專利名稱：熒光顯微鏡載玻片的制作方法
熒光顯微鏡載玻片相關(guān)申請的參考本申請要求美國臨時(shí)專利申請No. 61/336，115(2010年I月15日提交)的優(yōu)先權(quán)。簡述本教導(dǎo)涉及用于增加找到焦點(diǎn)區(qū)域(field of focus)的效率以及增加在利用熒光顯微技術(shù)讀取載玻片(slide)時(shí)視場的準(zhǔn)確性的設(shè)備和方法。結(jié)核病(TB)成為了全球性的健康問題。估計(jì)世界人口的三分之一感染了 TB致病媒介，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。在大部分情況中，疾病保持潛伏狀態(tài)，大約5至10%的受感染人群在他們生命中的一定時(shí)期將繼續(xù)發(fā)展成為活動性疾病。剩下的是未被發(fā)現(xiàn)的和/或未治療的，患者死亡率為大約50%。另外，統(tǒng)計(jì)分析顯示未治療的 受感染個(gè)體每年將繼續(xù)感染10至15個(gè)其他個(gè)體。至少從1990開始(其中在1990時(shí)世界衛(wèi)生組織開始追蹤發(fā)生率數(shù)據(jù))，世界范圍內(nèi)的活動性TB的發(fā)生率呈增加趨勢。評估顯示了如果當(dāng)前全球TB狀況不改善，則到2020年將會有一億五千萬人發(fā)展為活動性結(jié)核病以及三千六百萬人將死亡。全球TB問題由于增加的HIV流行病而進(jìn)一步惡化?；加蠬IV的人感染了結(jié)核分枝桿菌，則發(fā)展為活動性TB的風(fēng)險(xiǎn)增加。事實(shí)上，TB是感染了 HIV個(gè)體的第一死亡原因。減小這個(gè)疾病的發(fā)生率是全球優(yōu)先的且是2000年發(fā)布的聯(lián)合國千年發(fā)展目標(biāo)的主要部分。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，世界衛(wèi)生組織(WHO)已經(jīng)開發(fā)了 STOP TB策略，該策略是用于減小全球TB負(fù)擔(dān)的多方位方法。該策略的關(guān)鍵是通過高質(zhì)量保證的細(xì)菌學(xué)來檢測病例。特別地，已經(jīng)制定了大于70%的涂陽(smear positive)病例檢測的全球目標(biāo)。在長達(dá)一世紀(jì)的時(shí)間內(nèi)，TB檢測的重要手段是痰涂片明視野顯微鏡且其仍是全球范圍內(nèi)最常用的病例檢測技術(shù)。普遍使用該技術(shù)的原因部分是因?yàn)樵摲椒ㄋ璧馁Y源相對較少。這對于發(fā)展中國家是尤其重要的，相對工業(yè)化國家，發(fā)展中國家TB(和HIV)感染的形勢嚴(yán)峻。雖然明視野顯微鏡在TB健康方面起作用，但是其靈敏度較低，約為60%。在HIV流行程度高的情況中，該方法靈敏度顯著降低，這是因?yàn)榻?jīng)常發(fā)現(xiàn)HIV患者中的桿菌負(fù)荷小。此外，在化驗(yàn)體積(assay volume)高的實(shí)驗(yàn)室中,檢查時(shí)間可能減小,導(dǎo)致靈敏度進(jìn)一步損失。當(dāng)前最常使用的明視野痰涂片染色技術(shù)是齊-尼氏(ZN)方法，該方法使用品紅染劑(fuschin stain)、酸-醇脫色劑以及亞甲基藍(lán)復(fù)染劑。該染色方法和其他染色方法利用結(jié)核分枝桿菌和其他分枝桿菌類(一起被稱為抗酸桿菌(acid fast bacilli) (AFB))的“耐酸性”的優(yōu)勢。在這些方法中，AFB吸收染色但是具有酸脫色抗性，而一般的呼吸道菌群和碎片退色。ZN染色導(dǎo)致AFB相對藍(lán)色背景被染為紅紫色。通過該技術(shù)以及利用其他明視野方法，較難從背景材料中鑒別和區(qū)分桿菌，且熟練技術(shù)人員需要較長的時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)檢查。在很多TB實(shí)驗(yàn)室設(shè)置中時(shí)間和熟練技術(shù)人員通常是有限的?；谏鲜觯顝V泛使用的檢測結(jié)核病的測試是利用來自標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡的白光進(jìn)行明視野顯微鏡分析。用于該檢測的標(biāo)準(zhǔn)觀察倍數(shù)是1000倍。但是，由于細(xì)菌的形態(tài)是獨(dú)特的以及具有大量區(qū)別特征，以及由于上述的ZN染色困難，需要相當(dāng)熟練的技術(shù)員和/或?qū)嶒?yàn)室專家來檢測結(jié)核病。另外，明視野顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)的和當(dāng)前可接受的測試參數(shù)需要一百個(gè)以1000倍的倍數(shù)的分離的觀察“場”來進(jìn)行診斷。該方法是特別耗時(shí)的以及限制顯微鏡技術(shù)人員或技術(shù)員在給定的時(shí)間內(nèi)可以準(zhǔn)確讀取的載玻片數(shù)目。相應(yīng)地，對顯微鏡技術(shù)人員的需求比當(dāng)前可支配的顯微鏡技術(shù)人員顯著更大。在世界上的一部分地區(qū)確實(shí)如所述，在這些地區(qū)中，結(jié)核病測試是重要的且是需要的，包括非洲和亞洲。還顯示熒光顯微鏡(FM)可用于檢測AFB。FM技術(shù)利用熒光染料例如金胺_0，以及還使用一些形式的脫色劑和淬滅劑。通過FM，AFB染色(AFBstain)從綠色變?yōu)辄S色，背景為暗色背景，從而相比較明視野方法而言，使得生物體和背景之間存在顯著差別。該差別的增加減小了眼睛壓力且允許使用具有更大視場的物鏡，從而減小總檢查時(shí)間?？傮w來說，相比較標(biāo)準(zhǔn)明視野顯微鏡而言，證實(shí)了基于FM的TB檢測提供更高的靈敏度以及更短的檢查時(shí)間。基于這些優(yōu)勢以及新型發(fā)光二極管(LED)熒光顯微鏡的可獲得性，世界衛(wèi)生組織積極促進(jìn)利用熒光顯微鏡來診斷結(jié)核病的全球化。雖然具有所認(rèn)識到的優(yōu)勢，F(xiàn)M(常規(guī)的和基于LED的兩者)仍然存在著明顯的問題，這影響了它的利用和廣泛使用。所述問題圍繞以下事實(shí)FM是暗視野技術(shù)，如此則需要 樣品提供光信號。在TB涂片的情況中，背景熒光被淬滅(對于增加信噪比是重要的)。桿菌負(fù)荷小或不存在桿菌的樣品中，檢測區(qū)域(examination field)提供的在其上聚焦的信號少或不提供信號。因此，較難確保發(fā)現(xiàn)了陰性結(jié)果的測定的質(zhì)量。另外，來自熒光染色的AFB的信號較小(相比較明視野方法而言)且僅在少量焦平面(focal plane)內(nèi)可見。此時(shí)，不熟練的使用者較易由于遺漏信號可辨別的焦平面而忽略陽性樣品。因此，相比較明視野顯微鏡而言，熒光顯微鏡需要顯著更多的培訓(xùn)以便顯微鏡技術(shù)人員熟悉找到焦平面。這主要是因?yàn)槊饕曇凹夹g(shù)也允許顯微鏡技術(shù)人員觀察包括背景材料的非-AFB材料，其也更容易在焦平面的“上方”和“下方”看見。不易對熒光顯微鏡進(jìn)行調(diào)焦不僅對于不熟練的技術(shù)員是個(gè)問題，對于經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)員也是個(gè)問題。結(jié)果是顯微鏡技術(shù)人員非常難確定他或她是否在焦點(diǎn)對準(zhǔn)(in focus)的條件下進(jìn)行觀察，因此，顯微鏡技術(shù)人員通常不能很有信心地報(bào)告不存在結(jié)核病。最后，對于FM顯微鏡技術(shù)人員仍非常困難的是確定他們是否觀察相同的橫向(lateral)視場或新視場，特別是當(dāng)存在較少的背景材料或不存在背景材料以提供內(nèi)部參考點(diǎn)時(shí)，當(dāng)在視場之間移動時(shí)，結(jié)果是即使利用熒光顯微鏡技術(shù)，也缺少結(jié)果的可預(yù)見性，以及讀取載玻片時(shí)的準(zhǔn)確程度小于所需的準(zhǔn)確程度。另外,FM對于全球大多數(shù)健康機(jī)構(gòu)而言是不適合的(在一些情況中是不適合的)。缺少適合性是因?yàn)榧夹g(shù)存在的顯著問題，所述問題包括昂貴的資金投入；復(fù)雜的、短壽命的以及昂貴的光源；技術(shù)員對于UV導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂；皆知的精密的儀器；對穩(wěn)定電源的需求；以及對培訓(xùn)的顯著需求。發(fā)光二極管(LED)技術(shù)的進(jìn)步帶來了明亮的、耐用的光源，其由用于取代常規(guī)的FM光源的低電壓電源供電，從而排除了上述問題。事實(shí)上，制造者已引入基于LED的附件，其可以將現(xiàn)有的明視野顯微鏡改造為熒光顯微鏡。和常規(guī)FM—樣，相比較明視野技術(shù)而言，新型LED FM技術(shù)已顯示出具有增加的TB檢測靈敏度。如上述，這些進(jìn)步使得WHO認(rèn)可使用基于LED的FM。很可能繼續(xù)認(rèn)可基于FM的技術(shù)，作為在全球范圍內(nèi)的通過涂片顯微鏡來進(jìn)行TB檢測的方法的選擇。但是，由于在全球范圍內(nèi)促進(jìn)實(shí)施FM，確保技術(shù)員適當(dāng)?shù)貦z查涂片的機(jī)制對于有質(zhì)量保證的細(xì)菌學(xué)是關(guān)鍵的。因此，在本領(lǐng)域中存在經(jīng)證實(shí)的對于顯微鏡讀取技術(shù)的需求，所述顯微鏡讀取技術(shù)減小顯微鏡技術(shù)人員的壓力、增加讀取人員結(jié)果的準(zhǔn)確度以及增加讀取載玻片包括結(jié)核病載玻片的速度和效率。還進(jìn)一步存在對于以下技術(shù)的需求，所述技術(shù)使得熒光顯微鏡可以較易地適應(yīng)和使用，包括全球不發(fā)達(dá)地區(qū)以及存在大量待讀取的載玻片的區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本教導(dǎo)提供有用的設(shè)備，其包括根據(jù)策略壓印(imprint) 了設(shè)置的油墨的顯微鏡載玻片，當(dāng)利用熒光顯微技術(shù)讀取載玻片時(shí)所述油墨發(fā)熒光，沉積在載玻片上的圖案使得顯微鏡技術(shù)人員可以找到焦點(diǎn)區(qū)域以及準(zhǔn)確鑒定視場(field of view)。


熟練技術(shù)人員要理解的是下述附圖僅用于說明的目的。附圖不意在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。圖I說明了根據(jù)本教導(dǎo)的具有橢圓形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖2示出了根據(jù)本教導(dǎo)的具有橢圓形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖3是根據(jù)本教導(dǎo)的具有橢圓形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖4說明了根據(jù)本教導(dǎo)的具有橢圓形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖5示出了根據(jù)本教導(dǎo)的具有矩形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖6是根據(jù)本教導(dǎo)的具有圓形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。

圖7說明了根據(jù)本教導(dǎo)的具有三角形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖8示出了根據(jù)本教導(dǎo)的具有菱形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖9是根據(jù)本教導(dǎo)的具有梯形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。圖10說明了根據(jù)本教導(dǎo)的具有正方形設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡載玻片的一實(shí)施方式。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本教導(dǎo)的突光顯微鏡載玻片70包括顯微鏡基底(microscopesubstrate) 72，其具有發(fā)熒光的標(biāo)記74。該設(shè)備使得顯微鏡技術(shù)人員可以鑒定和保持針對抗酸桿菌突光顯微鏡的合適焦平面。顯微鏡載玻片70的突光劃界(demarcation)或“標(biāo)記”74，其通常采用形狀、符號等形式，可以用于最初聚焦以及用作檢查期間的焦點(diǎn)引導(dǎo)。這些熒光界標(biāo)(landmark)也可以大于物鏡視場以便于顯微鏡可以較易置于焦點(diǎn)上方的中心而無需通過顯微鏡目鏡找到界標(biāo)。一旦置于界標(biāo)上方的中心，顯微鏡技術(shù)人員可以調(diào)整焦距(focus)直到熒光標(biāo)記74進(jìn)入焦距。如果未找到焦平面，顯微鏡技術(shù)人員可以分離載玻片和物鏡至大于物鏡的工作距離的距離，重新檢查物鏡相對熒光開始點(diǎn)的位置，以及向下聚焦直到找到正確的焦平面。顯微鏡技術(shù)人員然后可以檢查標(biāo)本區(qū)域。當(dāng)在檢查期間遇到熒光界標(biāo)74，顯微鏡技術(shù)人員可以確定聚焦的程度以及根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。本文的教導(dǎo)用于顯微鏡技術(shù)人員標(biāo)定樣品區(qū)域78的邊界，這對于培訓(xùn)技術(shù)員如何確保“很好準(zhǔn)備”的基底是重要的。在這種情況下，技術(shù)員涂片標(biāo)本(例如來自患者)以完全填充被標(biāo)定的區(qū)域，確保向基底72施用了充足的標(biāo)本。邊界標(biāo)記和邊界內(nèi)的標(biāo)記通過標(biāo)本涂片是可見的以及提供通過估計(jì)標(biāo)記74被覆蓋的程度一致地測量涂片厚度的手段。合適的涂片量和厚度對于確保TB測試的靈敏性是關(guān)鍵性的，因?yàn)楸〉?、稀少的?biāo)本減小了可用于鑒定的有機(jī)體的數(shù)目。目前的技術(shù)不提供內(nèi)置的測量(built in gauge)來用于檢測準(zhǔn)備載玻片時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)一致性。因此，這影響了通過所述載玻片生成的數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性和一致性。通過熒光顯微鏡載玻片70的標(biāo)記74，實(shí)現(xiàn)了載玻片準(zhǔn)備的可預(yù)見性，其提高了測試結(jié)果的質(zhì)量，以及標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)。熒光顯微鏡載玻片70的另外特征是劃界使得顯微鏡技術(shù)人員可以建立簡單的橫坐標(biāo)系統(tǒng)從而顯微鏡技術(shù)人員較易從重要發(fā)現(xiàn)物中區(qū)分制造品(artifact)。該劃界系統(tǒng)使得在多種情況中可以重新查看相同的載玻片以及再現(xiàn)觀察結(jié)果。另外，在通過第二方的例如在質(zhì)量監(jiān)查或?qū)嶋H測驗(yàn)期間的后續(xù)讀取期間更容易發(fā)現(xiàn)熒光發(fā)現(xiàn)物。這增加了讀取結(jié)核病載玻片的質(zhì)量控制且有利于培訓(xùn)。當(dāng)前利用已有的技術(shù)不能實(shí)現(xiàn)這樣的再現(xiàn)性。熒光顯微鏡載玻片70的另外方面是它使得顯微鏡技術(shù)人員、技術(shù)員以及其他使用者可以檢查合適量的標(biāo)本。在此，發(fā)熒光以及因此在觀察時(shí)通過暗視野顯微鏡是可見的界標(biāo)74提供開始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)，在橫穿開始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)時(shí)確保檢查了正確數(shù)目(所需數(shù)目) 的場。在一些實(shí)施方式中，熒光顯微鏡載玻片70結(jié)合使用一致的(或預(yù)先確定的)位置用于顯微鏡技術(shù)人員分析的開始。這提供給顯微鏡技術(shù)人員針對開始、進(jìn)行和停止讀取的再現(xiàn)性方法，以及允許以標(biāo)準(zhǔn)化模式橫穿載玻片進(jìn)行觀察。由于具有以可預(yù)見的方法啟動載玻片讀取的能力，上述位置使得顯微鏡技術(shù)人員可以更有效以及更迅速地觀察更大的觀察區(qū)域。由于載玻片的讀取過程在身體上以及精神上耗盡顯微鏡技術(shù)人員和其他觀察員的精力，存在于載玻片70上的熒光劃界74也用于減少顯微鏡技術(shù)人員的疲乏以及因此提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。界標(biāo)74的心理影響減少了顯微鏡技術(shù)人員的壓力以及實(shí)際提供給顯微鏡技術(shù)人員經(jīng)設(shè)計(jì)的激勵以在測試中結(jié)束對載玻片以及焦點(diǎn)的觀察。根據(jù)本文教導(dǎo)的突光顯微鏡載玻片70的另一方面是意在標(biāo)本定量化。具有突光特征的通過暗視野顯微鏡可見的界標(biāo)74可以劃界已知量的標(biāo)本區(qū)域78。這些界標(biāo)74使得顯微鏡技術(shù)人員可以準(zhǔn)確地檢查分離的視野，而沒有重疊(現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)記載了重疊)。由于不存在重疊，統(tǒng)計(jì)變異的風(fēng)險(xiǎn)小得多，從而允許更準(zhǔn)確地平均每個(gè)視野的細(xì)胞樣品。當(dāng)通過顯微鏡目鏡可見的標(biāo)記74用作邊界(邊界也算在內(nèi)(in which to count))時(shí)，可以測定熒光物體濃度。根據(jù)本教導(dǎo)的突光顯微鏡載玻片70有利地提供了 (a)突光參考,用于確定系統(tǒng)是否合適地運(yùn)行以及(b)熒光校準(zhǔn)數(shù)據(jù)。在相同載玻片上的已知的或恒量熒光值的界標(biāo)或具有變化的已知的熒光值的界標(biāo)可以用于確定設(shè)備和/或試劑是否正確地起作用。這樣的界標(biāo)74也可以用于生成熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線(數(shù)字圖像或光測量設(shè)備也可用于所述目的)。根據(jù)本教導(dǎo)的熒光顯微鏡載玻片70改進(jìn)了載玻片的準(zhǔn)確性和可用性。因此，本發(fā)明設(shè)備減小了在本領(lǐng)域中利用熒光顯微鏡技術(shù)的阻力，增加了顯微鏡技術(shù)人員對其的接受度。實(shí)施例本教導(dǎo)的設(shè)備使得可以利用熒光顯微鏡快速地以及準(zhǔn)確地檢測樣品中的受關(guān)注成分的存在(例如抗酸桿菌)。熒光顯微鏡基底70的特征為標(biāo)本容器(receptacle)(例如顯微鏡載玻片或蓋玻片)72,其包括在容器表面的標(biāo)記74 :該標(biāo)記發(fā)出突光、劃界樣品標(biāo)本區(qū)域78、鑒定檢查開始區(qū)域以及劃界檢查距離。此外,突光標(biāo)記74確定了樣品用的祀?yún)^(qū)域(target area) 12。另外,祀?yún)^(qū)域12附近(即緊鄰、相鄰或內(nèi)部)的熒光標(biāo)記74使得顯微鏡技術(shù)人員或其他使用者可以確定焦點(diǎn)區(qū)域。靶區(qū)域12附近的熒光標(biāo)記74也使得使用者可以鑒定視場。熒光顯微鏡載玻片70的標(biāo)記74可以采用任何所需的形式，包括但不限于線、蝕刻圖案(etchings)、符號、數(shù)字、文本、幾何形狀(例如橢圓10、30、44、50 ;圓80 ;三角形82 ；矩形76;菱形84;正方形88;梯形86)或其他不同的構(gòu)造。標(biāo)記74可以具有任何尺寸(例如寬度、高度或厚度)，其容納被認(rèn)為是AFB涂片的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)域。例如，熒光顯微鏡載玻片70的標(biāo)記74可以具有的寬度為大約I. O至3. 0cm、高度為大約O. 5至2. Ocm以及厚度為大約O. 01至O. 2cm。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記74是平的以及通常緊靠顯微鏡載玻片70。 在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記74被升高使其位于顯微鏡載玻片70之上或延伸超過其平面(或界限)。顯微鏡基底70包括顯微鏡標(biāo)本容器72，其例如由使其可以在顯微鏡下觀察的材料制造的載玻片、蓋玻片或它們的組合。在一些實(shí)施方式中，基底是透明的且包括玻璃、塑料或硅材料。在容器72的表面上、樣品/標(biāo)本區(qū)域78的內(nèi)部或附近包含了一系列具有熒光性質(zhì)的標(biāo)記，例如具有熒光顏料或染料的涂料、油墨、自發(fā)熒光油墨或蝕刻油墨(etchings),其形成用于具體的突光應(yīng)用。油墨可來自工業(yè)熟知的來源。一個(gè)實(shí)例是組合了熒光顏料例如 BASF Lumogen F Yellow 083 或 DayGlo Signal Green AX-18 的Markem4166Series Ink。突光標(biāo)記的載玻片可以利用標(biāo)準(zhǔn)沉積技術(shù)和/或玻璃印刷工藝(glass printing procedures)例如絲網(wǎng)印刷或移印工藝來制造。涂料的熒光強(qiáng)度可以通過調(diào)節(jié)熒光顏料或染料的濃度或者通過利用非-熒光涂料稀釋熒光涂料進(jìn)行調(diào)整。所需的熒光強(qiáng)度針對每種應(yīng)用可以是具體的。例如，在TB顯微鏡中，對熒光進(jìn)行最小化以防止眼睛壓力和標(biāo)本區(qū)域中的熒光攜帶污染(carryover)，但是保持一定亮度使其足以利用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡裝置清楚可見。為了制造熒光顯微鏡載玻片70，將顏料、染料等以合適的比率加入油墨中且混合至所需程度的均勻性。油墨可以根據(jù)需要通過針對熒光標(biāo)準(zhǔn)的測試進(jìn)行質(zhì)量控制。熒光涂料或油墨然后可以通過本領(lǐng)域中已知的沉積或印刷技術(shù)例如移印或絲網(wǎng)印刷施用至顯微鏡標(biāo)本容器72。取決于熒光物質(zhì)或所使用的基體，可以在以下沉積中使用熱或UV-光固化。在印刷或另外以聚集體(例如以大量片(large sheets)的方式)制造的熒光顯微鏡載玻片70實(shí)施方式中,載玻片可以被切割成一定尺寸。如此處所用的，涉及“水平的”和“垂直的”方向是指當(dāng)觀察者以附圖中所示方向向下觀看載玻片時(shí)的方向。圖I中的標(biāo)記74包括具有策略尺寸的橢圓形10，其具有的結(jié)構(gòu)為大約3cm x 2cmX O. Icm(分別為寬度、高度和厚度)。該橢圓形10劃界了標(biāo)本78區(qū)域，其被認(rèn)為是與AFB涂片統(tǒng)計(jì)相關(guān)的。嵌在橢圓形上且位于策略選定位置上的是目標(biāo)點(diǎn)，從12至22，其直徑大于橢圓線的寬度。這些目標(biāo)區(qū)域12提供用于找到初始焦距(initial focus)的界標(biāo)，以及用于確定檢查的開始點(diǎn)。垂直線24在橢圓內(nèi)部從橢圓形10的頂部中心(top center)和底部中心(bottom center)延伸,提供了中間焦點(diǎn)檢查點(diǎn)24。垂直線24也標(biāo)出了以下點(diǎn)，在該點(diǎn)處掃描了 62. 5視場(從開始點(diǎn)16、12、18或20)，當(dāng)水平行進(jìn)和使用100倍物鏡時(shí)。始于圓14和20的水平線26伸入橢圓10，再次確定中間焦點(diǎn)檢查點(diǎn)26以及標(biāo)記36. I視場，相對地從開始點(diǎn)16和12或18和22，以及使用100倍物鏡。當(dāng)圖I中的焦點(diǎn)檢查點(diǎn)26是線時(shí)，將理解包括檢查點(diǎn)的熒光標(biāo)記可以采用任何可以垂直于觀察方向取向的構(gòu)造。圖2示出了具有另外策略尺寸橢圓30的顯微鏡載玻片70，其具有的結(jié)構(gòu)為大約3cm X 2cm x O. Icm(分別為寬度、高度和厚度)。外橢圓30劃界被認(rèn)為是AFB涂片標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本區(qū)域。嵌在橢圓上的關(guān)鍵位置的為圓，從32至42，其直徑大于橢圓線，其提供界標(biāo)用于找到初始焦距和用于確定檢查開始點(diǎn)。橢圓30內(nèi)部的中心是更小的同心橢圓44，其具有的結(jié)構(gòu)為大約2cm xlcm x O. 05cm(分別為寬度、高度和厚度)。該構(gòu)造特別適用于期望在位置34、40或在橢圓30的頂部或底部開始涂片檢查的顯微鏡技術(shù)人員。當(dāng)從點(diǎn)34或40開始并水平移動時(shí)，視場中的第一和第二熒光劃界74是自開始的41. 7和125視場，以100倍 物鏡。當(dāng)開始于橢圓30的頂部或底部并垂直移入橢圓時(shí)，視場中的第一和第二熒光劃界74是自開始的27. 8和83. 3視場，以100倍物鏡。圖3示出了具有另外策略尺寸的橢圓設(shè)計(jì)50的顯微鏡載玻片70，其具有的結(jié)構(gòu)為大約3cm X 2cm x O. Icm(分別是寬度、高度和厚度)。外橢圓50劃界了被認(rèn)為是AFB涂片標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本區(qū)域。嵌在橢圓中的是矩形網(wǎng)格52。在網(wǎng)格52內(nèi)部定義的每個(gè)正方形例如54具有的開口區(qū)域是大約O. 18cm x0. 18cm，例如由寬度為大約O. 025cm的熒光線劃界。每個(gè)尺寸跨越10視場以及提供等同于127視場(以100倍物鏡)的區(qū)域。為了對桿菌負(fù)荷(load)進(jìn)行定量，顯微鏡技術(shù)人員可以掃描兩個(gè)正方形的寬度的總共20視場或者一個(gè)正方形的整體的總共約100視場。圖4示出了具有寬度為約O. 2cm的垂直線60至68的顯微鏡載玻片。每條線包含變化的但是濃度已知的熒光顏料。在此線A、B、C、D和E分別具有0%、0. 0025%,O. 005%、
O.010%和O. 015%w/w的熒光顏料與油墨之比。配置了光測量設(shè)備、例如數(shù)字相機(jī)的熒光顯微鏡可有利地捕獲來自每條線的突光。像素計(jì)算軟件(Pixel counting software)例如ImageJ也可以用于加速突光強(qiáng)度的測量。顯微鏡載玻片70可以通過以下生成熒光校準(zhǔn)數(shù)據(jù)計(jì)算樣品中的顏料或染料的濃度；比較所計(jì)算的樣品顏料濃度和標(biāo)本容器72上的標(biāo)記的已知的熒光強(qiáng)度值；以及生成熒光強(qiáng)度對熒光顏料或染料濃度曲線方程。相對顏料或染料濃度的熒光濃度也可以利用曲線方程進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)該校準(zhǔn)數(shù)據(jù)和方法，可以確定受關(guān)注的樣品成分的突光強(qiáng)度。此外，可以測定未知突光濃度的標(biāo)本的突光。為了證實(shí)熒光的定量化，例如圖4中所示的顯微鏡載玻片70通過以上述比率向油墨中添加染料來進(jìn)行制備。載玻片標(biāo)記(線)74利用包括以下組件的顯微鏡和數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行成像QBC ParaLens熒光顯微鏡轉(zhuǎn)接器；Nikon 0ptiPhot-2顯微鏡；Jenoptik ProgRes⑧數(shù)碼相機(jī)jPPC。然后利用ImageJ將圖像轉(zhuǎn)化至灰度(grayscale)從而對圖像進(jìn)行分析。像素強(qiáng)度通過確定200x 200像素窗(pixel window)以及使用ImageJ的“分析”功能進(jìn)行測量。測量了以下集成密度(integrated density)
權(quán)利要求
1.用于和熒光顯微鏡系統(tǒng)一起使用的顯微鏡基底，其包括 顯微鏡標(biāo)本容器； 在所述容器表面上確定樣品的靶區(qū)域的熒光標(biāo)記； 在所述靶區(qū)域附近的所述容器表面上劃界焦點(diǎn)區(qū)域的熒光標(biāo)記；以及 在所述靶區(qū)域附近的所述容器表面上鑒定視場的熒光標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括用于焦平面鑒定和保持的界標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括尺寸大于顯微鏡物鏡視場的界標(biāo)， 所述界標(biāo)使得顯微鏡可以不依賴于顯微鏡目鏡而置于焦點(diǎn)上方的中心。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括用于結(jié)果再現(xiàn)的橫坐標(biāo)系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記還包括能夠檢查所需數(shù)目的場的開始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記還包括至少一個(gè)中間焦點(diǎn)檢查點(diǎn)，其具有垂直于觀察方向的取向。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括如下構(gòu)造，其容納針對抗酸桿菌涂片的標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)區(qū)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括平面構(gòu)造從而通常緊靠所述標(biāo)本容器。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括如下構(gòu)造，其延伸超過所述標(biāo)本容器的平面。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括線、符號、數(shù)字、文本或幾何形狀。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的顯微鏡基底，其中所述幾何形狀包括橢圓、圓形、三角形、矩形、正方形、菱形或梯形構(gòu)造。
12.根據(jù)權(quán)利要求I的顯微鏡基底，其中所述標(biāo)記包括熒光顏料、染料、涂料、油墨、蝕刻油墨或自發(fā)突光油墨。
13.用于和熒光顯微鏡系統(tǒng)一起使用的顯微鏡基底，其包括 顯微鏡標(biāo)本容器； 在所述容器表面上確定樣品的標(biāo)本區(qū)域的熒光標(biāo)記； 在所述樣品的標(biāo)本區(qū)域附近的所述容器表面上劃界焦點(diǎn)區(qū)域的熒光標(biāo)記； 在所述樣品的標(biāo)本區(qū)域附近的所述容器表面上鑒定視場的熒光標(biāo)記； 在所述樣品的標(biāo)本區(qū)域附近的所述容器表面上鑒定檢查開始點(diǎn)的熒光標(biāo)記；以及 在所述樣品的標(biāo)本區(qū)域附近的所述容器表面上劃界檢查距離的熒光標(biāo)記。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括用于焦平面鑒定和保持的界標(biāo)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底,其中所述突光標(biāo)記包括尺寸大于顯微鏡物鏡視場的界標(biāo)，所述界標(biāo)使得顯微鏡可以不依賴于顯微鏡目鏡而置于焦點(diǎn)上方的中心。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括用于結(jié)果再現(xiàn)的橫坐標(biāo)系統(tǒng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記還包括能夠檢查所需數(shù)目的場的開始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記還包括至少一個(gè)中間焦點(diǎn)檢查點(diǎn)，其具有垂直于觀察方向的取向。
19.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括如下構(gòu)造，其容納針對抗酸桿菌涂片的標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)區(qū)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括平面構(gòu)造從而通常緊靠所述標(biāo)本容器。
21.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括如下構(gòu)造，其延伸超過所述標(biāo)本容器的平面。
22.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述熒光標(biāo)記包括線、符號、數(shù)字、文本或幾何形狀。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的顯微鏡基底，其中所述幾何形狀包括橢圓、圓形、三角形、矩形、正方形、菱形或梯形構(gòu)造。
24.根據(jù)權(quán)利要求13的顯微鏡基底，其中所述標(biāo)記包括熒光顏料、染料、涂料、油墨、蝕刻油墨或自發(fā)突光油墨。
25.用于利用熒光顯微鏡檢測抗酸桿菌的存在的顯微鏡基底，其包括 顯微鏡標(biāo)本容器； 在所述容器表面上確定樣品的靶區(qū)域的熒光標(biāo)記； 在所述靶區(qū)域附近的所述容器表面上劃界焦點(diǎn)區(qū)域的熒光標(biāo)記；以及 在所述靶區(qū)域附近的所述容器表面上鑒定視場的熒光標(biāo)記。
26.用于利用熒光顯微鏡基底檢查樣品的方法，其包括 制備顯微鏡標(biāo)本容器，該顯微鏡標(biāo)本容器具有 在所述容器表面上確定樣品的靶區(qū)域的熒光標(biāo)記， 在所述靶區(qū)域附近的所述容器表面上劃界焦點(diǎn)區(qū)域的熒光標(biāo)記，以及 在所述靶區(qū)域附近的所述容器表面上鑒定視場的熒光標(biāo)記； 在熒光顯微鏡下觀察所述標(biāo)本容器的熒光標(biāo)記； 鑒定焦平面；以及 檢查所述樣品。
27.權(quán)利要求26的方法，其中鑒定所述焦平面還包括 將所述顯微鏡標(biāo)本容器和顯微鏡物鏡分開至大于所述物鏡的工作距離的距離；以及 觀察所述物鏡相對熒光開始點(diǎn)的位置直到找到正確的焦平面。
28.權(quán)利要求26的方法，其還包括通過如下測定細(xì)胞樣品濃度 在所述顯微鏡標(biāo)本容器上使用熒光標(biāo)記用于劃界已知量的樣品區(qū)域和分離的場；以及 利用通過顯微鏡目鏡可見的熒光標(biāo)記作為用于在每個(gè)場計(jì)數(shù)細(xì)胞樣品的邊界。
29.權(quán)利要求26的方法，其還包括通過如下生成熒光校準(zhǔn)數(shù)據(jù)計(jì)算樣品中的顏料濃度； 比較所計(jì)算的樣品顏料濃度和所述顯微鏡標(biāo)本容器上的熒光標(biāo)記的已知熒光強(qiáng)度值；以及 生成熒光強(qiáng)度對熒光顏料濃度曲線方程。
30.權(quán)利要求29的方法，其還包括使用所述熒光校準(zhǔn)數(shù)據(jù)用于計(jì)算所關(guān)注的樣品成分的熒光強(qiáng)度。
31.權(quán)利要求29的方法，其還包括使用所生成的熒光校準(zhǔn)數(shù)據(jù)用于測定熒光顯微鏡系統(tǒng)是否合適運(yùn)行或設(shè)備和試劑是否適當(dāng)起作用。
全文摘要
用于增加找到焦點(diǎn)區(qū)域的效率以及通過利用熒光顯微技術(shù)增加讀取包括結(jié)核病載玻片時(shí)視場的準(zhǔn)確性的裝置和方法。
文檔編號G02B21/34GK102812392SQ201180014305
公開日2012年12月5日 申請日期2011年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者C.J.格拉哈姆, C.斯圖特 申請人:Qbc診斷股份有限公司