專利名稱：與人成纖維細(xì)胞生長因子有關(guān)的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分泌的低分子量人源蛋白質(zhì)，更具體地，涉及與人成纖維細(xì)胞生長因子家族蛋白相關(guān)的多肽和其他組合物及它們的用途。
背景技術(shù)：
許多低分子量分泌蛋白通過生長刺激作用、生長抑制作用或者通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝途徑對健康和疾病有極大影響。這些分子包括生長因子，細(xì)胞因子，肽激素及類似化合物。生長因子是與細(xì)胞表面受體結(jié)合的蛋白，它的主要效果是激活細(xì)胞增殖或分化。許多生長因子具多效性，在許多不同細(xì)胞類型中刺激細(xì)胞分裂或具有其他效應(yīng)；而另一些對特定細(xì)胞類型或組織是特異的。許多生長因子或來自它們的產(chǎn)物已經(jīng)成為重要藥品，例如促紅細(xì)胞生成素(EPO)、干擾素-α(α-INF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；而許多其他的生長因子，例如，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、腫瘤生長因子-α(TGF-α)、白介素、成纖維細(xì)胞生長因子蛋白等正在深入研究中以了解它們在不同疾病，特別是癌癥中的作用，例如，Jameson，第73-82頁，于Jameson編的《Principles of Molecular Medicine》(Humana Press，Totowa，NJ，1998)一書中。
成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)是一個重要的蛋白家族，包括幾十個成員，有著與多種疾病及多種發(fā)育和生理現(xiàn)象有關(guān)的寬范圍活性，Baird等編，成纖維細(xì)胞生長因子家族，Annals of the New York Academy of Sciences，第638卷(New York Academy of Sciences，New York，1991)；Wilkie等，Current Biology，第5卷第500-507頁(1995)；Szebenyi和Fallon，Internat.Rev.Cytol，第185卷第45-106頁(1999)。近來，F(xiàn)GF家族的一個新成員，命名為“FGF23”，已經(jīng)被描述，據(jù)認(rèn)為它與人的磷酸消瘦病(phosphate wasting disease)有關(guān)，見例如，ADHR Consortium，Nat.Genetics，第26卷第345-348頁(2000)；White等，J.Clin.Endocrin.Metabol.，第86卷第497-500頁(2001)。然而，蛋白的活性形式及它在這些疾病中的準(zhǔn)確作用仍然未知。
活性FGF23多肽和增強或調(diào)節(jié)FGF23生物效應(yīng)的相關(guān)化合物的獲得將通過提供治療磷酸消瘦病的新治療策略滿足本領(lǐng)域的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與人成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF23)多肽和FGF23多肽抗體相關(guān)的組合物、及制備和使用這些組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步包括使用FGF23多肽組合物—包括抗體化合物—治療個體與FGF23多肽異常表達(dá)有關(guān)的病癥的方法。
一方面，本發(fā)明包括具有與SEQ ID NO2序列有至少95％同一性，更優(yōu)選至少98％，甚至更優(yōu)選至少99％同一性的氨基酸序列的多肽。最優(yōu)選地，本發(fā)明包括具有與SEQ ID NO2相同的氨基酸序列的多肽。
另一方面，本發(fā)明包括由6到40個氨基酸組成的分離肽，其序列與具有序列SEQ ID NO1的成熟FGF23多肽中的連續(xù)氨基酸組成的亞序列是同一的。更優(yōu)選地，本發(fā)明包括由6到40個氨基酸組成的分離肽，其序列與SEQ ID NO2的成熟FGF23多肽中由連續(xù)氨基酸組成的亞序列是同一的。這些肽在抗原組合物的生產(chǎn)中是有用的中間體，這些抗原組合物可用于生產(chǎn)對FGF23多肽具特異性的肽抗體。
另一方面，本發(fā)明包括具有選自下組的氨基酸序列的肽SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10及SEQID NO11。
另一方面，本發(fā)明包括對上述任一多肽，肽片段或肽具特異性的分離抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體是單克隆抗體。這些抗體有診斷和治療的用途，特別是在治療與FGF23多肽相關(guān)的疾病中。治療方法包括，但不限于，使用對FGF23多肽抗原特異的抗體或來自抗體的組合物。用于檢測特定組織樣品中的FGF23多肽的診斷方法及用于檢測組織中FGF23多肽的表達(dá)水平的診斷方法也成為本發(fā)明的一部分。
另一方面，本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO2的FGF23多肽的分離多核苷酸。
另一方面，本發(fā)明包括在所選群體中有至少2％頻率的FGF23多肽的天然變體。更優(yōu)選地，這些天然變體在所選群體中有至少5％的頻率，最優(yōu)選地，有至少10％的頻率。所選群體可以是在群體遺傳學(xué)領(lǐng)域中認(rèn)同的任何研究群體。優(yōu)選地，所選群體是高加索人，黑人或亞洲人。更優(yōu)選地，所選群體是法國人、德國人、英國人、西班牙人、瑞士人、日本人、中國人、朝鮮人、華裔新加坡人、冰島人、北美人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希臘人、意大利人、波蘭人、太平洋島嶼上的人、或印度人。
另一方面，本發(fā)明提供含有編碼FGF23多肽的DNA的載體。本發(fā)明也包括含有此載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供生產(chǎn)FGF23多肽的方法，它包括在適宜此FGF23多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞及從細(xì)胞培養(yǎng)物中將此多肽回收。
再一個方面，本發(fā)明包括含有多肽及可藥用載體化合物的藥物組合物和制劑，所述多肽有選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明多肽的氨基酸序列的列表。
定義術(shù)語“多肽”或“肽”或“肽片段”，如本文所用是指由單條氨基酸殘基直鏈組成的化合物，這些殘基通過肽鍵連接。在這些化合物中氨基酸殘基數(shù)目有很大的變化；然而，優(yōu)選地，肽在此處通常指有6到40個氨基酸殘基。多肽和肽片段在此處通常指有幾十個氨基酸殘基(如20個)到幾百個氨基酸殘基(如200或更多個)。一般地，用重組DNA方法生產(chǎn)多肽更方便。
術(shù)語“蛋白”，如本文所用，可用作術(shù)語“多肽”的同義詞，或者，也可以指兩個或多個多肽通過肽鍵以外的鍵連接而成的復(fù)合體，例如，構(gòu)成蛋白的多肽可以通過二硫鍵連接。術(shù)語“蛋白”也可以理解為有同一氨基酸序列但不同翻譯后修飾的多肽家族，翻譯后修飾為例如磷酸化、?；?、糖基化等，特別是當(dāng)這些蛋白在真核宿主中表達(dá)時可加上所述修飾。
此處氨基酸殘基用它們的標(biāo)準(zhǔn)單字母或三字母符號表示A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；K，賴氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；V，纈氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。
關(guān)于雙螺旋的“完全匹配”是指組成雙螺旋的多或寡核苷酸鏈彼此形成雙鏈結(jié)構(gòu)，以至于每條鏈上的每個核苷酸都與另一條鏈上的一個核苷酸形成沃森-克里克堿基配對。此術(shù)語也可理解為指可以使用的核苷類似物的配對，所述類似物為例如脫氧肌苷、有2-氨基嘌呤堿基的核苷等。關(guān)于三螺旋，此術(shù)語是指由完全匹配的雙螺旋與第三鏈組成的三螺旋，其中第三鏈的每個核苷酸與完全匹配的雙螺旋的堿基對一起形成Hoogsteen或反向Hoogsteen連接。相反地，雙螺旋中標(biāo)記物與核苷酸間的“錯配”是指雙螺旋或三螺旋中的核苷酸對或核苷酸三體沒能形成沃森-克里克和/或Hoogsteen和/或反向Hoogsteen鍵合。
參照序列與另一序列(即，“候選”序列)對比中使用的術(shù)語“同一性百分?jǐn)?shù)”或類似術(shù)語，是指兩個序列間最佳比對時，在個數(shù)相當(dāng)于所給百分?jǐn)?shù)的多個亞單位位置上候選序列與參照序列是同一的，亞單位是指用于多核苷酸對比的核苷酸或用于多肽對比的氨基酸。如本文所用，被比序列的“最佳比對”是指在構(gòu)建比對時使亞單位間的匹配達(dá)到最大且所用的空位(gap)數(shù)目最小。用商業(yè)上的算法執(zhí)行工具(Wisconsin序列分析軟件包的“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)可以確定同一性百分?jǐn)?shù)，所述算法見Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，第48卷第443-453頁(1970)。本領(lǐng)域內(nèi)用于構(gòu)建比對和計算同一性百分?jǐn)?shù)或用于相似性的其他測量的其他軟件包包括基于Smith和Waterman的算法(Advances in Applied Mathematics，第2卷第482-489頁(1981))的“BestFit”程序(Wisconsin序列分析軟件包，Genetics Computer Group，Madison，WI)。也就是說，例如，為了獲得具有與參照氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，可以將參照序列中不超過5％的氨基酸殘基缺失或用其他氨基酸替換，或者可以將不超過參照序列中總氨基酸殘基數(shù)的5％的氨基酸插入到參照序列中。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基端位置，或者這兩端位置之間的任何地方，單個地散布在參照序列的殘基之間或以一個或多個連續(xù)組的形式分散于參照序列中。應(yīng)當(dāng)理解，在與本發(fā)明參照序列對比時，候選序列可以是更大的多肽或多核苷酸的組分或片段，并且用于計算同一性百分?jǐn)?shù)目的的這種對比將就相關(guān)組分或片段進(jìn)行。
本發(fā)明多肽或多核苷酸中涉及的術(shù)語“分離的”是指從其天然環(huán)境的成分中基本上分離出來。優(yōu)選地，分離的多肽或多核苷酸是由與其天然環(huán)境的成分相比至少8％重量的、序列定義的多肽或多核苷酸組成的組合物；更優(yōu)選地，此組合物由與其天然環(huán)境的成分相比至少95％重量的、序列定義的多肽或多核苷酸組成；甚至更優(yōu)選，此組合物由與其天然環(huán)境的成分相比至少99％重量的、序列定義的多肽或多核苷酸組成。最優(yōu)選地，分離的多肽或多核苷酸是通過基于分子量和等電點的雙向凝膠電泳常規(guī)分離之后可以解析為單個點的均一組合物。用常規(guī)雙向凝膠電泳進(jìn)行此分析的操作方案是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，Hames和Rickwood，編，GelElectrophoresis of ProteinsA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1981)；Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，New York，1982)；Rabilloud，編，Proteome ResearchTwo-Dimensional Gel Electrophoresisand Identification Methods(Springer-Verlag，Berlin，2000)。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”是指有天然或修飾的單體或鍵的線性寡聚體，包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其端基異構(gòu)體形式、肽核酸(PNAs)等；這些寡核苷酸能以單體-單體相互作用的常規(guī)模式，例如，Watson-Crick型堿基配對、堿基堆積、Hoogsteen或反向Hoogsteen型堿基配對等與多核苷酸特異結(jié)合。通常，單體通過磷酸二酯鍵或其類似物相連，以形成大小從幾個單體單位(例如3-4個)到幾十個單體單位(如40-60個)的寡核苷酸。當(dāng)寡核苷酸或多核苷酸以字母序列，例如“ATGCCTG”，或等價的小寫字母表示時，除非上下文另有說明或不同理解，應(yīng)理解為核苷酸從左到右是5′→3′順序，“A”代表脫氧腺苷，“C”代表脫氧胞苷，“G”代表脫氧鳥苷，“T”代表脫氧胸苷，“U”代表尿苷。通常，本發(fā)明寡核苷酸含有四種天然核苷酸，一個與另一個之間以天然磷酸二酯鍵相連；然而它們也可含有非天然核苷酸類似物并且還可以含有非天然核苷間連接鍵，尤其在用作反義或診斷組合物時。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，當(dāng)含有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸可以根據(jù)本發(fā)明使用時，在例如需要用酶處理的情況下，通常需要由天然核苷酸組成的寡核苷酸。
如本文所用，“核苷”包括天然核苷，包括2′-脫氧和2′-羥基形式，例如在Kornberg和Baker，DNA Replication，第二版(Freeman，SanFrancisco，1992)中所描述的。核苷“類似物”包括含有修飾堿基部分和/或修飾糖部分的合成核苷，如Scheit，Nucleotide Analogs(John Wiley，NewYork，1980)；Uhlman和Peyman，Chemical Reviews，第90卷第543-584頁(1990)等中所述的，唯一的條件是它們能進(jìn)行特異雜交。這些類似物包括設(shè)計用于增強結(jié)合特性、降低復(fù)雜度、增強特異性等的合成核苷。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括FGF23多肽及其相關(guān)組合物，此組合物包括但不限于編碼FGF23多肽或其片段的寡核苷酸、對FGF23多肽或其片段特異的抗體、含有本發(fā)明多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體和載體以及用于復(fù)制FGF23多肽轉(zhuǎn)錄本或用于表達(dá)FGF23多肽的含有此類重組DNA構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也包括藥物組合物，其含有FGF23多肽、其激動劑或拮抗劑，特別是衍生自對FGF23多肽組合物特異的單克隆抗體的拮抗劑。
本發(fā)明的FGF23多肽及肽片段包括天然和人工變體，所述變體的氨基酸序列因一或多個替換、插入或缺失而與序列表中的參照氨基酸序列不同。這些變體通常通過用盒式或PCR誘變或本領(lǐng)域其他技術(shù)在編碼FGF23多肽或肽片段的DNA中進(jìn)行核苷酸位點特異誘變以產(chǎn)生編碼變體的DNA、然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)此DNA來制備，見下面更完全的描述。變體FGF23多肽也可以用下述的常規(guī)肽合成技術(shù)或匯集合成技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成。
通過使用本發(fā)明寡核苷酸及分析技術(shù)對所選群體中的個體進(jìn)行篩選可以獲得本發(fā)明多肽的天然變體。優(yōu)選地，用PCR或類似技術(shù)擴增含有全部或部分基因組區(qū)域的基因組區(qū)域，之后用常規(guī)方法對擴增序列測序，或者用常規(guī)技術(shù)在特定基因座對擴增序列進(jìn)行分析，例如Taylor，編，Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms inDNA(CRC Press，1997)；Landegren，編，Laboratory Protocols forMutation Detection(Oxford University Press，1996)；Shi，Clinical Chem.，第47卷第164-172頁(2001)；Pastinen等，Genome Res.，第10卷第1031-1042頁(2000)；Armstrong等，Cytometry，第40卷第102-108頁(2000)；Mein等，Genome Res.，第10卷第330-343頁(2000)；Li等Electrophoresis，第20卷第1258-1265頁(1999)等。然后此序列與本發(fā)明多核苷酸對比以確定是否出現(xiàn)影響編碼蛋白的變異。優(yōu)選地，F(xiàn)GF23多肽的天然變體在所選群體中有至少2％的頻率，更優(yōu)選地，此天然變體在所選群體中有至少5％的頻率，甚至更優(yōu)選，至少10％的頻率。最優(yōu)選地，此天然變體在所選群體中有至少20％的頻率。所選群體可以是群體遺傳學(xué)領(lǐng)域中認(rèn)同的任何研究群體。優(yōu)選地，所選群體是高加索人，黑人或亞洲人。更優(yōu)選地，所選群體是法國人、德國人、英國人、西班牙人、瑞士人、日本人、中國人、愛爾蘭人、朝鮮人、新加坡人、冰島人、北美人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希臘人、意大利人、波蘭人、太平洋島嶼上的人、芬蘭人、挪威人、瑞典人、愛沙尼亞人、澳大利亞人或印度人。更優(yōu)選地，所選群體是冰島人、拉普蘭人(Saami)、芬蘭人、有高加索人血統(tǒng)的法國人、瑞士人、華裔新加坡人、朝鮮人、日本人、魁北克人(Quebecian)、北美皮瑪印第安人、Pennsylvanian Amish和Amish Mennonite、紐芬蘭人或波利尼西亞人。優(yōu)選的，所選群體由至少500個個體樣本組成，更優(yōu)選地，所選群體由至少1000個個體樣本組成，最優(yōu)選地，由至少2000個個體樣本組成。
FGF家族成員的特征在于多種多樣與生長和發(fā)育相關(guān)的生物活性，見例如Szebenyi等(上面引文)；Baird等(上面引文)，包括在中胚層來源細(xì)胞中的促分裂活性及在胚胎組織中的形態(tài)發(fā)生活性。FGF對其有促分裂作用的細(xì)胞類型包括NIH3T3細(xì)胞、BaF3細(xì)胞、人包皮成纖維細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、人羊膜成纖維細(xì)胞和人表皮細(xì)胞，Gospodarowicz等.In Vitro，第14卷第85-118頁(1978)；Ornitz等，J.Biological Chemistry，第271卷第15292-15297頁(1996)；此文獻(xiàn)中有關(guān)FGF促分裂活性的分析的描述通過參考并入此處。
FGF23多肽的重組制備本文中描述的多核苷酸序列可用在重組DNA分子中，該DNA分子可在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)相應(yīng)多肽表達(dá)。由于遺傳密碼的簡并性，其他DNA序列也可編碼相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?，也可用于克隆和表達(dá)FGF23多肽。為了增加表達(dá)速率和/或效率，可以選擇特定宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子并通過替換放入自然發(fā)生的核苷酸序列中。編碼目的FGF23多肽的核酸(例如，cDNA或基因組DNA)可以插入用于克隆(擴增DNA)或用于表達(dá)的復(fù)制載體內(nèi)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，多肽可以在多種表達(dá)系統(tǒng)的任一種中重組表達(dá)(Ausubel等，編，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，1990)。合適的宿主細(xì)胞包括酵母、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、昆蟲和動物細(xì)胞，包括哺乳動物細(xì)胞，例如原代細(xì)胞，包括干細(xì)胞，包括但不限于骨髓干細(xì)胞。更具體的，它們包括但不限于，微生物例如被重組噬菌體、質(zhì)粒或柯斯質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，和被酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母。也包括被重組昆蟲病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)?？梢杂酶鞣N不同的方法將待表達(dá)的核酸序列插入載體中。一般地，用本領(lǐng)域已知技術(shù)把DNA插入合適的限制性內(nèi)切酶位點。載體成分一般包括，但不限于，一個或多個信號序列、復(fù)制起點，一個或多個標(biāo)記基因、增強子元件、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)構(gòu)建含有一個或多個此類成分的合適載體。
通過在可以誘導(dǎo)或引起本發(fā)明FGF23蛋白表達(dá)的合適條件下，培養(yǎng)被含有編碼FGF23多肽的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以生產(chǎn)本發(fā)明的FGF23多肽。適于FGF23多肽表達(dá)的條件隨表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的選擇而變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗可以容易地確定此條件。例如，表達(dá)載體中使用組成型啟動子時需要優(yōu)化宿主細(xì)胞的生長和增殖，而使用誘導(dǎo)型啟動子時需要用于誘導(dǎo)的合適生長條件。另外，在一些實施方案中，收獲時間的選擇是重要的。例如，在昆蟲細(xì)胞表達(dá)中使用的桿狀病毒系統(tǒng)是裂解病毒，因此對產(chǎn)品產(chǎn)量而言收獲時間的選擇是至關(guān)重要的。
宿主細(xì)胞株系可以基于其以所期望的方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)的能力或者加工表達(dá)蛋白的能力選擇。這些蛋白修飾包括但不限于，?；?、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、乙?；?。切割蛋白的“前蛋白原”形式的翻譯后加工對正確插入、折疊和/或功能也可能是重要的。例如，宿主細(xì)胞例如CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、W138等對此翻譯后活性有特定的細(xì)胞機器和特征機制，可對其進(jìn)行選擇以確保引入的外源蛋白的正確修飾和加工。特別有意義的是果蠅(Drosophia melangaster)細(xì)胞、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其他酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)、SF9細(xì)胞、C129細(xì)胞、293細(xì)胞、鏈孢霉(Neurospora)、BHK、CHO、COS和HeLa細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)鞘瘤(schwanoma)細(xì)胞系、哺乳動物永生化髓樣和淋巴樣細(xì)胞系、Jukat細(xì)胞、人細(xì)胞和其他原代細(xì)胞。
編碼FGF23多肽的核酸必須是“可操作連接的”，即使其與另一核酸序列產(chǎn)生功能性關(guān)系。例如，將編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與編碼多肽的DNA可操作地連接，這樣多肽可以表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白形式；將啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，這樣它們可影響序列的轉(zhuǎn)錄；或者將核糖體結(jié)合位點與編碼序列可操縱地連接，這樣此核糖體結(jié)合位點的放置將利于翻譯進(jìn)行。通常，“可操作連接的”DNA序列是鄰接的，并且，對于分泌前導(dǎo)序列而言，是鄰接的且在閱讀框中。然而，增強子不必是鄰接的。結(jié)合通過在合適限制位點的連接完成。如果這些位點不存在，可以根據(jù)常規(guī)的實踐方法使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。啟動子序列編碼組成型或誘導(dǎo)型啟動子。啟動子可以是天然的啟動子或雜合啟動子。雜合啟動子組合一個以上啟動子的元件，也是本領(lǐng)域已知的，并且在本發(fā)明中是有用的。表達(dá)載體可以含有附加元件，例如，表達(dá)載體可以有兩個復(fù)制系統(tǒng)，因此允許其在兩種生物體中保持，例如在哺乳動物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)并在原核宿主中克隆和擴增。表達(dá)和克隆載體都含有能使載體在一種或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。對于各種細(xì)菌、酵母和病毒，這些序列是已知的。來自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點對大多數(shù)革蘭氏陰性菌是合適的，2質(zhì)粒復(fù)制起點對酵母是合適的，各種病毒復(fù)制起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)對哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的克隆載體是有用的。另外，對整合表達(dá)載體，表達(dá)載體在表達(dá)構(gòu)建體的兩側(cè)含有至少一個與宿主細(xì)胞基因組同源的序列，優(yōu)選地，有兩個同源序列。通過選擇合適的同源序列包括在載體中，整合載體可以被引入宿主細(xì)胞內(nèi)的特異位點。整合載體的構(gòu)建是本領(lǐng)域已知的。
優(yōu)選地，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記基因以允許選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。選擇基因是本領(lǐng)域已知的，并因所用宿主細(xì)胞不同而不同。表達(dá)和克隆載體典型地含有選擇基因，也稱為選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼如下蛋白(a)賦于對抗生素或其他毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素的抗性的蛋白，(b)彌補營養(yǎng)缺陷型的缺陷的蛋白，或者(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒有的關(guān)鍵營養(yǎng)成分的蛋白，例如，編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
編碼前列腺腫瘤抗原的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在適合于從細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和回收此編碼蛋白的條件下培養(yǎng)。根據(jù)所用的序列和/或載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可以是分泌的、膜結(jié)合的或胞內(nèi)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以設(shè)計帶有信號序列的、含有編碼FGF23多肽的多核苷酸的表達(dá)載體，此信號序列將引導(dǎo)FGF23多肽分泌穿過原核或真核細(xì)胞膜。目的FGF23多肽不但可以直接地而且可以與異源多肽形成融合多肽進(jìn)行重組表達(dá)，此異源多肽可以是在成熟蛋白或多肽的N端有特異切割位點的信號序列或其他多肽?？傊?，信號序列可以是載體的組分，或者可以是插入載體中的編碼FGF23多肽的DNA的一部分。信號序列可以是原核信號序列，例如，選自堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素∏的前導(dǎo)序列。對于酵母中的分泌，信號序列可以是，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)α-因子前導(dǎo)序列，后者在美國專利號5,010,182中有描述)，或者酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌(C albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP362，179，1999年4月4日出版)，或WO90113646(1990年11月15日出版)中描述的信號序列。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，哺乳動物信號序列可用于引導(dǎo)蛋白分泌，例如來自同一或相關(guān)物種的分泌多肽的信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列。根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng)，將編碼序列插入合適載體中，而載體可能需要某些特征性“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”的存在。合適的構(gòu)建體通常是本領(lǐng)域已知的(Ausubel等，1990)，在許多情況下，能從供應(yīng)商，例如Invitrogen(San Diego，Calif.)，Stratagene(LaJolla，Calif.)，Gibco BRL(Rockville，Md.)或者Clontech(Palo Alto，Calif.)處獲得。
在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)?？梢杂每烧T導(dǎo)啟動子例如“BLUESCRIPT”噬粒(stratagene)或“pSPORT1”(Gibco BRL)的雜合LacZ啟動子使細(xì)菌細(xì)胞得以轉(zhuǎn)化。另外，有許多表達(dá)載體可供選擇用于細(xì)菌細(xì)胞中以生產(chǎn)能被容易地檢測和/或純化的可切割融合蛋白，所述載體包括但不限于“BLUESCRIPT”(α-半乳糖苷酶；stratagene)或pGEX(谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶；Promega，Madison，Wis.)。合適的細(xì)菌啟動子是能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼FGF23多肽序列的基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何核酸序列。細(xì)菌啟動子有通常位于編碼序列5′端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。這個轉(zhuǎn)錄起始區(qū)典型地包括RNA聚合酶結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄起始位點。編碼代謝途徑酶的序列提供了特別有用的啟動子序列。例子包括來自糖(例如半乳糖、乳糖、麥芽糖)代謝酶的啟動子序列；以及來自生物合成酶例如色氨酸生物合成酶的序列。也可以使用來自噬菌體的啟動子，其是本領(lǐng)域已知的。另外，合成的啟動子及雜合啟動子也是可用的；例如，tat啟動子是trp和lac啟動子序列的雜合體。還有，細(xì)菌啟動子也可以包括能與細(xì)菌RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的非細(xì)菌來源的天然啟動子。也可能需要存在有效的核糖體結(jié)合位點。表達(dá)載體也可以包括引導(dǎo)前列腺腫瘤抗原蛋白在細(xì)菌中分泌的信號肽序列。信號序列典型地編碼引導(dǎo)蛋白從細(xì)胞中分泌的、由疏水氨基酸組成的信號肽，這是本領(lǐng)域已知的。蛋白可以分泌到生長培養(yǎng)基(革蘭氏陽性菌)或者分泌到周質(zhì)間隙—位于內(nèi)外細(xì)胞膜之間(革蘭氏陰性菌)。細(xì)菌表達(dá)載體也可以包括允許篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)菌株的可選擇標(biāo)記基因。合適的選擇基因包括藥物抗性基因例如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素、新霉素和四環(huán)素抗性基因。選擇標(biāo)記也包括生物合成基因，例如組氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途經(jīng)中的基因。當(dāng)需要大量FGF23多肽，例如用于誘導(dǎo)抗體時，可能需要能指導(dǎo)容易純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。這些載體包括但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體例如BLUESCRIPT(stratagene)，其中編碼前列腺腫瘤抗原的序列可以與編碼β-半乳糖苷酶的氨基端Met及隨后的7個殘基的序列以符合閱讀框的形式一起連入載體，以產(chǎn)生雜合蛋白；PIN載體[Van Heeke & SchusterJ.Biol.Chem第264卷第5503-5509頁1989]；PET載體(Novagen，MadisonWis)；及類似的載體。細(xì)菌表達(dá)載體包括上面列出的各種成分，并是本領(lǐng)域已知的。例子包括枯草芽孢桿菌的載體、大腸桿菌的載體，乳脂鏈球菌(Streptococcus cremovis)的載體、Streptococcus lividans的載體等等。用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如，氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔等，可以將細(xì)菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入細(xì)菌宿主細(xì)胞。
在酵母中表達(dá)。酵母表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括用于釀酒酵母、白色念珠菌和C.maltosa、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克魯維酵母(K.lactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)和巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pomb)和Yarrowia lipolytica的表達(dá)載體。在酵母宿主中使用的合適啟動子的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動子[Hitzeman等，J.Biol.Chem.第255卷第2073頁(1980)]或其他糖酵解酶的啟動子[Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.第7卷第149頁(1968)；Holland，Biochemistry第17卷第4900頁(1978)]，例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、α因子、ADH2IGAPDH的啟動子、葡糖激酶醇氧化酶和PGH的啟動子。[參見例如，Ausubel等，1990；Grant等，Methods in Enzymology第153卷第516-544頁，(1987)]。其他誘導(dǎo)型酵母啟動子具有生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點，包括醇脫氫酶2、isocytochrome C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖使用的酶的啟動子區(qū)域。在酵母表達(dá)中使用的合適載體和啟動子在EP73,657中有進(jìn)一步描述。酵母選擇標(biāo)記包括ADE2、His4、LEU2、TRP1和ALG7，它們賦予衣霉素抗性；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，它賦予G418抗性；CUP1基因，它允許酵母在有銅離子存在下生長?？梢詷?gòu)建用于從編碼目的FGF3多肽的DNA胞內(nèi)生產(chǎn)或分泌FGF23多肽的酵母表達(dá)載體。例如，可將所選的信號肽與合適的組成型或誘導(dǎo)型啟動子插入到所選質(zhì)粒的合適限制位點內(nèi)，以引導(dǎo)FGF23多肽的胞內(nèi)表達(dá)。為了FGF23多肽的分泌，可以將編碼FGF23多肽的DNA與編碼啟動子、酵母α-因子分泌信號/前導(dǎo)序列和接頭序列(如果需要)的DNA一起克隆入所選質(zhì)粒，以表達(dá)FGF23多肽。然后用上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后可以用10％三氯乙酸沉淀來濃縮由此轉(zhuǎn)化酵母產(chǎn)生的蛋白，并在SDS-PAGE分離及用考馬斯藍(lán)染色之后進(jìn)行分析。隨后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離并純化重組FGF23多肽。
在哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)。FGF23多肽可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)。可以用許多不同的基于病毒，例如腺病毒的表達(dá)系統(tǒng)中的任一種來轉(zhuǎn)化哺乳動物宿主細(xì)胞，其中編碼區(qū)可以連接入由晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合體中。在此病毒基因組的非必需E1或E3區(qū)的插入可產(chǎn)生能在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)目的多肽的活病毒。優(yōu)選的表達(dá)載體系統(tǒng)是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，例如在PCT/US97/01019和PCT/US97/101048中有大體描述。合適的哺乳動物表達(dá)載體含有哺乳動物啟動子，它是能結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶并啟動下游(3′)編碼FGF23多肽的序列轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子有通常位于編碼序列5′端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，和位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25～30個堿基對處的TATA盒。據(jù)認(rèn)為TATA盒引導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點開始RNA合成。哺乳動物啟動子也包括上游啟動子元件(增強子元件)，通常位于TATA盒上游100到200個堿基對處。上游啟動子元件決定轉(zhuǎn)錄起始速率并且可以在任一方向上都起作用。尤其有用的哺乳動物啟動子是來自哺乳動物病毒基因的啟動子，因為病毒基因通常高表達(dá)并有寬的宿主范圍。例子包括來自病毒基因組的啟動子，例如多瘤病毒、禽痘病毒、(UK2,211,540，1989年7月5日出版)，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(sv40)的啟動子；來自異源哺乳動物的啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；來自熱休克的啟動子，前提是這些啟動子應(yīng)與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。在載體中插入增強子序列可以增強高等真核生物中編碼FGF23多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常大約10到300bp，它作用于啟動子以增強其轉(zhuǎn)錄。來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、和胰島素)的許多增強子序列現(xiàn)在是已知的。然而，通常人們使用來自真核細(xì)胞病毒的增強子。例子包括SV40增強子，巨細(xì)胞病毒早期啟動子的增強子，多瘤病毒復(fù)制起點晚期側(cè)的增強子，和腺病毒增強子。增強子優(yōu)選位于啟動子的5′端。通常，哺乳動物細(xì)胞識別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于轉(zhuǎn)錄終止密碼子3′的調(diào)控區(qū)，因此，與啟動子元件一起位于編碼序列的兩側(cè)。成熟mRNA的3′端是通過位點特異性轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化形成的。轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷酸化信號的例子包括來自SV40的那些。在穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中可以進(jìn)行長期、高產(chǎn)量的蛋白生產(chǎn)。為此可以使用含有病毒復(fù)制起點或內(nèi)源表達(dá)元件和選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體。含有可用于哺乳動物細(xì)胞中的選擇標(biāo)記的合適載體在商業(yè)上容易獲得，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些選擇標(biāo)記的例子包括但不限于，在tk-或hprt-細(xì)胞中分別使用的單純皰疹病毒胸苷激酶和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。將外源核酸引入哺乳動物宿主及其他宿主中的方法為本領(lǐng)域已知，并因所用宿主細(xì)胞的不同而異。技術(shù)包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒感染、在脂質(zhì)體內(nèi)將多核苷酸包囊化、以及將DNA直接微注射到細(xì)胞核中。
在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。FGF23多肽也可以在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生。用于轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體，尤其是基于桿狀病毒的表達(dá)載體，是本領(lǐng)域已知的。在這樣一個系統(tǒng)中，編碼FGF23多肽的DNA融合于桿狀病毒表達(dá)載體內(nèi)的附加表位的上游。可以用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa california)核型多角體病毒(AcNPV)作為載體以在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9細(xì)胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達(dá)外源蛋白。編碼FGF23多肽的序列克隆入病毒非必需區(qū)，例如多角體蛋白基因中，并置于多角體蛋白啟動子的控制下。編碼FGF23多肽的序列的成功插入將使多角體蛋白基因失活并產(chǎn)生缺少外殼蛋白的重組病毒。然后重組病毒用于感染草地夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲，而FGF23多肽將在其中表達(dá)[Smith等，J.Wol.第46卷第584頁(1994)；Engelhard E K等，Proc.Nat.Acad.Sci.第91卷第3224-3227頁(1994)]。與編碼FGF23多肽的DNA融合的合適附加表位包括聚-組氨酸標(biāo)簽及免疫球蛋白標(biāo)簽(如IgG的Fc區(qū))。可以使用許多質(zhì)粒，包括商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒例如pVL1393(Novagen)。簡要地，用與5′和3′區(qū)互補的引物通過PCR擴增編碼FGF23多肽的DNA或者編碼FGF23多肽的期望部分的DNA。5′引物可以在其側(cè)加入限制位點。然后用所選限制酶消化PCR產(chǎn)物并亞克隆入表達(dá)載體。用脂轉(zhuǎn)染試劑(可從GIBCO-BRL商業(yè)上獲得)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法，將以上質(zhì)粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共轉(zhuǎn)染入草地夜蛾(“Sf9”)細(xì)胞(ATCC CRL 1711)中產(chǎn)生重組桿狀病毒。將sf9細(xì)胞在28℃培養(yǎng)4-5天產(chǎn)生病毒，并用于進(jìn)一步擴增。所使用的方法在O′Reilley等，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORSA LABORATORYMANUAL，Oxford University Press(1994)中有進(jìn)一步描述。如Rupert等，Nature第362卷第175-179頁(1993)所述從感染重組病毒的Sf9細(xì)胞中制備提取物?？蛇x擇地，表達(dá)的有附加表位的FGF23多肽可以用親合層析純化，或者例如，可以使用層析技術(shù)，包括蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G柱層析，進(jìn)行帶IgG標(biāo)記(或Fc標(biāo)記)的FGF23多肽的純化。
基因表達(dá)的估計?？梢院唵蔚赜美绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)并用基于本文提供的序列的合適標(biāo)記的探針來估計樣品中的基因表達(dá)，所述技術(shù)例如，DNA印跡法(用于DNA檢測)，RNA印跡法(測定mRNA的轉(zhuǎn)錄)，斑點印跡(DNA或RNA)或原位雜交?？蛇x擇地，抗體可用在檢測核酸的分析中，例如用于檢測特定雙鏈體，包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜合雙鏈體或者DNA-蛋白雙鏈體。可以標(biāo)記這些抗體并在雙鏈體可與表面結(jié)合的地方進(jìn)行測定，以使表面上形成雙鏈體時，可以檢測到與雙鏈體結(jié)合的抗體的存在?？蛇x擇地，可以用細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色和對細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的分析測定基因表達(dá)，以直接估計FGF23多肽的表達(dá)。用于此免疫分析的抗體可以是單抗或者多抗，并可以針對基于本文提供的DNA序列的FGF23多肽天然序列制備抗體。
表達(dá)蛋白的純化?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中任一種在FGF23多肽表達(dá)之后純化或分離表達(dá)的FGF23多肽。依據(jù)樣品中存在的其他組分的不同，所用的合適技術(shù)也不同。通過分離或純化去除的污染物組分是通常干涉多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可能包括酶、激素和其他溶質(zhì)。所選的純化步驟依賴于，例如，所用的生產(chǎn)方法的性質(zhì)以及所生產(chǎn)的特定FGF23多肽。FGF23多肽或蛋白可以從培養(yǎng)基或從宿主細(xì)胞溶解物中回收。如果是膜結(jié)合的，可以用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或用酶切使之從膜上釋放?？蛇x擇地，用于表達(dá)FGF23多肽的細(xì)胞可以用不同的物理或化學(xué)方法裂解，例如凍融循環(huán)、超聲波降解、機械裂解或用細(xì)胞溶解劑。純化方法的示例包括但不限于，離子交換柱層析；用硅膠或陽離子交換樹脂(例如DEAE)的層析；用例如，SephadexG-75的凝膠過濾；去除污染物例如IgG的蛋白質(zhì)A Sepharose柱；使用金屬螯合柱結(jié)合具附加表位的FGF23多肽的層析；乙醇沉淀；反相HPLC；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀。通常地，用至少一個純化步驟制備分離的FGF23多肽。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)抗-FGF23多肽抗體柱純化FGF23多肽。與蛋白濃縮相關(guān)的超濾和透析技術(shù)也是有用的(參見，例如，Scopes，R.，PROTEINPURIFICATION，Springer-Verlag，New York，N.Y.，1982)。所需的純化程度隨FGF23多肽的用途不同而不同。在某些情況下，不純化是必須的。一旦按需要進(jìn)行表達(dá)和純化后，本發(fā)明的FGF23多肽與核酸可用于多種應(yīng)用中，如下面詳述。
表達(dá)蛋白的標(biāo)記。本發(fā)明的核酸、蛋白和抗體可被標(biāo)記。本文中被標(biāo)記是指化合物連接上至少一個元素、同位素或化學(xué)化合物以使其能被檢測到。通常，標(biāo)記分為三類a)同位素標(biāo)記，可以是放射性或重同位素；b)免疫標(biāo)記，可以是抗體或抗原；c)有色或熒光染料。標(biāo)記可以并入化合物的任何位置，只要它不影響被檢測的化合物的生物活性或特性。
FGF23多肽融合蛋白。本發(fā)明FGF23多肽也可被修飾以形成含有與另一個異源多肽或氨基酸序列融合的FGF23多肽的嵌合分子。本文所用的術(shù)語“融合蛋白”指含有與“導(dǎo)向多肽”融合的FGF23多肽或其結(jié)構(gòu)域序列的嵌合多肽。導(dǎo)向多肽應(yīng)有足夠的殘基以利于導(dǎo)向特定細(xì)胞類型或受體，然而它也應(yīng)足夠小以至于不影響FGF23多肽的生物學(xué)功能。導(dǎo)向多肽優(yōu)選還具有相當(dāng)?shù)莫毺匦?，以至于融合蛋白不與其他細(xì)胞類型或受體有實質(zhì)上的交叉反應(yīng)。合適的導(dǎo)向多肽通常有至少約10個氨基酸殘基，并且通常在約10到約500個氨基酸殘基之間。優(yōu)選導(dǎo)向多肽有約20到約200個氨基酸殘基。融合蛋白也可以包括標(biāo)簽多肽與FGF23多肽的融合物，所述標(biāo)簽多肽將提供抗-標(biāo)簽抗體能選擇結(jié)合的表位。附加表位通常置于FGF23多肽的氨基或羧基端。可以用抗標(biāo)簽多肽的抗體來檢測FGF23多肽的這些具附加表位的形式。而且，附加表位的提供可以使FGF23多肽能通過使用抗-標(biāo)簽抗體或能與附加表位結(jié)合的其他類型親合基質(zhì)而容易地被純化。可選擇地，融合蛋白可以包括FGF23多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合物。對于二價形式的嵌合分子，此融合可以是與IgG分子的Fc段或者，例如，GM-CSF的融合。優(yōu)選的融合蛋白包括但不限于，能促進(jìn)FGF23多肽的免疫尋靶的分子?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)制備用于各種其他目的的FGF23多肽融合蛋白。例如，為了制備抗體，如果目的表位很小，可以用部分或完全的FGF23多肽與載體蛋白融合以形成免疫原?？蛇x擇地，可以將FGF23多肽制成融合蛋白以增強該抗原刺激細(xì)胞和/或體液(基于抗體)免疫應(yīng)答的能力，或達(dá)到其他目的。
編碼FGF23多肽的合成基因。一旦能夠得到天然蛋白的核酸序列和/或氨基酸序列信息，就能夠用現(xiàn)有的多種技術(shù)在天然序列內(nèi)造成實質(zhì)上的突變，例如，Shortle，Science，第229卷，第1193-1201頁(1985)；Zoller和Smith，Methods in Enzymology，第100卷，第468-500頁(1983)；Mark等，美國專利號4,518,584；Wells等，Gene，第34卷，第315-323頁(1985)；Estell等，Science，第233卷，第659-663頁(1986)；Mullenbach等，J.Biol.Chem.，第261卷，第719-722頁(1986)；Feretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第83卷，第597-603頁(1986)，因此，這些文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)的形式并入本文。
天然多肽的變體(有時稱作“突變蛋白質(zhì)”)在多種情況下是希望得到的。例如，可以用特定變體降低不想要的副作用，特別是當(dāng)副作用活性和想要的活性與多肽中不同部分相關(guān)時。在一些表達(dá)系統(tǒng)中，天然多肽易于被蛋白酶降解。在這種情況下，通過氨基酸的選擇性替換和/或刪除來改變易降解序列能顯著地增加產(chǎn)量，例如，英國專利申請?zhí)?173-804-A，其中人組織血纖維蛋白溶酶原激活物中275位的Arg被Gly或Glu替換。通過消除易于被氧化、?；?、烷化或其他化學(xué)修飾的氨基酸，變體也可以增加純化過程中的產(chǎn)量和/或增強蛋白的保存期。見例如，甲硫氨酸易于被氧化形成亞砜，這在許多蛋白中與生物活性的喪失有關(guān)，見例如Brot和Weissbach，Arch.Biochem.Biophys.，第223卷，第271頁(1983)。甲硫氨酸常被更惰性的氨基酸置換且?guī)缀醪换蛲耆粏适锘钚裕绨拇罄麃唽＠暾執(zhí)朅U-A-52451/86。在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中，有時可以通過消除或置換構(gòu)象不必需的半胱氨酸殘基來增加產(chǎn)量，例如，Mark等，美國專利號4,518,584。
優(yōu)選地使用盒式誘變產(chǎn)生突變蛋白。用具有獨特(當(dāng)插入合適載體中)限制性內(nèi)切酶位點的序列構(gòu)建合成基因，其中這些位點沿基因近乎均一地間隔。這些獨特限制位點允許基因片段方便地被切除并被編碼所需突變的合成寡核苷酸(即，“盒子”)替換。確定獨特限制位點的數(shù)目和分布必需考慮幾個因素，包括(1)在用于表達(dá)的載體中預(yù)先存在的限制位點，(2)物種或?qū)偬禺惖拿艽a子使用是否是想要的，(3)能夠得到的不同非載體切割限制性內(nèi)切酶的數(shù)目(和它們在合成基因中的復(fù)數(shù)(multiplicity))，(4)獨特限制位點間的片段的合成和/或測序的方便性和可靠性。
以上技術(shù)對于天然蛋白序列中保守氨基酸替換及類似的替代是方便的方法。此處所用“保守”指(i)改變盡量是構(gòu)象中性的，就是說，設(shè)計以產(chǎn)生與天然蛋白相比三級結(jié)構(gòu)最小變化的突變多肽，(ii)改變盡量是抗原性中性的，就是說，設(shè)計以產(chǎn)生與天然蛋白相比抗原決定簇最小變化的突變多肽。以下是將氨基酸分為相似類的優(yōu)選分類芳族(phe，trp，tyr)，疏水的(leu，ile，val)，極性的(gln，asn)，堿性的(arg，lys，his)，酸性的(asp，glu)，小的(ala，ser，thr，met，gly)。構(gòu)象中性是保持生物活性所需的，抗原性中性是給患者或動物使用本發(fā)明化合物時避免引發(fā)免疫反應(yīng)所需的。盡管絕對肯定地選擇構(gòu)象和抗原性中性的替代是困難的，但存在能指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的規(guī)則，通過這些規(guī)則可以使改變有很大可能性為構(gòu)象和抗原性中性的，例如Anfisen(上述引文)；Berzofsky，Science，第229卷，第932-940頁1985)；和Bowie等，Science，第247卷，第1306-1310頁(1990)。一些更重要的規(guī)則包括(1)替換疏水殘基使抗原性變化的可能性較小，因為它們可能位于蛋白的內(nèi)部，例如Berzofsky(上面引文)和Bowie等(上面引文)；(2)生理化學(xué)相似，即同義的殘基替換產(chǎn)生構(gòu)象改變的可能性較小，因為替換氨基酸能扮演與被替換氨基酸相同的結(jié)構(gòu)角色；(3)進(jìn)化保守序列的改變可能產(chǎn)生有害的構(gòu)象效應(yīng)，因為進(jìn)化保守意味著序列可能是功能上重要的。除了選擇變體序列的這些基本規(guī)則外，可以進(jìn)行分析以確認(rèn)所構(gòu)建的分子的生物活性及構(gòu)象。上面更完全地描述了本發(fā)明多肽的生物學(xué)分析?？梢杂弥辽賰蓚€已知的方法檢驗構(gòu)象的變化微量補體結(jié)合法，例如Wasserman等，J.Immunol.，第87卷，第290-295頁(1961)，或Levine等.Methods in Enzymology，第11卷，第928-936頁(1967)，該方法在蛋白三級結(jié)構(gòu)的進(jìn)化研究上廣泛應(yīng)用；以及與多組構(gòu)象特異單克隆抗體的親合性，例如Lewis等，Biochemistry，第22卷，第948-954頁(1983)。
FGF23多肽的化學(xué)生產(chǎn)可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成本發(fā)明的肽，例如Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis，第二版(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，1984)。優(yōu)選地，使用商業(yè)上的肽合成儀，例如Applied Biosystem，Inc.(fosterCity，CA)的430A型，可以用匯聚合成方法從多個分別合成并純化的肽裝配本發(fā)明多肽，例如Kent等，美國專利號6,184,344；Dawson和Kent，Annu.Rev.Biochem.，第69卷第923-960頁(2000)?？梢栽诮宦?lián)聚苯乙烯支持物上通過固相合成來裝配本發(fā)明的肽，即從羧基端殘基開始逐步加上氨基酸直至形成完整肽。以下文獻(xiàn)是對合成中使用的化學(xué)的指導(dǎo)Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，第40卷第180-193頁(1992)；Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，第85卷，第2149頁(1963)；Kent等，第185頁《Peptides》1984，Ragnarsson，編(Almquist and Weksell，Stockholm，1984)；Kent等，第217頁《Peptide Chemistry》84，Izumiya，編(Protein ResearchFoundation，B.H.Osaka，1985)；Merrifield，Science，第232卷，第341-347頁(1986)；Kent，Ann.Rev.Biochem.，第57卷，第957-989頁(1988)，及在后兩篇文獻(xiàn)中引用的文獻(xiàn)。
固相合成中最重要的是清除副產(chǎn)物的合成，它主要是終止、缺失或修飾的肽。通過使用無雜質(zhì)且充分表征的樹脂、無雜質(zhì)的氨基酸衍生物、無雜質(zhì)溶劑并對正確的偶聯(lián)及切割方法和反應(yīng)條件進(jìn)行選擇可以消除或最小化大多數(shù)副反應(yīng)，例如Barany和Merrifield，The Peptides，Cross andMeienhofer，Eds.，第2卷，第1-284頁(Academic Press，New York，1979)。重要的是監(jiān)測偶聯(lián)反應(yīng)以確定它們進(jìn)行完全，這樣可以避免出現(xiàn)缺失一個或多個殘基的缺失肽。定量的茚三酮反應(yīng)可用于此目的，Sarin等，Anal.Biochem，117卷，147頁(1981)。Na-叔丁氧羧基(t-Boc)-氨基酸與在鏈裝配條件下穩(wěn)定而在強酸下不穩(wěn)定的合適側(cè)鏈保護(hù)基一起使用。受保護(hù)的肽鏈裝配完之后，在硫酯清除劑存在下用先低濃度后高濃度的無水氟化氫去除保護(hù)基并切割肽的錨定鍵，Tam等，J.Amer.Chem.Soc.，第105卷，第6442頁(1983)。使用的側(cè)鏈保護(hù)基是Asp(OBzl)、Glu(OBzl)、ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Lys(Cl-Z)、Tyr(Br-Z)、Arg(NGTos)、Cys(4-MeBzl)、His(ImDNP)。(Bzl，芐基；Tos，甲苯磺?；?；DNP，二硝基苯基；Im，咪唑；Z，芐氧羰基)。剩下的氨基酸無側(cè)鏈保護(hù)基。每圈循環(huán)使tBoc Na保護(hù)的肽-樹脂暴露于二氯甲烷(DCM)(Mallenckrodt)中的65％三氟乙酸(來自EastmanKodak)(用前蒸餾)先1分鐘后13分鐘以去除Na保護(hù)基。在DCM中洗肽-樹脂，用二甲基甲酰胺(DMF)(Applied Biosystems)中的10％二異丙基乙基胺(DIEA)(Aldrich)中和兩次，每次1分鐘。之后用DMF洗滌進(jìn)行中和。用氨基酸的對稱酸酐在DMF中16分鐘進(jìn)行偶聯(lián)。此對稱酸酐通過在6ml DCM中溶解2mmol氨基酸并加入2ml DCM中的1mmol二環(huán)己基碳二亞胺(Aldrich)在合成儀上制備。5分鐘后，活化的氨基酸轉(zhuǎn)到單獨的管中，用連續(xù)氮氣流吹洗使DCM蒸發(fā)。在吹洗的不同階段用DMF(共6ml)代替DCM。初次偶聯(lián)之后，用DCM、DCM中10％DIEA、然后用DCM清洗肽-樹脂。為了再次偶聯(lián)，將相同的氨基酸和激活劑，二環(huán)己基碳二亞胺，順序轉(zhuǎn)入反應(yīng)管中。原位激活并偶聯(lián)10分鐘之后，加入足夠的DMF以制成50％DMF-DCM混合物，偶聯(lián)持續(xù)15分鐘。精氨酸在DMF中以羥基苯并三唑(Aldrich)酯的形式偶聯(lián)60分鐘，然后以相同的方式與其他氨基酸再偶聯(lián)。天冬酰胺與谷氨酰胺在DMF中以羥基苯并三唑酯形式偶聯(lián)兩次，每次偶聯(lián)40分鐘。對于所有殘基，第二次偶聯(lián)后洗滌樹脂，樣品自動采集，用于通過定量茚三酮反應(yīng)監(jiān)測未偶聯(lián)殘基的α-氨基，Sarin等。(上面引文)。
優(yōu)選地，通過天然化學(xué)連接裝配寡肽來實施本發(fā)明多肽的化學(xué)合成，見如Dawson等，Science，第266卷第776-779頁(1994)；Kent等，美國專利號6,184,344所述。簡要地，此方法中第一寡肽提供有未氧化巰基側(cè)鏈的N端半胱氨酸，第二寡肽提供C端硫酯。然后N端半胱氨酸的未氧化巰基側(cè)鏈與C端硫酯縮合以產(chǎn)生通過β-氨基硫酯鍵連接第一和第二寡肽的中間寡肽。然后中間寡肽的β-氨基硫酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)重排，產(chǎn)生通過酰胺鍵連接第一和第二寡肽的寡肽產(chǎn)物。優(yōu)選地，如下述用環(huán)狀噻唑烷保護(hù)基保護(hù)內(nèi)在片段的N端半胱氨酸免受不想要的環(huán)化和/或串聯(lián)反應(yīng)。優(yōu)選地，此環(huán)狀噻唑烷保護(hù)基是硫脯氨?；鶊F(thioprolinyl group)。
可以如下列文獻(xiàn)所述制備有C端硫酯的寡肽，這些文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)的形式并入Kent等，美國專利號6,184,344；Tam等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第92卷第12485-12489頁(1995)；Blake，Int.J.Peptide Protein Res.，第17卷第273頁(1981)；Canne等，Tetrahedron Letters，第36卷第1217-1220頁(1995)；Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第94卷第7845-7850頁(1997)；或Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第96卷第10068-10073頁(1999)。優(yōu)選地，使用Hackeng等(1999)所述的方法。簡要地，在固相支持物(下述)上合成寡肽，通常在0.25mmol規(guī)模上，對于Boc化學(xué)使用原位中和/HBTu激活步驟進(jìn)行，如Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，第40卷第180-193頁(1992)所述，其以參考文獻(xiàn)形式并入此處。(HBTu是2-(lH-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽，Boc是叔丁氧羰基)。每個合成循環(huán)的組成為用純TFA處理1到2分鐘以去除Nα-Boc、1分鐘DMF流洗，在DIEA存在下用1.0mmol預(yù)活化的Boc-氨基酸進(jìn)行10-20分鐘偶聯(lián)之后第二次DMF流洗。(TFA是三氟乙酸，DMF是N，N-二甲基替甲酰胺，DIEA是N，N-二異丙基乙胺)。其中在過量DIEA(3mmol)存在下用1.0mmol HBTu(DMF中0.5M)預(yù)活化Nα-Boc-氨基酸(1.1mmol)3分鐘。每個偶聯(lián)步驟之后，用常規(guī)定量茚三酮分析通過測量殘基的自由氨基來確定產(chǎn)率，例如，見Sarin等，Anal.Biochem.，第117卷第147-157頁(1981)所示。Gln殘基偶聯(lián)之后，用TFA去保護(hù)之前和之后用DCM流洗，以防止可能的高溫(TFA/DMF)催化的吡咯烷酮形成。鏈裝配完成之后，通過用無水氟化氫在0℃處理1小時及將4％對甲酚用作清除劑使寡肽去保護(hù)并從樹脂上切除。因為dnp去除步驟與C端硫酯基團不相容，所以咪唑側(cè)鏈的2，4-二硝基苯基(dnp)保護(hù)基仍在His殘基上。然而，可以在連接反應(yīng)中用硫醇逐步去除dnp。切除之后，用冰冷的乙醚沉淀寡肽，在含水乙腈中溶解，凍干。
上述硫酯寡肽優(yōu)選在三苯甲基連接的巰基丙酸-亮氨酸(TAMPAL)樹脂上合成，此樹脂的制備利用如Hackeng等(1999)所示方案或類似方案。簡要地，在6mmol DIEA存在下用3.6mmol HBTu活化Nα-Boc-Leu(4mmol)，與2mmol對甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂或等價物偶聯(lián)16分鐘。之后，在6mmol DIEA存在下用2.7mmol HBTu活化3mmolS-三苯甲基巰基丙酸，與Leu-MBHA樹脂偶聯(lián)16分鐘。用TFA中的3.5％三異丙基硅烷和2.5％水處理兩次各1分鐘去除三苯甲基保護(hù)基之后，產(chǎn)生的TAMPAL樹脂可用作多肽鏈裝配的起始樹脂。用標(biāo)準(zhǔn)原位中和肽偶聯(lián)方案處理1小時可以與任何想要的氨基酸形成硫酯鍵，如Schnolzer等(以上引文)所公開。用無水HF處理最終寡肽產(chǎn)生C端活化的巰基丙酸-亮氨酸(MPAL)硫酯寡肽。
優(yōu)選地，在如Hackeng等(1999)所述條件下或類似條件下，在天然化學(xué)連接中使用噻唑烷保護(hù)的硫酯寡肽中間體。簡要地，向待連接的干燥肽中加入含有6M胍、4％(v/v)芐硫醇、4％(v/v)苯硫酚的0.1M磷酸緩沖液(pH8.5)，得到最終肽濃度為1-3mM且pH為約7，pH降低是由于加入了硫醇和來自凍干肽的TFA。優(yōu)選地，在加熱器中37℃進(jìn)行連接反應(yīng)，同時周期性渦旋以平衡硫醇添加劑?？梢杂肕ALDI-MS或HPLC及電噴射離子化MS監(jiān)測反應(yīng)的完成度。
天然化學(xué)連接反應(yīng)完成或終止后，用半胱氨酸去保護(hù)劑，例如O-甲基羥胺(0.5M)在37℃及pH3.5-4.5處理2小時，打開產(chǎn)物的N端噻唑烷環(huán)，之后將10倍過量的Tris-(2-羧基乙基)-膦加入到反應(yīng)混合物中以完全還原任何氧化反應(yīng)成分，之后用常規(guī)制備性HPLC純化產(chǎn)物。優(yōu)選地，含有連接產(chǎn)物的組分用電噴射MS鑒定、之后合并、凍干。
合成完成及最終產(chǎn)物純化之后，用常規(guī)技術(shù)使最終多肽產(chǎn)物重折疊，例如Creighton，Meth.Enzymol.，第107卷第305-329頁(1984)；White，Meth.Enzymol.，第11卷第481-484頁(1967)；Wetlaufer，Meth.Enzymol.，第107卷第301-304頁(1984)等。優(yōu)選地，用空氣氧化通過以下步驟或類似方法使最終產(chǎn)物重折疊在有100mM Tris、10mM甲硫氨酸pH8.6的1M鹽酸胍(或類似的離液劑)中溶解還原的凍干產(chǎn)物(約0.1mg/ml)。輕柔攪拌過夜之后，用常規(guī)方法通過反相HPLC分離重折疊產(chǎn)物。
抗-FGF23多肽抗體本發(fā)明還提供了抗-FGF23多肽抗體。本發(fā)明抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性和異源綴合抗體。
多克隆抗體。本發(fā)明的抗-FGF23多肽抗體可以是多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些多克隆抗體可在哺乳動物中產(chǎn)生，例如，在一或多次注射免疫劑及優(yōu)選地佐劑后。典型地，用一系列皮下或腹膜內(nèi)注射把免疫劑和/或佐劑注射入哺乳動物體內(nèi)。免疫劑包括FGF23多肽或其融合蛋白。將抗原與已知在被免疫動物體內(nèi)有免疫原性的蛋白連接可能是有用的。這些有免疫原性的蛋白的例子包括但不限于，匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。佐劑包括，例如，弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂A，合成的海藻糖二霉菌酸脂)?；跇?biāo)準(zhǔn)方案或用常規(guī)實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定免疫方案。
單克隆抗體。可選擇地，抗-FGF23多肽抗體可以是單克隆抗體?？梢杂秒s交瘤生產(chǎn)單克隆抗體，其中用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其他合適宿主動物，以引起將產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫劑特異結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞[Kohler和Milstein，Nature第256卷第495頁(1975)]?？蛇x擇地，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。免疫劑典型地包括FGF23多肽或其融合蛋白。一般地，如果需要非人哺乳動物來源則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞，如果用人源細(xì)胞則使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)。用適合的融合劑，例如聚乙二醇，把淋巴細(xì)胞與無限增殖化細(xì)胞系融合，以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞[Goding，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE，Academic Press，第59-103頁(1986)]。通常，無限增殖化細(xì)胞系是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，例如，大鼠、小鼠、?；蛉嗽吹墓撬枇黾?xì)胞。在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，此培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的無限增殖化細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基典型地包括次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)，這些物質(zhì)能抑制HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長。優(yōu)選無限增殖化細(xì)胞系能有效融合、支持抗體穩(wěn)定高水平表達(dá)并且是對培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感。更優(yōu)選的無限增殖化細(xì)胞系是鼠或人骨髓瘤細(xì)胞系，可以從，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)獲得。也有人骨髓瘤和鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體的描述[Kozbor，J.Zmmunol.第133卷第3001頁(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，第51-63頁(1987)]。
分析培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基(上清液)，看是否存在FGF23多肽的單克隆抗體。優(yōu)選地，用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗，例如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，測定雜交瘤上清液中單克隆抗體的結(jié)合特異性。合適的技術(shù)和分析方法是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以，例如，通過Munson和Pollard，Anal，Biochem.107220(1980)的Scatchard分析來測定。鑒定產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞之后，可以用有限稀釋法克隆細(xì)胞并用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)[Goding，1986]。用于此目的的合適培養(yǎng)基包括，例如，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基?？蛇x擇地，雜交瘤細(xì)胞可以在哺乳動物體內(nèi)作為腹水生長。用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質(zhì)A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親合層析，可以從培養(yǎng)基或腹水液體中分離或純化所選克隆分泌的單克隆抗體。
也可以用重組DNA方法制備單克隆抗體，例如美國專利號4,816,567中所述。可以從FGF23多肽特異雜交瘤細(xì)胞中分離編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA并測序，例如，其中使用能與編碼鼠抗體重和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針。分離之后，可以將DNA插入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞例如猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以實現(xiàn)在重組宿主細(xì)胞內(nèi)單克隆抗體的合成。DNA也可被修飾，例如，將同源鼠序列替換為人重和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列[Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.第81卷第6851-6855頁(1984)；Neuberger等，Nature第312卷第604-608頁(1984)；Takeda等，Nature第314卷第452-454頁(1985)]，或使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接?？捎梅敲庖咔虻鞍锥嚯拇姹景l(fā)明抗體的恒定區(qū)，或者代替本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)以產(chǎn)生嵌合二價抗體?？贵w也可以是單價抗體。制備單價抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，體外方法是適合于制備單價抗體的。可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)完成抗體消化以產(chǎn)生其片段，尤其是，F(xiàn)ab片段。
也可以用重組方法制備本發(fā)明雜交瘤的特征抗體或抗體片段，方法是提取mRNA、構(gòu)建cDNA文庫、篩選編碼抗體分子片段的克隆，例如Wall等，Nucleic Acids Research，第5卷，第3113-3128頁(1978)；Zakut等，NucleicAcids Research，第8卷，第3591-3601頁(1980)；Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第81卷，第3273-3277頁(1984)；Boss等，Nucleic Acids Research，第12卷，第3791-3806頁(1984)；Amster等，Nucleic Acids Research，第8卷，第2055-2065頁(1980)；Moore等，美國專利號4,642,334；Skerra等，Science，第240卷，第1038-1041頁(1988)；Huse等，Science，第246卷，第1275-1281頁(1989)。具體地，可以使用這些技術(shù)制備種間(interspecific)單克隆抗體，其中一個物種的抗體的結(jié)合區(qū)與另一個物種的抗體的非結(jié)合區(qū)組合以降低免疫原性，例如，Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第84卷，第3439-3443頁(1987)。
多克隆及單克隆抗體均可以用ELISA篩選。如其他固相免疫測定一樣，本試驗基于大分子對塑料的非特異性吸附趨勢。此反應(yīng)的不可逆性不使免疫活性喪失，并允許形成抗原-抗體復(fù)合體以及可將此復(fù)合體從未結(jié)合材料中簡單分離出來。為了滴定抗肽血清，將與載體綴合的肽吸附到96孔微量滴定板的孔中，此載體與免疫接種時所用的不同。然后將吸附的抗原在孔中與抗肽血清稀釋液反應(yīng)。洗去未結(jié)合抗體，將剩下的抗原-抗體復(fù)合體與特異針對免疫動物的IgG的抗體反應(yīng)。此第二抗體與酶，例如堿性磷酸酶綴合。加入酶底物時產(chǎn)生可視的顏色反應(yīng)產(chǎn)物，這表明這個孔已經(jīng)結(jié)合抗肽抗體。使用分光光度計讀數(shù)器可對結(jié)合的肽特異性抗體數(shù)量進(jìn)行更好的定量。高效價血清在10-3到10-5稀釋物之間產(chǎn)生線性滴定曲線。
FGF23肽抗體。本發(fā)明包括來自FGF23多肽的肽和含有載體與本發(fā)明肽之間的綴合物的免疫原。如此處所用術(shù)語免疫原指能引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)。術(shù)語載體在此指與本發(fā)明肽化學(xué)綴合后能使免疫了此綴合物的宿主生物體產(chǎn)生對綴合肽特異的抗體的任何物質(zhì)。載體包括紅細(xì)胞、噬菌體、蛋白或合成微粒例如瓊脂糖珠。優(yōu)選地，載體是蛋白，例如血清白蛋白、γ-球蛋白、匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、纖維蛋白原等。
將合成肽與載體連接的常用技術(shù)在幾篇文獻(xiàn)中有描述，例如Walter和Doolittle，″抗合成肽抗體″Setlow等，編，《Genetic Engineering》，第5卷，第61-91頁(Plenum Press，N.Y.，1983)；Green等.Cell，第28卷，第477-487頁(1982)；Lerner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第78卷，第3403-3407頁(1981)；Shimizu等，美國專利號4,474,754；Ganfield等，美國專利號4,311,639。因此，這些文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)的方式并入本文。而且，把半抗原與載體連接的技術(shù)與上述參考技術(shù)大體上相同，例如Tijsseu Practice and Theory ofEnzyme Immunoassays(Elsevier，New York，1985)中第二十章。將肽連到載體上的四個最常用方案是(1)用于氨基偶聯(lián)的戊二醛，例如Kagan和Glick，在Jaffe and Behrman編的Methods of Hormone Radioimmunoassay一書中第328-329頁(Academic Press，N.Y.，1979)；Walter等.Proc.Natl.Acad.Sci.，第77卷，第5197-5200頁(1980)所述；(2)用于羧基與氨基偶聯(lián)的水溶性碳二亞胺，例如Hoare等，J.Biol.Chem.，第242卷，第2447-2453頁(1967)所述；(3)用于酪氨酸與酪氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)的雙偶氮聯(lián)苯胺(DBD)，例如Bassiri等，第46-47頁，Jaffe and Behrman，編.(上面引文)；Walter等.(上面引文)所述；(4)用于半胱氨酸(或其他巰基)與氨基偶聯(lián)用的馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)，例如Kitagawa等，J.Biochem.(Tokyo)，第79卷，第233-239頁(1976)；Lerner等.(上面引文)。選擇一個將給定肽與蛋白載體偶聯(lián)的合適方法的一般規(guī)則可陳述如下待連接的基團應(yīng)在序列中只出現(xiàn)一次，優(yōu)選在片段的合適末端。例如，如果酪氨酸殘基出現(xiàn)在序列的主要部分中，而此序列是因為有潛在的抗原特征而被選擇的，則不應(yīng)使用BDB。相似地，位于中間的賴氨酸則排除戊二醛方法，天冬氨酸和谷氨酸的頻繁出現(xiàn)排除碳二亞胺法。另一方面，合適的殘基可以位于所選序列片段的任一端作為連接位點，無論它們是否存在于“天然”蛋白序列中。與氨基和羧基端不同，內(nèi)部片段在“未連接末端”與存在于具有連續(xù)的多肽主鏈的天然蛋白中的相同序列有顯著的不同。這個問題可通過乙?；?氨基然后由其羧基端實現(xiàn)肽連接而在一定程度上緩解。使用放射性標(biāo)記肽可方便地測量與載體蛋白的偶聯(lián)效率，放射性標(biāo)記肽的制備方法有在合成的一個步驟中使用放射性氨基酸或者通過酪氨酸殘基的碘化標(biāo)記完整肽。肽中酪氨酸的出現(xiàn)也使得可以在需要時設(shè)定靈敏的放射免疫測定。因此，可以引入酪氨酸作為末端殘基，如果它不是天然多肽限定的肽序列的一部分的話。
優(yōu)選載體是蛋白，優(yōu)選的蛋白載體包括牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白(OVA)、匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)或類似的。可以用MBS將肽與KLH通過半胱氨酸連接起來，如Liu等，Biochemistry，第18卷，第690-697頁(1979)的公開。將肽溶解在磷酸緩沖鹽溶液(pH7.5)、0.1M硼酸鈉緩沖液(pH9.0)或1.0M醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中。選擇溶解肽的pH以使肽溶解度達(dá)到最優(yōu)。用Ellman法測定可溶肽的游離半胱氨酸的含量，Ellman，Arch.Biochem.Biophys.，第82卷，第70-77頁(1959)。對于每一個肽，使0.25ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的4mg KLH與0.7mgMBS(溶解在二甲基甲酰胺中)反應(yīng)，并在室溫下攪動30分鐘。逐滴加入MBS以保證甲酰胺的局部濃度不會過高，因為KLH在30％甲酰胺中是不溶的。然后，使反應(yīng)產(chǎn)物KLH-MBS通過用50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡的sephadex G-25以去除游離MBS。從柱洗脫物的峰組分中回收的KLH(在OD280檢測)估計約為80％。然后KLH-MBS與1ml所選緩沖液中25溶解的5mg肽反應(yīng)。pH調(diào)到7-7.5，反應(yīng)在室溫攪動3小時。用放射性肽通過相對于磷酸緩沖鹽溶液透析綴合物樣品以監(jiān)測偶聯(lián)效率，范圍在8％到60％。一旦能夠得到肽-載體綴合物，即可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)多克隆或單克隆抗體，例如Campbell，Monoclonal Antibody Technology(Elsevier，New York，1984)；Hurrell，編Monoclonal Hybridoma AntibodiesTechniques and Applications(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，1982)；Schreier等。Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980)；美國專利號4,562,003等所述。特別地，美國專利號4,562,003以參考文獻(xiàn)的方式并入本文。
人源化抗體。本發(fā)明抗-FGF23多肽抗體還包括人源化抗體或人抗體。術(shù)語“人源化抗體”指非人(例如鼠)抗體的人源化形式，它是含有來自非人抗體的部分序列的嵌合抗體、其免疫球蛋白鏈或片段(例如，F(xiàn)v、Fab、Fab′、F(ab′)，或抗體的其他抗原結(jié)合部分序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白，其中人免疫球蛋白互補決定區(qū)(CDR)的殘基被非人物種，例如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基所替代，后者有所需的結(jié)合特異性、親和力和容量。通常，人源化抗體基本上包括至少一個、通常兩個可變區(qū)的全部，其中全部或基本上全部的CDR與非人免疫球蛋白的CDR區(qū)對應(yīng)而全部或基本上全部FR區(qū)是具有人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體優(yōu)選地也包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，它通常是人免疫球蛋白的[Jones等，Nature第321卷第522-525頁(1986)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.第2卷第593-596頁(1992)]。使非人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域已知的。通常，人源化抗體具有從非人來源引入的一個或多個氨基酸，以使其與人抗體更相似時仍保留抗體的最初結(jié)合活性?？贵w人源化的方法在Jones等，Nature第321卷第522-525頁(1986)；Riechmann等，Nature第332卷第323-327頁(1988)；Verhoeyen等，Science第239卷第1534-1536頁(1988)中有進(jìn)一步詳述。此“人源化”抗體是嵌合抗體，其中實質(zhì)上非整個的人可變區(qū)被來自非人物種的對應(yīng)序列替換。
異源綴合抗體。異源綴合抗體含有兩個共價連接的抗體，也屬于本發(fā)明之列?？梢杂煤铣傻鞍踪|(zhì)化學(xué)中的已知方法體外制備異源綴合抗體；包括其中使用交聯(lián)劑的方法。例如，可以用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來制備免疫毒素。
雙特異性抗體。雙特異性抗體有對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。此抗體是單克隆的，優(yōu)選是人的或人源化的。本發(fā)明雙特異性抗體的一個結(jié)合特異性是對FGF23多肽的，而另一個優(yōu)選針對細(xì)胞表面的蛋白或受體或受體亞基。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，通常，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生是基于在雜交瘤細(xì)胞中兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達(dá)。其中兩條重鏈有不同的特異性[Milstein和Cuello，Nature第305卷第537-539頁(1983)]?？紤]到免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機組合可導(dǎo)致雜交瘤產(chǎn)生可能的十種不同抗體分子，故正確分子的純化通常需要某種親合純化，例如親合層析。
抗體拮抗劑。優(yōu)選地，本發(fā)明拮抗劑來自對FGF23多肽特異的抗體。更優(yōu)選地，本發(fā)明拮抗劑含有對FGF23多肽特異的片段或結(jié)合組合物?？贵w含有由二硫橋連接在一起的多肽鏈。二個主要多肽鏈，即輕鏈和重鏈，組成抗體的所有主要結(jié)構(gòu)類型(同種型)。重鏈和輕鏈可進(jìn)一步分成亞區(qū)，即可變區(qū)和恒定區(qū)。重鏈含有一個可變區(qū)和三個不同的恒定區(qū)，輕鏈含有一個可變區(qū)(與重鏈上的不同)和一個恒定區(qū)(與重鏈上的不同)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合特異性。如此處所用，術(shù)語“重鏈可變區(qū)”指這樣的多肽，(1)其長度有110到125個氨基酸，(2)從重鏈的N端氨基酸開始，其氨基酸序列與本發(fā)明單克隆抗體的重鏈的序列對應(yīng)。同樣地，術(shù)語“輕鏈可變區(qū)”指這樣的多肽，(1)其長度有95到115個氨基酸，(2)從輕鏈的N端氨基酸開始，其氨基酸序列與本發(fā)明單克隆抗體輕鏈中的序列對應(yīng)。如此處所用，術(shù)語“單克隆抗體”指均一的免疫球蛋白群體，它能特異地結(jié)合FGF23多肽。如此處所用，術(shù)語“結(jié)合組合物”指含有兩個多肽鏈的組合物，所述兩個多肽鏈(1)在可操作連接時，呈現(xiàn)對FGF23多肽有強結(jié)合親和力的構(gòu)象且(2)來源于產(chǎn)生對FGF23多肽特異的單克隆抗體的雜交瘤。術(shù)語“可操作連接”意味著可以用許多方式把兩條多肽鏈相對放置以結(jié)合，方式包括在天然抗體片段，例如Fab或Fv內(nèi)連接，或者在羧基端利用基因工程構(gòu)建的含有半胱氨酸的肽接頭。通常，這兩條多肽鏈與FGF23多肽特異性單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)對應(yīng)。優(yōu)選地，本發(fā)明拮抗劑來自對FGF23多肽特異的單克隆抗體。能阻斷或中和FGF23多肽的單克隆抗體可通過它們抑制FGF23多肽誘導(dǎo)的效應(yīng)的能力選擇。
抗體片段的使用和產(chǎn)生也是已知的，例如Fab片段Tijssen，Practiceand Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)；Fv片段Hochman等。Biochemistry，第12卷，第1130-1135頁(1973)，Sharon等，Biochemistry，第15卷，第1591-1594頁(1976)；Ehrlich等，美國專利號4,355,023；抗體半分子Auditore-Hargreaves，美國專利號4,470,925。
純化和藥物組合物當(dāng)本發(fā)明多肽以可溶形式表達(dá)時，例如作為轉(zhuǎn)化的酵母或哺乳動物細(xì)胞的分泌產(chǎn)物時，可以用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法將它們純化，包括硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾、電泳、親合層析、和/或類似的步驟，例如，″酶的純化和相關(guān)技術(shù)″Methods in Enzymology，第22卷第233-577頁(1977)；Scopes，R.，Protein PurificationPrinciples and Practice(Springer-Verlag，New York，1982)提供了這些純化的指導(dǎo)。同樣地，當(dāng)本發(fā)明多肽以不可溶形式表達(dá)時，例如作為聚集體、包含體或類似物，也可用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法將它們純化，包括通過離心從破碎的宿主細(xì)胞中分離包含體，用離液劑和還原劑使包含體溶解，稀釋溶解混合物，降低離液劑和還原劑的濃度以使多肽呈現(xiàn)生物活性構(gòu)象。后面的這些方法在下列文獻(xiàn)中有描述，所述文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)的方式并入Winkler等，Biochemistry，第25卷第40414045頁(1986)；Winkler等，Biotechnology，第3卷第992-998頁(1985)；Koths等，美國專利號4,569,790；和歐洲專利申請?zhí)?6306917.5和86306353.3.。
如此處所用，“有效量”指足夠改善自身免疫病癥狀的量。對特定患者的有效量依賴多種因素的不同而不同，這些因素如所治療疾病的狀況、患者的總體健康、用藥方法、副作用的嚴(yán)重性等。通常，F(xiàn)GF23多肽以含有有效量的FGF23多肽和藥物載體的藥物組合物形式給藥，藥物載體可以是任何相容的無毒物質(zhì)，它應(yīng)適合于將本發(fā)明組合物遞送給患者。通常，用于這些藥物的胃腸外用藥的組合物是已知的，例如Remington′sPharmaceutical Science，第十五版(Mack Publishing Company，Easton，PA1980)?？蛇x擇地，可以用可移植或可注射藥物遞送系統(tǒng)將本發(fā)明組合物送入患者體內(nèi)，例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，第24卷，第199-236頁(1984)；Lewis，編Controlled Release of Pesticides andPharmaceuticals(Plenum Press，New York，1981)；美國專利號3,773,919；美國專利號3,270,960；和類似文獻(xiàn)。
當(dāng)胃腸外用藥時，F(xiàn)GF23多肽與藥物載體結(jié)合制成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳劑)。此載體的例子是生理鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank溶液。也可以使用非水性載體例如固定油和油酸乙酯。優(yōu)選的載體是5％葡萄糖/鹽水。載體可含有少量添加劑例如能增強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如，緩沖液和防腐劑。FGF23多肽優(yōu)選制成純化形式，基本上不含聚集體和其他蛋白，濃度為約5到20μg/ml之間。優(yōu)選地，以連續(xù)輸注方式施用FGF23多肽，以至遞送量約為50-800μg每天(即，約1-16μg/kg/天)。每日輸注率可以不同，這可基于對副作用的監(jiān)測，例如對血細(xì)胞數(shù)、體溫等的監(jiān)測而改變。
可以從被載有FGF23多肽基因的表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中純化FGF23多肽。優(yōu)選地，從被pcD表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中純化FGF23多肽。用pcD轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞的過程如下轉(zhuǎn)染前一天，把約106COS7猴細(xì)胞種在單個100mm平板上在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DME)中。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)染，吸出每個平板中的培養(yǎng)基并替換為含有50mM TrisHCl pH7.4、400mg/ml DEAE-葡聚糖和50μg質(zhì)粒DNA的4mlDME。37℃溫育平板4小時，然后去除含有DNA的培養(yǎng)基，用5ml無血清DME洗平板兩次。DME加回平板，然后37℃再溫育3小時。用DME洗平板一次，之后以標(biāo)準(zhǔn)濃度加入含有4％胎牛血清、2mM谷胺酰胺、青霉素(100μ/L)和鏈霉素(100μg/L)的DME。然后37℃溫育細(xì)胞72小時，之后收集生長培養(yǎng)基用于純化FGF23多肽。可選擇地，可以用實施例中描述的電穿孔完成轉(zhuǎn)染。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA通過在大腸桿菌MC1061(見Casadaban和Cohen，J.Mol.Biol.，第138卷，第179-207頁(1980)描述)或類似的生物體中擴增含有FGF23多肽cDNA插入的pcD(SRα)或類似表達(dá)載體獲得。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)或Ausubel等(1990，上面引文)。
當(dāng)本發(fā)明拮抗劑來自抗體時，它們通常進(jìn)行腸胃外用藥，優(yōu)選靜脈內(nèi)用藥。由于此蛋白或肽拮抗劑可能有免疫原性，它們優(yōu)選緩慢用藥，利用常規(guī)靜脈內(nèi)用藥裝置或從皮下貯庫給藥，如Tomasi等，美國專利號4,732,863中的教導(dǎo)。當(dāng)腸胃外用藥時，抗體和/或片段與藥物載體結(jié)合配制成單位劑量可注射形式，如上所描述?？贵w優(yōu)選地制成純化形式，基本上不含聚集體、其他蛋白、內(nèi)毒素等，濃度為約5到30mg/ml，優(yōu)選10到20mg/ml。優(yōu)選地，內(nèi)毒素水平低于2.5EU/ml。
選擇拮抗劑的用藥方案依賴于幾個因素，包括拮抗劑的血清代謝率、與所治療疾病有關(guān)的FGF23多肽的血清水平、拮抗劑的免疫原性、目標(biāo)FGF23多肽的可達(dá)性(例如，當(dāng)非血清FGF23多肽待被封閉時)、與FGF23多肽和拮抗劑相比FGF23多肽和其受體的相對親合力等。優(yōu)選用藥方案使遞送給患者的拮抗劑量達(dá)到最大，同時又符合副作用可接受水平。因此，遞送的拮抗劑的量部分地取決于特定拮抗劑和所治療疾病的嚴(yán)重性。在有關(guān)抗體治療用途的文獻(xiàn)中可找到對選擇合適劑量的指導(dǎo)，例如Bach等，第22章，F(xiàn)errone等，編，Handbook of Monoclonal Antibodies(NogesPublications，Park Ridge，NJ，1985)；Russell，第303-357頁，和Smith等，第365-389頁，Haber等，編.Antibodies in Human Diagnosis and Therapy(Raven Press，New York，1977)。優(yōu)選地，當(dāng)拮抗劑含有單克隆抗體或其Fab大小的片段(包括結(jié)合組合物)時，劑量范圍為約1-20mg/kg每天。更優(yōu)選劑量是約1-10mg/kg每天。
實施例1FGF23多肽的化學(xué)合成在本實施例中，用天然化學(xué)連接合成有圖1序列的多肽。從以下列出的以前合成的寡肽中間體裝配全長多肽(上標(biāo)數(shù)字表示片段在圖1序列中的位置)。如以下更完全地描述，用Dawson等，Science，第266卷第776-779頁(1994)和Hackeng等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第96卷第10068-10073頁(1999)的天然化學(xué)連接化學(xué)，首先將片段1與片段2偶聯(lián)形成第一產(chǎn)物，經(jīng)制備HPLC純化之后，第一產(chǎn)物與片段3偶聯(lián)形成目的多肽。
SEO片段 ID NO 寡肽中間體的序列
硫酯的形成。在產(chǎn)生硫酯的樹脂上合成片段2和3。為此目的，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使Leu-PAM樹脂與S-乙?；?硫基乙酸五氟苯酯或S-三苯甲基巰基丙酸偶聯(lián)；首先，在DMF中用10％巰基乙醇、10％哌啶處理30分鐘去除乙?；Ｗo(hù)基之后，將產(chǎn)生的樹脂用作肽鏈延伸的起始樹脂，規(guī)范0.2mmol。用標(biāo)準(zhǔn)原位中和偶聯(lián)(例如，Schnolzer等，Int.J.Peptide ProteinRes.，第40卷第180-193頁(1992))作用1小時形成硫酯，合成片段3時用Boc-Ile-OH及合成片段4時用Boc-Phe-OH。之后，用TFA中的2.5％三異丙基硅烷和2.5％H2O處理兩次各1分鐘以去除三苯甲基保護(hù)基。利用標(biāo)準(zhǔn)原位中和偶聯(lián)方案作用1小時，將第一個氨基酸(片段2用Boc-Ala-OH)立即人為地偶聯(lián)到樹脂上。根據(jù)本發(fā)明，通過Boc-硫代脯氨酸(Boc-SPr)偶聯(lián)到各個鏈的末端代替常規(guī)Nα或Sβ保護(hù)的Cys，以保護(hù)片段2和3的N端Cys殘基的Nα，Brik等，J.Org.Chem.，第65卷第3829-3835頁(2000)。
肽合成。在來自Applied Biosystems的定做的改良433A肽合成儀上進(jìn)行固相合成，其中對于逐步Boc化學(xué)鏈延伸使用原位中和/2-(1H-苯并三唑-l-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)活化方案，如Schnolzer等，Int.J.Peptide Protein Res.，第40卷第180-193頁(1992)所述。每個合成循環(huán)的組成為用純TFA處理1到2分鐘除去Nα-Boc、DMF流洗1分鐘、在過量DIEA存在下用2.0mmol預(yù)活化Boc-氨基酸偶聯(lián)10分鐘、第二次DMF流洗。在過量DIEA(6mmol)存在下用1.8mmol HBTU(DMF中0.5M)預(yù)活化Na-Boc-氨基酸(2mmol)3分鐘。Gln殘基偶聯(lián)之后，用TFA去保護(hù)前和后用二氯甲烷流洗，以防止可能的高溫(TFA/DMF)催化的吡咯烷酮羧酸形成。有側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸是Boc-Arg(對甲苯磺?；?-OH、Boc-Asn(愣只)-OH、Boc-Asp(O-環(huán)己基)-OH、Boc-Cys(4-甲基芐基)-OH、Boc-Gln(O-環(huán)己基)-OH、Boc-His(二硝基苯基芐基)-OH、Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH、Boc-Ser(芐基)-OH、Boc-Thr(芐基)-OH、Boc-Trp(甲?；?-OH、Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH。使用的其他氨基酸無側(cè)鏈保護(hù)。在Boc-Leu-O-CH2-Pam樹脂上合成C端片段1(每g填裝樹脂0.71mmol)，而在Boc-Xaa-S-CH2-CO-Leu-Pam樹脂上開始片段2和4的機械輔助合成，在Boc-Xaa-S-(CH2)2-CO-Leu-Pam樹脂上合成片段3。在標(biāo)準(zhǔn)情況下通過S-乙?；?巰基乙酸五氟苯酯或S-三苯甲基巰基丙酸與Leu-PAM樹脂偶聯(lián)而獲得后兩種樹脂；首先在DMF中用10％巰基乙醇、10％哌啶處理30分鐘去除乙酰保護(hù)基之后，將產(chǎn)生的樹脂用作肽鏈延伸的起始樹脂，規(guī)模0.2mmol。之后，用TFA中2.5％三異丙基硅烷和2.5％H2O處理兩次各1分鐘去除三苯甲基保護(hù)基。用標(biāo)準(zhǔn)原位中和偶聯(lián)方案作用1小時，將第一個氨基酸立即人為地與樹脂偶聯(lián)。
鏈裝配完成之后，用無水氟化氫在0℃處理1小時，并用5％對甲酚作清除劑將肽去保護(hù)并從樹脂上切下。在所有過程中，咪唑側(cè)鏈的2，4-二硝基苯基(DNP)保護(hù)基仍留在His殘基上，因為DNP去保護(hù)步驟與C端硫酯基團不相容。然而連接反應(yīng)中DNP可被硫醇逐漸去除，產(chǎn)生去保護(hù)的His。切除之后，兩個肽都用冰冷乙醚沉淀，在含水乙腈中溶解并凍干。用在緩沖液A(H2O/0.1％三氟乙酸)中的緩沖液B(乙腈/0.1％三氟乙酸)線性梯度通過在C18柱上HPLC純化肽，并在214nm用UV檢測。用Esquire儀器(Brucker，Bermen，德國)通過電噴射質(zhì)譜(ESMS)分析樣品。
天然化學(xué)連接。未保護(hù)片段的連接實施如下在6M鹽酸胍(GuHCl)、0.2M磷酸pH7.5中溶解等克分子數(shù)的量的干燥肽，以在pH約7.0得到1-5mM終肽濃度，然后加入1％芐硫醇、1％苯硫酚。通常，反應(yīng)過夜并用HPLC和電噴射質(zhì)譜監(jiān)測。隨后處理連接產(chǎn)物以去除仍存在的保護(hù)基。用肼將溶液pH升到9.0并在37℃溫育1小時以切割Trp的甲?；鶊F。打開N端噻唑烷環(huán)還需要在pH3.5加入固體甲氧胺(methoxamine)至0.5M終濃度，并于37℃再溫育2小時。在制備性HPLC純化之前加入10倍過量Tris(2-羧基乙基)膦。用ESMS鑒定含有多肽鏈的組分，合并并凍干。
在pH7.0，6M GuHCl中進(jìn)行寡肽中間體的連接。每個反應(yīng)物濃度為8mM，加入1％芐硫醇和1％苯硫酚以創(chuàng)造還原環(huán)境并利于連接反應(yīng)。37℃過夜攪拌之后觀察到幾乎定量的連接反應(yīng)。CH3-O-NH2·HCl作為粉末加入至0.1M終濃度并加入肼使pH升至pH9.0，以去除Trp128的甲酰基。37℃溫育1小時之后，向溶液中再加入CH3-O-NH2·HCl至0.5M終濃度。隨后用比肽10倍過量的Tris(2-羧基乙基膦)處理反應(yīng)混合物，15分鐘后，用制備性HPLC(C4，20-60％CH3CN，0.5％每分)純化連接產(chǎn)物，凍干并在-20℃貯存。同樣的步驟重復(fù)第二次。
通過在1M GuHCl、100mM Tris、10mM甲硫氨酸，pH8.6中溶解還原的凍干蛋白(約0.1mg/ml)，用空氣氧化使全長肽重折疊。輕柔攪拌過夜后，如上述通過RP-HPLC純化蛋白溶液。純化之后，通過在1M GuHCl、100mM Tris、10mM甲硫氨酸，pH8.6中溶解還原的凍干蛋白(約0.1mg/ml)，用空氣氧化使全長多肽重折疊。輕柔攪拌過夜后，如上述通過RP-HPLC純化蛋白溶液。
實施例2對FGF23多肽特異的單克隆抗體用COS7細(xì)胞表達(dá)的FGF23多肽的半純化制品免疫雄性Lewis大鼠。首先用在弗氏完全佐劑中的約50μg FGF23多肽免疫大鼠，之后用在弗氏不完全佐劑中的同量物質(zhì)強化免疫兩次。采集試驗血液。用磷酸緩沖鹽溶液中的25μg多肽最后一次加強免疫動物，四天后取脾臟用于融合。
約3×108個大鼠脾細(xì)胞與等量的P3x63-AG8.653小鼠骨髓瘤細(xì)胞(可從ATCC獲得，保藏號CRL1580)融合。在3840微量滴定板孔的每個孔中種5.7×104個親本骨髓瘤細(xì)胞。之后用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行融合和隨后的雜交瘤培養(yǎng)，例如Chretien等，J.Immunol.Meth.，第117卷，第67-81頁(1989)所述方法。融合12天后，收集上清液并在包被有COS7產(chǎn)生的FGF23多肽的PVC平板上用簡接ELISA篩選。
本發(fā)明以上實施方案的描述是為了闡釋和描述的目的。它們無意于將本發(fā)明限于所公開的這些精確形式，而且顯而易見地鑒于以上教導(dǎo)內(nèi)容許多修飾和改變是可能的。選擇和描述實施方案是為了最好地解釋本發(fā)明的原理，由此使本領(lǐng)域技術(shù)人員能在各種實施方案中及利用適于所考慮的特定用途的不同修飾最好地實施本發(fā)明。本發(fā)明的范圍在由此后所附的權(quán)利要求書限定。
序列表<110> 基因蛋白公司(GENEPROT，INC.)<120> 與人成纖維細(xì)胞生長因子相關(guān)的組合物<130> 5004-02<140>
<141> 2001-05-24<160> 11<170> Microsoft Word 2000<210> 1<211> 251<212> PRT<213> 人(Homo Sapiens)<220>
<221> 信號序列<222> (1)..(24)<223> 可能的<220>
<221> 肽<222> (25)..(251)<223> 成纖維細(xì)胞生長因子-23<400> 1Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95
Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185 190Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250<210> 2<211> 75<212> PRT<213> 人<220>
<221> 二硫化物<222> (30)..(68)<223> 預(yù)測的<220>
<221> 位點<222> (7)..(7)<223> 預(yù)測的PHEX內(nèi)肽酶切割位點
<220>
<221> 位點<222> (8)..(8)<223> 預(yù)測的PHEX內(nèi)肽酶切割位點<220>
<221> 位點<222> (12)..(12)<223> 預(yù)測的PHEX內(nèi)肽酶切割位點<220>
<221> 位點<222> (39)..(39)<223> 預(yù)測的PHEX內(nèi)肽酶切割位點<220>
<221> 位點<222> (46)..(46)<223> 預(yù)測的PHEX內(nèi)肽酶切割位點<400> 2His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val1 5 10 15Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln20 25 30Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu35 40 45Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly50 55 60Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile65 70 75<210> 3<211> 8<212> PRT<213> 人<400> 3
Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile5<210> 4<211> 38<212> PRT<213> 人<220>
<221> 二硫化物<222> (30)..(68)<223> 可能的<400> 4Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser5 10 15Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly20 25 30Gly Thr Gly Pro Glu Gly35<210> 5<211> 29<212> PRT<213> 人<400> 5His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val1 5 10 15Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser20 25<210> 6<211> 6<212> PRT
<213> 人<220>
<221> 注釋<222> (2)..(5)<223> 與SwissProt登錄號PTHR_HUMAN[143..146]同一<400> 6His Thr Arg Ser Ala Glu1 5<210> 7<211> 5<212> PRT<213> 人<400> 7Asp Asp Ser Glu Arg1 5<210> 8<211> 4<212> PRT<213> 人<400> 8Asp Ser Glu Arg1<210> 9<211> 27<212> PRT<213> 人<400> 9Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro1 5 10 15
Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser Ala Glu20 25<210> 10<211> 7<212> PRT<213> 人<400> 10Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser1 5<210> 11<211> 30<212> PRT<213> 人<400> 11Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly1 5 10 15Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile20 25 30
權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的分離多肽。
2.分離的多核苷酸，其具有編碼具SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
3.藥物組合物，其含有具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽及可藥用載體。
4.分離的肽，其具有選自如下的氨基酸序列SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其具有SEQ ID NO6中所列的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求4的分離的肽，其具有SEQ ID NO7中所列的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求4的分離的肽，其具有SEQ ID NO8中所列的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求4的分離的肽，其具有SEQ ID NO9中所列的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求4的分離的肽，其具有SEQ ID NO10中所列的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求4的分離的肽，其具有SEQ ID NO11中所列的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了FGF23多肽、制備此肽的方法和組合物，用此多肽及其激動劑和拮抗劑治療磷酸消瘦病的方法。
文檔編號C07K14/50GK1602355SQ02808877
公開日2005年3月30日 申請日期2002年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月26日
發(fā)明者L·布蓋勒瑞特, A·拜羅氏 申請人:杰諾瓦有限公司