥基保護(hù),C10位羥基乙?;?;再在C13位羥基上引入被保護(hù)的側(cè)鏈;最后水解去除側(cè)鏈上的保護(hù)基和C7位上的保護(hù)基而得到紫杉醇。
式2 10-deacetylbaccatinIII在多種紅豆杉植物的可再生枝葉中含量較高,具有紫杉烷的基本母核,作為半合成前體是非常適合的。普遍認(rèn)為半合成方法最有希望在不久的將來(lái)批量生產(chǎn),從而緩解紫杉醇資源緊張,以至最終將替代現(xiàn)有植物提取方法。另外,利用半合成方法,還可以對(duì)紫杉醇及其衍生物進(jìn)行化學(xué)修飾,使其具有更好的制劑性和生物活性。
作為紫杉醇半合成前體,近年來(lái)有關(guān)10-deacetylbaccatinIII的分離方法的研究也倍受科學(xué)家的關(guān)注。如法國(guó)Rhone-Poulenc Rorer的Margraff R.等報(bào)導(dǎo)了用水處理紫杉的適用部位后,得到的水溶液再用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑萃取,然后選擇性結(jié)晶得到75%-90%HPLC純度的10-deacetylbaccatinIII,或用甲醇對(duì)該植物進(jìn)行提取,然后以一定比例的甲醇/水對(duì)萃取物處理,最后通過(guò)選擇性結(jié)晶得到75%-93%HPLC純度的10-deacetylbaccatinIII,該方法較為簡(jiǎn)單,但是得到的目標(biāo)產(chǎn)物純度有限。除此之外,其它報(bào)導(dǎo)大都采用柱色譜分離方法,如硅膠柱等,最后以制備HPLC為精制手段。且絕大部分都以紫杉醇為分離對(duì)象,10-deacetylbaccatinIII是在預(yù)先去除紫杉醇后經(jīng)進(jìn)一步分離得到的副產(chǎn)品,所用原料主要為紫杉樹(shù)皮,所以有些條件并不適合從紫杉枝葉中直接分離提取10-deacetylbaccatinIII。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效分離制備高純度紫杉醇半合成前體的方法,可以用于從紫杉枝葉的提取物中直接分離制備10-deacetylbaccatinIII。
請(qǐng)參考圖1,為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采取以下方案A.拌樣將紫杉枝葉的提取物用甲醇溶解,與纖維素拌樣,拌樣均勻后揮干溶劑,碾磨均勻;B.用C8柱填料填充層析柱層析,用氮?dú)馄考訅海w積百分比為30-50%的乙腈水溶液洗脫,用餾分收集器收集各餾分;C.將含有10-DAB的級(jí)分合并,濃縮后,用步驟A的方法再次拌樣;D.用C18柱填料填充層析柱層析,用氮?dú)馄考訅海w積百分比為20-30%的乙腈水溶液洗脫,用餾分收集器收集各餾分;E.將含有10-DAB的級(jí)分合并、減壓濃縮、真空干燥后,用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步地分離,根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰,收集目標(biāo)級(jí)分;在本步驟中,優(yōu)選鹵代烴-脂肪醇-水組成的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離;其中,鹵代烴可以是氯仿、二氯甲烷或四氯化碳,最優(yōu)選為氯仿;脂肪醇可以是甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇,最優(yōu)選為甲醇。
必要時(shí)溶劑體系中還可以含有正己烷。
進(jìn)行高速逆流色譜分離時(shí),洗脫方式是上相為固定相,下相為流動(dòng)相的正向洗脫方式。
F.目標(biāo)級(jí)分經(jīng)濃縮干燥后,用乙腈或甲醇重結(jié)晶即可得到高純度的10-DAB單體。
在步驟B和D中,優(yōu)選粒徑在30-80μm之間的C8柱和C18柱。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該方法步驟簡(jiǎn)單,效率高,易于重復(fù)。高效液相色譜分析表明,采用該方法分離制備的10-deacetylbaccatinIII純度可達(dá)99%以上。
圖1為本發(fā)明的工藝流程2為實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)C8柱后的1#樣的HPLC圖。
圖3為實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)C18柱后的2#樣的HPLC圖。
圖4為10-DAB標(biāo)準(zhǔn)參考物的定量工作曲線。
圖5為實(shí)施例2中經(jīng)過(guò)二次柱分離后所得2#樣的HSCCC分離譜圖。
圖6為實(shí)施例2中經(jīng)HSCCC分離得到的含10-DAB部分(3#樣)的HPLC分析譜圖。
圖7為實(shí)施例3中3#樣一次重結(jié)晶得到的10-DAB結(jié)晶的HPLC分析圖。
圖8為實(shí)施例3中3#樣一次重結(jié)晶母液的HPLC分析圖。
圖9為實(shí)施例3中二次重結(jié)晶得到的10-DAB結(jié)晶的HPLC圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1紫杉枝葉醇提物的二次柱層析分離將紫杉枝葉的提取物用甲醇溶解,與纖維素拌樣,拌樣均勻后揮干溶劑,碾磨均勻;由于醇提物粗樣成分比較復(fù)雜,采用了兩步柱分離過(guò)程,用氮?dú)馄考訅?,第一步用C8柱和45%(v/v)乙腈水溶液洗脫,第二步采用C18柱和25%(v/v)乙腈水溶液洗脫,用HPLC對(duì)分離過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控,收集目標(biāo)級(jí)分,濃縮干燥,并用參考物對(duì)其中10-DAB含量進(jìn)行定量分析。
40g粗樣經(jīng)過(guò)第一個(gè)C8柱后,平均可得約10g含10-DAB樣;合并四次所得共得約40g樣(1#樣)。再經(jīng)過(guò)第二個(gè)C18柱分離后,平均可得約15g含10-DAB樣(2#樣)。圖2和圖3分別為1#樣和2#樣的HPLC分析譜圖,圖4為10-DAB標(biāo)準(zhǔn)參考物的定量工作曲線。經(jīng)定量分析,1號(hào)樣含10-DAB約0.57%,2#樣含10-DAB約1.5%。
實(shí)施例2柱層析分離后含10-DAB級(jí)分的高速逆流色譜純化如圖3所示,經(jīng)過(guò)兩次柱凈化過(guò)的樣品仍然相當(dāng)復(fù)雜,其中10-DAB含量也只有百分之一左右。此時(shí),可以用柱子繼續(xù)純化下去,但是考慮到其純化效率較低,不過(guò)C18柱后樣品中10-DAB含量?jī)H比過(guò)柱前提高約2.5倍。因此,接下來(lái)采用高速逆流色譜純化。
此時(shí),所用溶劑體系為正己烷-氯仿-甲醇-水(15∶35∶17∶8)。圖5為其中一個(gè)500mg樣品的分離譜圖。圖6給出了逆流色譜純化得到的含10-DAB部分(3#樣)的HPLC分析譜圖。經(jīng)定量分析,經(jīng)過(guò)HSCCC純化可平均得到含10-DAB約24%的純化樣??梢钥闯觯浼兓室戎V高的多。
實(shí)施例3含10-DAB樣品的最終重結(jié)晶經(jīng)HSCCC純化后,10-DAB含量有了明顯提高。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),乙腈重結(jié)晶可以起到驚人的純化效果,經(jīng)HSCCC純化后的樣品經(jīng)一次或兩次重結(jié)晶即可得到高純度的10-DAB。圖7和圖8分別為3#樣經(jīng)重結(jié)晶得到的10-DAB結(jié)晶和母液的HPLC分析圖??梢钥闯?,絕大部分干擾物都留在了母液里。圖9為經(jīng)二次結(jié)晶最終得到的高純度10-DAB的HPLC維分析圖。定量分析表明,其純度可達(dá)99%以上。
為了確認(rèn)所得產(chǎn)物為10-DAB,對(duì)上述結(jié)晶粉末進(jìn)行了快原子轟擊質(zhì)譜FAB-MS,氫譜1HNMR,碳譜13CNMR和KBr紅外IR譜鑒定。
質(zhì)譜鑒定說(shuō)明所得產(chǎn)物的分子量為544,與10-DAB分子量相同。
氫譜鑒定結(jié)果顯示,δ(CDCl3)8.09(2H,dd,J=1.8,8,OBz),7.61(1H,m,J=1.2,7.3,OBz),7.48(2H,t,J=7.6,OBz),5.64(1H,d,J=6.7,2-H),5.25(1H,s,10-H),4.98(1H,dd,J=1.8,9.8,5-H),4.89(1H,t,J=7.3,13-H),4.32(1H,d,J=8,20-H),4.28(1H,m,7-H),4.17(1H,d,J=8,20-H),4.01(1H,d,J=6.7,3-H),2.62(1H,m,6-αH),2.29(3H,s,OAc),2.27(2H,m,14-αH,14-βH),2.07(3H,d,J=1.2,18-CH3),1.83(1H,m,6-βH),1.74(3H,s,19-CH3),1.09(6H,s,16-CH3,17-CH3)。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的10-DAB數(shù)據(jù)基本一致。δ為2.0的最高峰為包夾在結(jié)晶中的乙腈CH3CN上質(zhì)子。
13CNMR分析結(jié)果表明,除了δ為77.0和39.5的峰分別為氘代試劑CDCl3和DMSO中C外,δ為211ppm的峰為分子中唯一的酮基,160~170ppm之間的兩峰為兩個(gè)酯基,150~130ppm之間的七個(gè)峰代表九個(gè)不飽和o,其中兩個(gè)雙鍵C,六個(gè)苯環(huán)C,還有一個(gè)CH3CN的叁鍵C。其它十八個(gè)為飽和C。共二十九個(gè)C與10-DAB相符。
紅外譜圖顯示,在3444cm-1和1706cm-1兩處有強(qiáng)吸收。
以上結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)均證實(shí),所得到的產(chǎn)物確為10-deacetylbaccatinIII。
權(quán)利要求
1.一種紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于以乙腈和水的混合物為流動(dòng)相,先采用C8柱、然后采用C18柱,對(duì)紫杉枝葉的提取物進(jìn)行兩次粗分離;然后對(duì)粗分離后的目標(biāo)級(jí)分采用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化;最后采用重結(jié)晶的方法進(jìn)行精制,得到高純度的10-DAB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于,由以下步驟組成A.拌樣將紫杉枝葉的提取物用甲醇溶解,與纖維素拌樣,拌樣均勻后揮干溶劑,碾磨均勻;B.用C8柱填料填充層析柱層析,用氮?dú)馄考訅?,體積百分比為30-50%的乙腈水溶液洗脫,用餾分收集器收集各餾分;C.將含有10-DAB的級(jí)分合并,濃縮后,用步驟A的方法再次拌樣;D.用C18柱填料填充層析柱層析,用氮?dú)馄考訅?,體積百分比為30-50%的乙腈水溶液洗脫,用餾分收集器收集各餾分;E.將含有10-DAB的級(jí)分合并、減壓濃縮、真空干燥后,用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步地分離,根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰,收集目標(biāo)級(jí)分;F.目標(biāo)級(jí)分經(jīng)濃縮干燥后,用重結(jié)晶的方法進(jìn)行精制,即可得到高純度的10-DAB單體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于所述的C8柱和C18柱的粒徑在30-80μm之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于所述的步驟E中,優(yōu)選鹵代烴-脂肪醇-水組成的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離;其中,鹵代烴可以是氯仿、二氯甲烷或四氯化碳;脂肪醇可以是甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于所述的步驟E中,用氯仿-甲醇-水組成的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于溶劑體系中還含有正己烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于所述的步驟E中,進(jìn)行高速逆流色譜分離時(shí),其洗脫方式是上相為固定相,下相為流動(dòng)相的正向洗脫方式。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于所述的步驟F中,采用乙腈或甲醇進(jìn)行重結(jié)晶。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法,其特征在于所述的步驟F中,采用乙腈進(jìn)行重結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效分離制備高純度紫杉醇半合成前體的方法。以乙腈和水的混合物為流動(dòng)相,先采用C
文檔編號(hào)C07D305/00GK1560042SQ20041000697
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者曹學(xué)麗, 田宇, 董銀卯, 趙華, 陸辛玫 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)