專(zhuān)利名稱(chēng)：誘導(dǎo)細(xì)胞毒t淋巴細(xì)胞應(yīng)答乙型肝炎病毒的肽類(lèi)的制作方法
根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生學(xué)會(huì)的授意，美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)在對(duì)抗被病毒、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染的細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞時(shí)起到重要作用。它們能這樣做是通過(guò)直接的細(xì)胞毒性以及通過(guò)給其它免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和其它T細(xì)胞提供特異性和非特異性的幫助。經(jīng)感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞通過(guò)包括蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)來(lái)加工抗原，經(jīng)加工的抗原以與CTLsT細(xì)胞受體的人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)I類(lèi)分子結(jié)合的肽的形式呈現(xiàn)于細(xì)胞表面。MHCI類(lèi)分子也可不經(jīng)細(xì)胞內(nèi)加工而與外源肽結(jié)合并將它們提供給CTLs。
目前難以精確預(yù)測(cè)從抗原蛋白質(zhì)和序列中如何加工蛋白質(zhì)，以及肽的哪一部分會(huì)與HLAI類(lèi)分子結(jié)合并呈現(xiàn)于CTLs。根據(jù)洗脫自這些分子的肽序列分析已預(yù)測(cè)出一些HLAI類(lèi)分子的結(jié)合動(dòng)機(jī)(Falk等人，Nature351290(1991))。然而仍不能預(yù)測(cè)那些經(jīng)加工，并與HLAI類(lèi)結(jié)合，含有可識(shí)別CTL抗原決定簇的肽類(lèi)。
乙型肝炎病毒(“HBV”)是非裂解病毒，目前在世界上已感染了大約二億五千萬(wàn)人。成人的HBV感染通常在大多數(shù)場(chǎng)合下導(dǎo)致急性病，對(duì)少數(shù)病人會(huì)導(dǎo)致慢情病狀態(tài)。當(dāng)此感染在接近出生期時(shí)發(fā)生，急性對(duì)慢性的比例則顛倒過(guò)來(lái)。在慢性HBV感染中，肝細(xì)胞癌的發(fā)病率上升。在成年期經(jīng)HBV感染的低百分比的個(gè)體會(huì)出現(xiàn)與強(qiáng)烈免疫應(yīng)答相關(guān)的高致死性的突發(fā)性肝炎。
近年來(lái)當(dāng)對(duì)HBV感染時(shí)沒(méi)有有效的療法，已開(kāi)發(fā)出疫苗以防治HBV感染。疫苗或者使用純化自慢性HBV攜帶者血漿中的HBV表面抗原(HBsAg)，或者使用通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的HBsAg。已建議合成基于肽的HBsAg疫苗。其例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.4,599,230和4,599,231。然而抗—HBsAg疫苗僅對(duì)約90％經(jīng)免疫的個(gè)體提供保護(hù)。那些未經(jīng)免疫、或經(jīng)免疫但未被保護(hù)的個(gè)體則提供了有意義的潛在感染的貯主。
難以估計(jì)CTLs對(duì)HBV抗原免疫的貢獻(xiàn)。Chisari等人(Microbial Pathogen.631(1989))認(rèn)為肝細(xì)胞損傷是由HLAI類(lèi)限制的、應(yīng)答HBV編碼抗原的CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的。對(duì)于不同種其它病毒，如流感病毒，已鑒定出I類(lèi)主要的組織相容性(MHC)限制性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。例如，Tounsend等人在Cell44959(1986)中報(bào)道了經(jīng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別的流感病毒核蛋白質(zhì)的抗原決定簇可通過(guò)合成的肽類(lèi)來(lái)詳細(xì)說(shuō)明。在嘗試詳細(xì)說(shuō)明HBV的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答時(shí)，帶有急性和慢性HBHV的病人外周血淋巴細(xì)胞顯示出可在體外殺死自身肝細(xì)胞，但還不能確定細(xì)胞裂解活性的特異性、其HLA限制性因素以及細(xì)胞的表型。Mondelli等人，J.Immunol1292773(1982)和Mon—delli等人，Clin.Exp.Immunol.6311(1987)，Moriyama等人，Science248361—364(1990)報(bào)道了HBV主要的外殼抗原能以可被外殼特異性的抗體和MHC I類(lèi)限制的CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別的方式在肝細(xì)胞表面表達(dá)。
由于有大量經(jīng)HBV慢性感染的個(gè)體貯主，故有必要刺激這些個(gè)體的免疫應(yīng)答以應(yīng)答適當(dāng)?shù)腍BV抗原，從而排除它們的感染。也有必要防止遭受急性期感染的個(gè)體發(fā)展成為慢性HBV感染。而且由于現(xiàn)行的經(jīng)許可HBV疫苗在約10％的經(jīng)免疫個(gè)體中不能產(chǎn)生保護(hù)性免疫，故有必要產(chǎn)生更加有效的免疫，例如通過(guò)增加或改變疫苗的致免疫性。十分出人意料地，本發(fā)明完成了這些以及其它相關(guān)的需要。
本發(fā)明提供了肽類(lèi)，它可誘導(dǎo)抗HBV抗原的MHCI類(lèi)限制性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。所感興趣的肽類(lèi)衍生于HBV外殼。在某些實(shí)施方案中CTL誘導(dǎo)肽可具有序列HBenv183—191Phe—Leu—Leu—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile(Seq.ID No.1)；HBenv248—257Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu(Seq.ID No.3)；HBenv249—257Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu(Seq.ID No.4)；HBenv249—258Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu(Seq.ID No.5)；HBenv250—258Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu(Seq.ID No.6)；HBenv251—259Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val(Seq.ID No.7)，HBenv251— 260Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu(Seq.ID No.8)，HBenv260—269Leu—Leu—Asp—Tyr—Gln—Gly—Met—Leu—Pro—Val(Seq.ID No.9)，HBenv335—343Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val(Seq.ID No.10)，HBenv152—161Ser—Ile—Leu—Ser—Lys—Thr—Gky—Asp—Pro—Val(Seq.ID No.11)，；HBenv177—185Val—Leu—Gln—Ala—Gly—Phe—Phe—Leu—Leu(Seq.ID No.12)；HBenv204—212Phe—Leu—Gly—Gly—Thr—Pro—Val—Cys—Leu(Seq.ID No.13)，或HBenv370—379Ser—Ile—Val—Ser—Pro—Phe—Ile—Pro—Leu—Leu(Seq.ID No.14)；或者具有與上述序列中的一個(gè)大致同源性的序列。按照需要，此肽可任選在N—和C—末端的一端或兩端側(cè)面連接和/或被修飾。在經(jīng)選擇的肽中的非關(guān)鍵性殘基位置處可進(jìn)行保守的替換，缺失和添加對(duì)它的生物活性不會(huì)有實(shí)質(zhì)性的不利影響。
應(yīng)理解在不同肽的實(shí)施方案中，肽類(lèi)可以聚合物化，互相之間聚合形成較大的同聚物，或與不不的肽類(lèi)聚合形成雜聚物。在一些情況下肽類(lèi)在組合物中結(jié)合成混合物而并不相連接。所述肽也可與能加強(qiáng)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的含脂分子結(jié)合，或與能誘導(dǎo)T—輔助細(xì)胞應(yīng)答的不同肽結(jié)合。
所提供的組合物含有本發(fā)明的肽，與之一起配制的還有另外的肽，脂質(zhì)體、佐劑和/或藥物可接受的載體。因此此藥物組合物可用于治療急性HBV感染的方法，尤其是可致力于防治此感染發(fā)展成慢性或攜帶者的狀態(tài)。同時(shí)還提供了治療慢性HBV感染和HBV攜帶者狀態(tài)的方法，其時(shí)應(yīng)給感染個(gè)體施用足夠劑量的藥用組合物以致免疫地刺激抗HBc抗原決定簇的有效細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答。為了治療這些感染，尤其需要將可誘導(dǎo)抗HBV抗原的MHCI類(lèi)限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的肽類(lèi)與可誘導(dǎo)抗其它HBV抗原，如HBV核心免疫應(yīng)答的其它肽類(lèi)或蛋白質(zhì)相結(jié)合。為治療慢性或攜帶者狀態(tài)感染下的個(gè)體，必需將組合物在延長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)以重復(fù)的劑量施用以消除或根本上緩和感染和/或病毒的排出。
同時(shí)還提供了防治HBV感染、尤其是慢性HBV感染的疫苗組合物。此疫苗組合物含有上述可誘導(dǎo)MHC I類(lèi)限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的致免疫有效量的HBV外殼肽，例如HLA—A2，典型地進(jìn)一步含有輔劑，例如不完全的弗氏輔劑或氫氧化鋁。為了達(dá)到抗HBV的加強(qiáng)保護(hù)，此疫苗可進(jìn)一步含有可產(chǎn)生保護(hù)抗體以應(yīng)答HBV外殼抗原的成分。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及到疹斷方法，其中本發(fā)明的肽類(lèi)被用來(lái)鑒定能對(duì)HBV外殼抗原產(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答的個(gè)體中淋巴細(xì)胞的存在。缺失這類(lèi)細(xì)胞即可確定是否所感興趣的個(gè)體對(duì)發(fā)展成慢性HBV感染是敏感的。典型地，淋巴細(xì)胞是外周血淋巴細(xì)胞，所感興越的個(gè)體患了急性HBV感染。


圖1表明HBsAg335—343，WLSLLVPFV，是可被經(jīng)HBsAg3329—348刺激的CTL識(shí)別的最低限度最適CTL抗原決定簇。經(jīng)用HBsAg329—348刺激產(chǎn)生的來(lái)自病人A—1的CTL克隆與來(lái)自病人A—3的CTL克隆系對(duì)JY靶細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，靶細(xì)胞或通過(guò)截?cái)?上片)或通過(guò)重疊的包被HBsAg329—348的9—mers或10—mers進(jìn)行預(yù)脈沖(下片)。
圖2進(jìn)一步確證了在HBsAg329—348中體外引入CTL的最適抗原決定基是HBsAg335—343。
圖3表明經(jīng)急性乙型肝炎病毒感染、慢性乙型肝炎病毒感染的病人中，以及正常的個(gè)體中HBV特異性的CTL應(yīng)答。來(lái)自急性病人(A—1至A—12)、慢性病人(C—l至C—6)、以及正常個(gè)體的PBMC經(jīng)用下列合成肽刺激1＝HBcAg18—27，2＝HBsAg201—210，3＝HBsAg251—259，4＝HBsAg260—269，5＝HBcAg335—343，6＝HBsAg338—347，7＝HBsAg348—357，8＝HBsAg378—387.
圖4所示為HLA—A2.1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制測(cè)定的結(jié)果，表示為4小時(shí)50Cr釋放測(cè)定中HBsAg18—27特異性裂解的抑制百分?jǐn)?shù)。
圖5表明對(duì)HBsAg335—343和HBsAg348—357的CTL應(yīng)答分別是簇特異性的和亞型特民間性的，合成肽類(lèi)所含的抗原決定簇也是通過(guò)在感染細(xì)胞中內(nèi)源加工大的、中等大小的和較大的HBV外殼多肽而產(chǎn)生的。
本發(fā)明提供了衍生于HBV外殼蛋白質(zhì)的肽類(lèi)，可用于組合物以及治療、防止和診斷HBV感染的方法。此肽類(lèi)可刺激抗HBV感染細(xì)胞的MHC HLAI類(lèi)限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。經(jīng)刺激的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞可殺死感染細(xì)胞或抑制病毒的復(fù)制。因此可阻斷或?qū)嶋H上可防治感染，包括慢性HBV感染?？捎行Мa(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答的肽也可與能產(chǎn)生T—輔助應(yīng)答的免疫原結(jié)合。
本發(fā)明所使用的肽衍生于HBenv183—191(Seq.IDNo.1)，HBenv248—260(Seq.ID No.2)，HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，HBenv204—212(Seq.ID No.13)，以及HBenv370—379(Seq.ID No.14)的區(qū)域，其中的編號(hào)是參照Galibert等人，文獻(xiàn)同上。
本發(fā)明的HBV細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)“肽”或“寡肽”的意思是從HBc序列中衍生出至少為4個(gè)HBV氨基酸序列殘基的鏈，優(yōu)選至少6個(gè)，更優(yōu)選8或9個(gè)，有時(shí)為10至12個(gè)殘基，通常少于約50個(gè)殘基，更經(jīng)常地少于約35個(gè)殘基，而優(yōu)選少于25個(gè)，例如8至17個(gè)氨基酸殘基。有必要使本發(fā)明肽類(lèi)最優(yōu)化至8至12個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)等，大小與結(jié)合于細(xì)胞表面的MHCI類(lèi)分子上的內(nèi)源加工的病毒肽類(lèi)相同。一般可見(jiàn)Schumacher等人，Nature350703—706(1991)；Van Bleek等人，Nature348213—216(1990)；Rotzschke等人，Nature348252—254(1990)；以及Falk等人，Nature351290—296(1991)，它們已在此作為參考文獻(xiàn)。以下更詳細(xì)公開(kāi)的是通常肽類(lèi)至少應(yīng)含有大多數(shù)氨基酸與這里所鑒定的、含有可誘導(dǎo)CTL的抗原決定基的HBV序列鄰近殘基的相應(yīng)部分同源。
肽類(lèi)可如下文所述“合成”制備，或通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。盡管此肽優(yōu)選為實(shí)際上已擺脫其它自然生成的HBV蛋白質(zhì)及其片段，但在一些實(shí)施方案中，肽類(lèi)可被合成地與自然片段或顆粒結(jié)合。在本說(shuō)明書(shū)中肽這一詞與多肽可替換使用，一系列氨基酸通過(guò)相鄰氨基酸的α—氨基和α—羧基之間的鍵互相連接即可稱(chēng)作多肽。多肽或肽類(lèi)的長(zhǎng)度不同，不論是以它們的中性(不帶電的)形式或以鹽的形式，不論是沒(méi)有如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化的修飾或含有這些修飾，所遇到的情況是修飾不會(huì)破壞此處所描述的多肽的生物活性。
有必要使肽盡可能地小而同時(shí)仍能保持大肽實(shí)質(zhì)上所有的生物活性。生物活性是指與適當(dāng)MHC分子結(jié)合并誘導(dǎo)抗HBV抗原或抗原類(lèi)似物的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答是對(duì)所感興趣的HBV抗原特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，其中CD8+，MHCI類(lèi)限制的T淋巴細(xì)胞被激活，被激活的T淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子(例如Y—干擾素)釋放產(chǎn)物(例如絲氨酸酯酶)，它可抑制經(jīng)感染的自身細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒的復(fù)制，帶有或不帶有細(xì)胞殺傷。
“同源的”，“實(shí)質(zhì)上同源的”，以及“實(shí)質(zhì)上同源性”這類(lèi)詞用在這里是指氨基酸序列至少有50％相同，其中將一個(gè)序列與氨基酸的對(duì)照序列相比較。序列相同的百分比或同源性可通過(guò)當(dāng)相應(yīng)于對(duì)照序列的部分排列成線(xiàn)時(shí)互相比較來(lái)計(jì)算。
來(lái)自核殼體區(qū)域的本發(fā)明的可誘導(dǎo)CTL的HBV肽實(shí)例包含6至35個(gè)氨基酸并含有至少一個(gè)來(lái)自HBenv183—191(Seq.LD No.1)肽區(qū)域的HLA限制的CTL抗原決定簇的位點(diǎn)。此肽的大多數(shù)氨基酸與自然生成的HBenv183—191區(qū)域的相應(yīng)部分的氨基酸相同或?qū)嵸|(zhì)上同源，HBen-v183—191具有以下序列HBenv183—191(Seq.ID No.1)Phe—Leu—Len—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile此HBenv183—191區(qū)域的肽實(shí)例可按需要被包括HBc的HBV序列的氨基酸任選地在N—和C—末端的一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾，并連接到載體上等等，氨基酸的加入有利于連接及其他的N—和C—末端修飾，以下將進(jìn)一步描述。肽HBenv183—191可誘導(dǎo)至少由MHCI類(lèi)分子HLA—A2介導(dǎo)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明其他HBenv肽的實(shí)例是從HBenv248—260區(qū)域中制備的，衍生于此區(qū)域的肽類(lèi)至少含有一個(gè)可誘導(dǎo)CTL的HLAI類(lèi)限制的抗原決定簇位點(diǎn)，典型的為至少7個(gè)氨基酸，更常見(jiàn)為9個(gè)、10個(gè)或11個(gè)氨基酸或更多。此肽的大部分氨基酸與自然生成的HBenv248—260序列的相應(yīng)部分的氨基酸相同或基本上同源，HBenv248—260具有序列(HBV亞型ayw)
HBenv248—260(Seq.ID No.2)phe—Ile—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu如本文所述HBenv248—260區(qū)域的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。
典型的制備于HBenv248—260區(qū)域的可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)包括下面的9—和10—mer肽類(lèi)HBenv248—257(Seq.ID No.3)Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；HBenv249—257(Seq.ID No.4)Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；HBenv249—258(Seq.ID No.5)Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；HBenv250—258 (Seq.ID No.6)Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；HBenv251—259(Seq.ID No.7)Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val；HBenv251—260(Seq.ID No.8)Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu；上述肽類(lèi)含有HLA限制的可誘導(dǎo)CTL的抗原決定簇，典型地至少為HLA—A2限制性的，如上述肽I所提到，可在一個(gè)或兩個(gè)末端側(cè)面連接和/或修飾。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽含有10—mer肽HBenv260—269，此肽類(lèi)衍生于HBenv260—269，后者含有至少為7個(gè)相鄰氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的HLAI類(lèi)限制抗原決定簇位點(diǎn)。此肽的大部分氨基酸與自然生成的HBen—v260—269序列的相應(yīng)部分的氨基酸相同或基本上同源，HBenv260—269具有序列HBenv260—269(Seg.ID No.9)Leu—Leu—Asp—Tyr—Gln—Gly—Met—Leu—Pro—Val.
如本文所述制備于此區(qū)域的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。肽HBenv260—269(Seg.ID No.4)可誘導(dǎo)至少由MHCI類(lèi)HLA—A2分子介導(dǎo)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明其他可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)衍生于HBenv335—343區(qū)域(Seg.ID No.10)，經(jīng)包括衍生于HBenv335—343(Seg.ID No.10)的肽類(lèi)，此HBenv335—343含有一個(gè)或多個(gè)至少為7個(gè)相鄰氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的HLAI類(lèi)限制性抗原決定簇位點(diǎn)。此肽的大部分氨基酸與自然生成的HBen—v335—343序列的相應(yīng)部分的氨基酸相同或?qū)嵸|(zhì)上同源，HBenv335—343具有序列HBenv335—343(Seg.ID No.10)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val.
如本文所述，其中經(jīng)選擇的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。
本發(fā)明其他可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)衍生于HBenv152—161區(qū)域(Seg.ID No.11)，它包括衍生于HBenv152—161(Seg.ID No.11)的肽類(lèi)，此HBenv152—161含有一個(gè)或多個(gè)至少為7個(gè)相鄰氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的HLAI類(lèi)限制性抗原決定簇位點(diǎn)。此肽的大部分氨基酸與自然生成的HBenv152—161序列的相應(yīng)部分的氨基酸相同或?qū)嵸|(zhì)上同源，HBenv152—161具有序列(adw亞型)HBenv152—161(Seg.ID No.11)Ser—Ile—Leu—Ser—Lys—Thr—Gly—Asp—Pro—Val，如本文所述，其中經(jīng)選擇的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。
本發(fā)明的其他可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)衍生于HBenv177—185區(qū)域的肽類(lèi)(Seq.ID No.12)，它包括衍生于HBenv177—185區(qū)域(Seq.ID No.12)，HBenv177—185含有一個(gè)或多個(gè)至少為7個(gè)相鄰氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的HLAI類(lèi)限制性抗原決定簇位點(diǎn)。此肽的大部分氨基酸與自然生成的HBenv177—185序列的相應(yīng)部分的氨基酸相同或?qū)嵸|(zhì)上同源，HBenv177—185具有序列(adw亞型)HBenv177—185(Seq.ID No.12)Val—Leu—Gln—Ala—Gly—Phe—Phe—Leu—Leu，如本文所述，其中經(jīng)選擇的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。
本發(fā)明另外的可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)衍生于HBenv204—212(Seq.ID No.13)區(qū)域，它包括衍生于HBenv204—212(Seq.ID No.13)的肽類(lèi)，此HBenv204—212含有一個(gè)或多個(gè)至少為7個(gè)相鄰氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的HLA I類(lèi)限制性抗原決定簇位點(diǎn)。此肽的大部分氨基酸與自然生成的HBenv204—212序列相應(yīng)部分的氨基酸相同或?qū)嵸|(zhì)上同源，HBenv204—212具有序列(adw亞型)HBenv204—212(Seq.ID No.13)Phe—Leu—Gly—Gly—Thr—Pro—Val—Cys—Leu，如本文所述，其中經(jīng)選擇的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。
本發(fā)明另外的可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)衍生于HBenv370—379區(qū)域(Seq.ID No.14)，它包括衍生于HBenv370—379區(qū)域(Seq.ID No.14)的肽類(lèi)，HBenv370—379含有一個(gè)或多個(gè)至少為7個(gè)相鄰氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的HLAI類(lèi)限制性抗原決定簇位點(diǎn)。此肽的大部分氨基酸與自然生長(zhǎng)的HBenv370—379序列的相應(yīng)部分的氨基酸相同或?qū)嵸|(zhì)上同源，HBenv370—379具有序列(adw亞型)HBenv370—379(Seq.ID No.14)Ser—Ile—Val—Ser—Pro—Phe—Ile—Pro—Leu—Leu，如本文所述，其中所選擇的肽可在一端或兩端側(cè)面連接和/或修飾。
如上所述，鑒于本文所討論的理由，附加氨基酸可加在寡肽或末端以給肽類(lèi)互相之間的連接，其與載體，支持物或較大肽的連接提供方便，或可修飾肽或寡肽的物理或化學(xué)性質(zhì)等等。如酪氨酸，半胱氨酸，賴(lài)氨酸，谷氨酸或天冬氨酸等等的氨基酸可被引入肽或寡肽的C—或N—末端。另外肽或寡肽的序列經(jīng)末端—NHz?；饔玫男揎椂c自然序列區(qū)分開(kāi)來(lái)，例如乙?；饔?、或疏基乙酰胺化作用、末端—羧基酰胺化作用，如氨、甲胺等。某些情況下這些修飾可提供與支持物或其他分子連接的位點(diǎn)。
應(yīng)理解具有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞剌激活性的本發(fā)明的HBV肽類(lèi)或其類(lèi)似物可按需要修飾以提供某種其他所需的屬性，例如改進(jìn)的藥物特性，而同時(shí)可提高或至少實(shí)質(zhì)上維持未經(jīng)修飾的肽的生物活性。例如，在肽序列中可通過(guò)氨基酸的延長(zhǎng)、減少或替換來(lái)修飾肽類(lèi)，例如可通過(guò)在衍生于本文公開(kāi)序列的肽類(lèi)的氨基端或羧基端或兩端加入或減少氨基酸來(lái)修飾。此肽類(lèi)可被修飾至實(shí)質(zhì)上可加強(qiáng)誘導(dǎo)CTL的活性以致經(jīng)修飾的肽類(lèi)似物所具有的CTL活性比野生型序列肽要高。例如有必要加強(qiáng)肽N—末端的疏水性，尤其是N—末端的第二個(gè)殘基為疏水性的地方，這同與HLA限制性分子的結(jié)合有關(guān)連。通過(guò)在N—末端增強(qiáng)疏水性，T細(xì)胞所顯現(xiàn)的效力也有所增加。從其他與抗原相關(guān)的疾病中制備的肽類(lèi)，尤其是那些含有可誘導(dǎo)CTL的抗原決定基而宿主對(duì)此沒(méi)有顯著的CTL活性的肽類(lèi)，可通過(guò)在第二個(gè)殘基為正常疏水性的肽的N—末端替換疏水性殘基來(lái)使之成為可誘導(dǎo)CTL的肽類(lèi)。
在本目的發(fā)明中使用的肽類(lèi)無(wú)需與下列肽類(lèi)相同
HBenv183—191(Seq.ID No.1)，HBenv248—257(Seq.ID No.3)，HBenv249—257(Seq.ID No.4)，HBenv249—258(Seq.ID No.5)，HBenv250—258(Seq.ID No.6)，HBenv251—259(Seq.ID No.7)，HBenv251—260(Seq.ID No.8)，HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，HBenv204—212(Seq.ID No.13)，或HBenv370—379(Seq.ID No.14)，只要目的化合物可提供至少抗HBV四種主要亞型中的一種的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性。盡管存在HBV的不同株，它們每個(gè)都享有至少一個(gè)共同外殼決定簇，被稱(chēng)為“a”每個(gè)病毒株也有另外兩個(gè)外殼決定簇，其中一個(gè)是“d”或“y”，而另一個(gè)是“W”或“r”。因此有四種可能的病毒亞型adw，ayw，adr和ayr。在GB 2034323，EP13828，U.S.4,935,235中描述了HBV的克隆，測(cè)序和表達(dá)，Galibert等人在Nature281646(1979)中也描述了HBV外殼區(qū)域的完整序列，上述每一種在本文中被列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。在GenBank—72數(shù)據(jù)庫(kù)中描述了20種不同HBV株的氨基酸序列，包括7株adw亞型，5株ayw亞型，7株adr亞型和1株ayr亞型，Gen-Bank序列在本文中也被列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。
因此，此肽類(lèi)可經(jīng)受不同的變化，或?yàn)楸Ｊ氐幕驗(yàn)榉潜Ｊ氐?，例如插入，缺失和替換，這種變化對(duì)于它們的使用提供了某種優(yōu)點(diǎn)。保守的替換指的是用另一個(gè)生物和/或化學(xué)上相似的氨基酸殘基替代這個(gè)氨基酸殘基，例如一個(gè)疏水性殘基換成另一個(gè)，或一個(gè)極性殘基換成另一個(gè)。替換包括組合諸如Gly，Ale；Val，Ile，Leu；Asp.Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Cys，Arg；以及Phe，Tyr。通常，趨于實(shí)質(zhì)上模仿HBV細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞剌激性的抗原決定簇的序列部分與否少一種HBV亞型的序列的不同不超過(guò)的20％，除了在任一末端加入附加的氨基酸以修飾此肽的物理或化學(xué)特性，例如簡(jiǎn)化連接或結(jié)合等等。已發(fā)現(xiàn)在HBV亞型中肽序列的區(qū)域是多型的，故有必要改變一或多個(gè)特殊的氨基酸以更有效地模仿不同HBV株或亞型的不同的細(xì)胞毒—淋巴細(xì)胞抗原決定簇。
在包括有上述代表肽的由本發(fā)明鑒定的肽序列中，有殘基(或那些實(shí)質(zhì)功能等同物)可使肽維持它們的生物活性，例如刺激I類(lèi)限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答HBV感染細(xì)胞或表達(dá)HBV抗原的細(xì)胞的能力。這些殘基可通過(guò)單個(gè)氨基酸替換，缺失或插入來(lái)鑒定。另外通過(guò)特異氨基酸的(如，Ala)系統(tǒng)掃描可觀察到側(cè)殘基的貢獻(xiàn)。經(jīng)多種替換的肽類(lèi)通常將這種替換結(jié)合成小的，相對(duì)中性的分子，例如Ala，Gly，Pro或類(lèi)似殘基。可被替換、增加或減少的殘基的數(shù)目和類(lèi)型要依據(jù)必需抗原決定簇點(diǎn)與所尋找的某種結(jié)構(gòu)和功能屬性(如疏水性對(duì)親水性)之間必要的分隔，如有必要，通過(guò)這種變化也可使得肽類(lèi)似物與其MHC分子結(jié)合親和力增加以供給細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。通常在抗原決定簇和/或結(jié)構(gòu)重要的殘基之間間隔序列的替換，增加或缺失所選擇使用的氨基酸或成分應(yīng)能避免可能會(huì)阻斷結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)和電荷的影響。
經(jīng)多種取代而保留生物活性的肽可合成含肽的D—氨基酸。這樣的肽可合成為“倒位”或“反倒位”形式，即，通過(guò)替換帶有D—氨基酸序列的L—氨基酸或通過(guò)顛倒氨基酸序列并取代帶有D—氨基酸的L—氨基酸。因?yàn)镈—肽類(lèi)實(shí)際上更能抵制肽酶，因此和L—肽類(lèi)比較在血清和組織中更穩(wěn)定。在生理?xiàng)l件下D—肽類(lèi)的穩(wěn)定性和對(duì)應(yīng)的L—肽類(lèi)比較更能彌補(bǔ)親和力的差異。進(jìn)一步，帶或不帶取代基含肽類(lèi)的L—氨基酸可被D—氨基酸包裹，以抑制外肽酶抗原性肽的破壞。
除了此處所述說(shuō)的例子肽外，本發(fā)明提供了識(shí)別與所述肽區(qū)域相關(guān)的其它抗原決定簇區(qū)的方法。所說(shuō)肽區(qū)能誘導(dǎo)MHC—抑制性細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)抗HBV的反應(yīng)。方法包括從感染或非感染個(gè)體獲取外周血淋巴細(xì)胞及用源于肽區(qū)HBenv183—191(Seq.ID No.1)，HBenv248—260(Seq.ID No.2)，HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，
HBenv204—212(Seq.ID No.13)，或HBenv370—379(Seq.ID No.14)，的多肽片段暴露(刺激)帶合成肽的細(xì)胞。
交叉的合成肽庫(kù)，典型地每個(gè)肽約8—20個(gè)殘基長(zhǎng)度，優(yōu)選的9—12個(gè)殘基，可用于剌激細(xì)胞?；钚噪目蓮恼T導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性的庫(kù)中篩選。肽類(lèi)誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性的能力通過(guò)培養(yǎng)剌激過(guò)的有自體標(biāo)記(如15Cr)的靶細(xì)胞(如HLA匹配巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、纖維母細(xì)胞或B淋巴纖維母細(xì)胞)決定。這些細(xì)胞用HBV亞基因組片段感染或轉(zhuǎn)染，結(jié)果目的抗原由細(xì)胞內(nèi)源性合成(或用有意義肽脈沖細(xì)胞)，并測(cè)定特異性標(biāo)記的釋放。
一且識(shí)別了含刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抗原決定簇區(qū)的多肽，就能確定反應(yīng)的MHC抑制因子。這包括培養(yǎng)刺激過(guò)的PBL或短期細(xì)胞系，后者為一群已知HLA型(標(biāo)記)靶細(xì)胞，它們用有意義肽或合適對(duì)照脈沖過(guò)。被CTL溶解的群體中HLA等位基因細(xì)胞被比作未溶解細(xì)胞，識(shí)別了對(duì)有意義抗原產(chǎn)生細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的HLA抑制因子。
Carbone等人(J.Exp.Med.1671767，1988)報(bào)道，用多肽刺激可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)相應(yīng)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)親和力低的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，結(jié)果用肽反復(fù)刺激可產(chǎn)生識(shí)別肽而不識(shí)別天然抗原的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。由于剌激過(guò)細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞沒(méi)有能力識(shí)別天然的HBC蛋白質(zhì)，開(kāi)發(fā)HBV肽類(lèi)藥物和疫苗組合物無(wú)望，但是使用了圍繞這種潛在限制的方法。此發(fā)明連續(xù)重復(fù)刺激細(xì)胞毒T細(xì)胞，旨在識(shí)別和選擇對(duì)自然處理的抗原而不是合成肽有較高親和力的T細(xì)胞。通過(guò)重復(fù)剌激活化的PBL建立了短期細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞系。用肽和重組的或天然的HBV抗原，如HBsAg重新刺激用肽刺激過(guò)的細(xì)胞，有活性的細(xì)胞也用合適的T細(xì)胞分裂素，如植物凝血素(PHA)剌激。重新刺激的細(xì)胞和照射過(guò)的異源PBLs一起作為抗原非特異性輔助T細(xì)胞、HBV抗原的來(lái)源。為選擇性地?cái)U(kuò)大細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的群體，識(shí)別天然HBV抗原，建立長(zhǎng)期細(xì)胞系，來(lái)自病人的PBL首先用肽和重組或天然HBV抗原剌激，接著用HLA—匹配的能穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)HBV抗原多肽的B淋巴母細(xì)胞重復(fù)刺激，使用自體和異源的B—淋巴母細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)染，用合適抗原感染的細(xì)胞，為識(shí)別內(nèi)源性合成抗原的能力，重新確定了細(xì)胞系。
已識(shí)別了在一或更多患者或HLA類(lèi)型誘導(dǎo)抗HBV細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的本發(fā)明不同的肽類(lèi)。一些例子有希望在一個(gè)組合物中連接兩個(gè)或更多個(gè)肽。這種組合物中的肽類(lèi)可以相同或不同，它們一道提供相同的或比親本肽更大的生物活性。例如，用這里所述的方法，兩個(gè)或更多肽可以限定在源于一個(gè)特殊區(qū)如HBenv248—257(Seq.ID No.3)，HBenv249—257(Seq.ID No.4)，HBenv249—258(Seq.ID No.5)，HBenv250—258(Seq.ID No.6)，HBenv251—259(Seq.ID No.7)，和/或HBen-v251—260(Seq.ID No.8)，不同或交叉細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原決定簇。能和肽類(lèi)結(jié)合在“雞尾中”的肽類(lèi)為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)提供了增強(qiáng)的免疫原性。而且，一個(gè)區(qū)的肽類(lèi)能和另一個(gè)HBV區(qū)的肽類(lèi)結(jié)合，后者來(lái)自于同樣的或不同的HBV蛋白質(zhì)，特別是第二或次要肽有不同于第一肽的MHC限制因子。
其它誘導(dǎo)CTL HBV類(lèi)已在共待批使用說(shuō)明書(shū)USSN07/935，898中闡述了，此處作為參考文獻(xiàn)。這種多肽組合物能有效地用于拓寬由藥物、疫苗或誘治方法及不同群體中本發(fā)明的組合物帶來(lái)的免疫覆蓋程度。例如，在興盛的人種群(高加索人、亞洲人種非黑人)，HLA等位基因的不同頻度如下表I所示?？芍贫ū景l(fā)明的藥物或疫苗組合物配方，以便提供潛在的免疫療法或?qū)ΡM可能高百分率的人群提供免疫性。
表I興盛人種HLA等位基因頻度HLA Allele EUC NAC AFR JPNA2 45.346.627.3 43.2A29 7.4 8.112.3 0.4A31 5.4 6.2 4.4 15.3A32 8.8 7.1 30.1A33 3.3 3.4 9 13.1A28*7.7 9.9 16.6 1.1縮寫(xiě)EUC，歐洲高加索人；NAC，北美高加索人；AFR，非洲黑人；JPN，日本人*A28代表兩個(gè)等位基因AW68和AW69。
本發(fā)明中的肽類(lèi)可由連接鍵形成聚合物(多聚物)或不通過(guò)連接鍵配成混合物的組合物成分，同種肽自身連接形成同源聚合物，產(chǎn)生了許多重復(fù)的抗原決定簇。當(dāng)肽不同時(shí)，如混合物，代表不同的HBV亞型，不同亞型的抗原決定簇不同，不同的HLA抑制特異性，提供了含有輔助T細(xì)胞抗原決定簇的肽、帶有重復(fù)單位的異源聚合物。除共價(jià)鍵外，能形成交叉分子或內(nèi)部結(jié)構(gòu)鍵的非共價(jià)鍵也含括在內(nèi)。
同源或異源聚合物或載體偶聯(lián)的鍵能以各種各樣的方式提供。例如，半胱氨酸殘基能加在氨基和羧基末端，此處肽類(lèi)通過(guò)控制半胱氨酸殘基的氧化而共價(jià)結(jié)合。而且有用的是大量異質(zhì)雙功能試劑，在有官能基團(tuán)端產(chǎn)生一個(gè)二硫鍵，而在另一端產(chǎn)生一個(gè)肽鍵，包括N—琥珀酰亞胺基—3—(2—吡啶基—二硫基)丙酸酯(SPDP)，此試劑在其本身及一個(gè)蛋白質(zhì)的半胱氨基殘基之間產(chǎn)生一個(gè)二硫鍵，通過(guò)一個(gè)賴(lài)氨酸上的氨基或另一個(gè)氨基酸上的自由氨基基團(tuán)形成酰胺鍵。已知各種各樣如此二硫鍵或酰胺鍵形成劑。見(jiàn)如Imm.Rev.62185(1982)，此內(nèi)容作為參考。其它的雙官能偶聯(lián)劑形成硫醚鍵而不是二硫鍵。許多種硫醚鍵形成劑可從市售獲得包括6—順式丁烯酰亞胺己酸、2—溴醋酸，2—碘醋酸、4—(N—順式丁烯酰亞胺—甲基)環(huán)己烷—1—羧酸等的反應(yīng)酯。羧基基團(tuán)可通過(guò)其與琥珀酰亞胺或1—羥基—2—硝基—4—磺酸、鈉鹽結(jié)合而活化。一個(gè)特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑是琥珀酰亞胺基—4—(N—順式丁烯酰胺甲基)環(huán)己烷—1—羧酯(SMCC)?？衫斫獾氖擎I不應(yīng)徹底干擾上述任一有功能的連接基團(tuán)，如HBV細(xì)胞毒T細(xì)胞決定劑、肽類(lèi)似物或輔助T細(xì)胞決定劑。
另一方面本發(fā)明的肽類(lèi)能與有HBV輔助T細(xì)胞抗原決定簇的其它肽類(lèi)結(jié)合或偶聯(lián)，即與HBC誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞合作，剌激T細(xì)胞的抗原決定簇。輔助T細(xì)胞可能是輔助T細(xì)胞1或輔助T細(xì)胞2表型，如源于HBV序列的輔助T細(xì)胞抗原決定簇在HBcl—20已鑒定了，此序列為Met—Asp—Ile—Asp—Pro—Tyr—Lys—Glu—Phe—Gly—Ala—Thr—Val—Glu—Leu—Leu—Ser—Phe—Leu—Pro(Seq.ID No.17)。另一個(gè)輔助細(xì)胞抗原決定簇由源于HBc50—69區(qū)的肽提供，此序列為Pro—His—His—Tyr—Ala—Leu—Arg—Gln—Ala—Ile—Leu—Cys—Trp—Gly—Glu—Leu—Met—Tyr—Leu—Ala(Seg.ID No.18)，源于HBc100—139區(qū)的，包括HBc100—119區(qū)，此序列為L(zhǎng)eu—Leu—Trp—Phe—His—Ile—Ser—Cys—Leu—Thr—Phe—Gly—Arg—Glu—Thr—Val—Ile—Glu—Tyr—Leu(Seg.ID No.19)(此處異亮氨酸116在HBVadw亞基中是亮氨酸)。HBc117—131含此序列Glu—Tyr—Leu—Val—Ser—Phe—Gly—Val—Trp—Ile—Arg—Thr—Pro—Pro—Ala(Seg.ID No.20)，HBc120—139肽序列為Val—Ser—Phe—Gly—Vla—Trp—Ile—Arg—Thr—Pro—Pro—Aal—Tyr—Arg—Pro—Pro—Asn—Ala—Pro—Ile(Seg.ID No.21).見(jiàn)Ferrari等J.Clin.Invest.88214—222(1991).和U.S.Pat.4,882,145，此處都作為參考。
本發(fā)明中的肽可用各種各樣的方法制備，由于它們的大小相當(dāng)短，所以可以在溶液中或固體支持物上按常規(guī)技術(shù)合成。各種各樣供商用的自動(dòng)合成儀可按已知方法使用。見(jiàn)，如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pievce化學(xué)公司1984年版；Tam等，J.Am.Chem.Soc.1056442(1983)；Merrifield，科學(xué)，232341—347(1986)；Barany和Merrifield，肽類(lèi)，Gross和Meienhofer編Aca-demic Press New York，ppl—284(1979)，它們?cè)诖硕甲鳛閰⒖肌?br> 或者，可用重組DNA技術(shù)，將編碼一有意義肽的核苷酸序列插入到一表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些方法一般是已知技術(shù)，例如通常描述在Sambrook等人的Molecular Cloning，A Labo-ratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York(1982)，及Ausubel等人(編)的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.，New York(1987)和U.S.Pat.Nos.4,237,224，4,273,875，4,431,739，4,363,877和4,428,941，它們的公開(kāi)此都作為參考。因此，含本發(fā)明一或更多肽序列的融合蛋白質(zhì)可用作HBV細(xì)胞毒T細(xì)胞決定劑。如本發(fā)明中一種重組的外殼蛋白通過(guò)將HBen氨基酸序列變化以更有效地呈現(xiàn)出上述多肽區(qū)的抗原決定簇來(lái)刺激產(chǎn)生一種細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答制備。用這種手段，多肽通過(guò)結(jié)合幾種T細(xì)胞抗原決定簇得到應(yīng)用。
期望長(zhǎng)度肽類(lèi)的編碼序列可經(jīng)化學(xué)技術(shù)合成，例如，Matteucci等人的磷酸三酯法，(J.Am，Chem.Soc，1033185(1981))，簡(jiǎn)單地通過(guò)修飾取代編碼天然肽序列的適當(dāng)堿基。編碼序列通過(guò)合適的接頭連接到現(xiàn)有技術(shù)中常用的表達(dá)載體上，這些表達(dá)載體通常轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞產(chǎn)生期望的融合蛋白質(zhì)。目前許多這樣的載體和合適的宿主體系是可利用的。為了表達(dá)融合蛋白質(zhì)，提供了能操作連接的起始和終止密碼、啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)，及提供一個(gè)在期望細(xì)胞宿主中表達(dá)的表達(dá)載體復(fù)制體系。例如，和細(xì)菌宿主相容的啟動(dòng)子序列，以包含利于目的編碼序列插入的限制位點(diǎn)的質(zhì)粒方式提供。結(jié)果產(chǎn)生的表達(dá)載體可轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主細(xì)胞。使用合適的載體和對(duì)照序列，酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主也可利用。
本發(fā)明中的肽類(lèi)和藥物及疫苗組合物，施藥給哺乳動(dòng)物，尤其人類(lèi)，對(duì)治療和/或預(yù)防HBV傳染是有用的。由于肽類(lèi)用作刺激HBV感染的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒T—淋巴細(xì)胞應(yīng)答，所以這種成分可用來(lái)治療或預(yù)防急/或慢性HBV感染。
作為藥物組合物，本發(fā)明中上述的肽類(lèi)可以給已感染HBV的個(gè)體用藥。接種期或急性感染期的個(gè)體可分別用免疫原性肽治療或結(jié)合別的合適療法。在治療應(yīng)用中，組合物以有效劑量用藥給患者以產(chǎn)生對(duì)HBV有效的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，治愈或至少部分抑制其癥狀或綜合癥。足夠達(dá)到此效果的量稱(chēng)為“治療有效劑量”。
此應(yīng)用的有效量依賴(lài)如肽組合物、給藥方式、被治療疾病的階段和嚴(yán)重度，患者的體重和一般健康狀態(tài)及開(kāi)處方醫(yī)生的判斷，但對(duì)70公斤的患者通常范圍是約1μg—2000mg肽，更常用的肽劑量約從1μg—100mg，超過(guò)數(shù)周至數(shù)月用較高劑量，約1μg—1mg肽，這依賴(lài)于患者的CTL反應(yīng)，由測(cè)定從患者獲取的PBLs中的HBV特異CTL活性確定。必須牢記，此發(fā)明的肽類(lèi)和組合物通常用于嚴(yán)重疾病狀態(tài)，即威脅生命的或有潛在性生命威脅的狀況。在這些情況下，根據(jù)外源物質(zhì)的最小量和肽的相對(duì)無(wú)毒性，盡可能的，在治療醫(yī)生的指導(dǎo)下施用實(shí)際過(guò)量的這些肽。由治療醫(yī)生選擇的劑量和給藥方式確定本發(fā)明組合物是單一還是多次給藥。為有效地治療患者，在任何情況下藥物制劑，藥物制劑都應(yīng)提供足夠的本發(fā)明細(xì)胞毒T—淋巴細(xì)胞刺激的肽。
治療使用時(shí)，HBV感染癥狀一產(chǎn)生就應(yīng)用藥或在急性感染病例的診斷后不久用藥，持續(xù)到至少全部消除癥狀，再繼續(xù)用藥一段時(shí)后不久。在徹底確診的和慢性的病例，需要接著用維持量或提供高量。在急性肝炎的治療過(guò)程中，對(duì)HBV有效的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生，使繼續(xù)發(fā)展成慢性肝炎、HBV攜帶者期及產(chǎn)生肝細(xì)胞癌的可能性最小。
用本發(fā)明的組合物治療感染性個(gè)體，可加快解決急性感染個(gè)體的急性感染，大約可自然解決約90％。對(duì)患(感染)漸進(jìn)性慢性感染的個(gè)體，這些組合物對(duì)預(yù)防從急性產(chǎn)生慢性感染的方法特別有用。患病個(gè)體證實(shí)在先于或感染期，例如此處所述，那些組合物可定位在他們身上，對(duì)較大的人群對(duì)用藥需要最小。
肽組合物也能用于治療慢性肝炎，刺激攜帶者的免疫系統(tǒng)徹底減少或甚至消除病毒感染的細(xì)胞。感染后大約3—6個(gè)月，患慢性肝炎者可證實(shí)病毒試驗(yàn)陽(yáng)性。在其急性感染期，由于不夠(或缺乏)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，這些個(gè)體可能發(fā)展為慢性HBV感染，所以為有效地刺激細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答，在制劑中供應(yīng)有潛在免疫性肽的量，提供有效的用藥方法是重要的。
因此，為治療慢性肝炎，對(duì)70公斤體重的患者代表性劑量是約1μg—1000mg，優(yōu)選劑量約5μg—100mg。給藥應(yīng)至少持續(xù)至臨床體征或?qū)嶒?yàn)指標(biāo)表明HBV感染消除了或?qū)嵸|(zhì)性降低了，及其后一段時(shí)期。在確癥期，如1—4周，需要通過(guò)維持或較高劑量提供免疫劑量，為必要地去除感染，可能一個(gè)延長(zhǎng)期。為治療慢性和攜帶者HBV感染，需要將CTL肽類(lèi)同能誘導(dǎo)其它HBV抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的其它肽類(lèi)或蛋白質(zhì)結(jié)合起來(lái)。
治療用藥物組合物，可用非腸道、體表、口服或局部給藥。優(yōu)選地，藥物組合物可經(jīng)非腸道給藥，如經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、或肌肉內(nèi)給藥。因此，本發(fā)明提供了非腸道給藥的組合物，包括溶解或懸浮在可接受的載體，最好是水溶性載體中細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞刺激肽類(lèi)的溶液。各種各樣的水溶性載體可以利用，如水、緩沖水、0.4％的鹽水、0.3％的甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可通過(guò)常規(guī)的已知消毒技術(shù)消毒，或經(jīng)過(guò)濾消毒。所得的水溶液可包裝如上使用或凍干，凍干制品給藥前和消毒液混合。
這種組合物包括藥物上可接受的在近于生理?xiàng)l件下的輔助物，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖試劑，增強(qiáng)調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑等，如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、月桂酸山犁聚糖、油酸三乙胺等。
在一些實(shí)施方案中，藥物組合物中至少包含一種和CTL接觸的成分是必要的。據(jù)證實(shí)脂類(lèi)在體內(nèi)能和CTL接觸，以對(duì)抗病毒抗原，如三棕櫚酰—硫—甘氨酰半胱氨?！z氨?！z氨酸(P3CSS)和一適合的肽類(lèi)共價(jià)結(jié)合時(shí)能有效地和病毒特異細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞接觸。見(jiàn)Deres等，Na-ture342561—564(1989)，在此作為參考。本發(fā)明中的肽類(lèi)能和P3CSS偶聯(lián)，如對(duì)個(gè)體給藥使其對(duì)HBV，特異地接觸細(xì)胞毒T—淋巴細(xì)胞應(yīng)答的脂肽。進(jìn)一步，誘導(dǎo)中和抗體也能與結(jié)合肽類(lèi)的P3CSS接觸，此肽有合適的抗原決定簇，如HBsAg決定簇。這兩種組合物結(jié)合在一起，結(jié)果更有效地產(chǎn)生對(duì)HBV感染的體液和細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)。
本發(fā)明藥物制劑中細(xì)胞毒T—淋巴細(xì)胞刺激肽的濃度可廣泛地致變，即根據(jù)體重從約少于1％，通常約在或至少約10％到20％至50％或更多。此濃度，根據(jù)特殊選擇的給藥類(lèi)型主要通過(guò)流體容積，粘滯度而選定。
因此靜脈內(nèi)溶入的典型藥物組合物制成250ml滅菌Ringer溶液，100mg肽。制備非腸道給藥組合物的實(shí)際對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知或顯而易見(jiàn)的，如Remington’s Phar-maceutical Science，17ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1985)，在此作為參考。
本發(fā)明中的肽類(lèi)也可通過(guò)脂質(zhì)體給藥，此方法是由多肽以特定的組織為靶標(biāo)，如淋巴組織或感染了HBV的肝細(xì)胞。脂質(zhì)體也用來(lái)增加肽類(lèi)組合物的半衰期。用于本發(fā)明中的脂質(zhì)體包括乳液，泡沫膠，膠束，不溶的單分子層，液態(tài)晶體，磷脂分散液，薄片層等。在這些制品中被運(yùn)送的肽類(lèi)結(jié)合為脂質(zhì)體的部分，單獨(dú)或與結(jié)合的分子相結(jié)合，如在旺盛的淋巴細(xì)胞中的受體，如單克隆抗體，它連接在CD45抗原上，或與其它治療性或免疫原性組合物結(jié)合。因此，本發(fā)明所望肽的脂質(zhì)體能直接達(dá)到淋巴或肝細(xì)胞位點(diǎn)，然后脂質(zhì)體運(yùn)這可選擇的治療用或免疫原肽組合物。本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體由標(biāo)準(zhǔn)的形成囊泡的類(lèi)脂形成，它通常包括中性的和帶負(fù)電的磷脂和固醇類(lèi)，如膽固醇。類(lèi)脂的選擇通常要考慮下列因素進(jìn)行，如脂質(zhì)體大小及其在血流中的穩(wěn)定性。各種各樣的方法可用于制備脂質(zhì)體，記述在如Szoka等的Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，U.S.Patent Nos.4,235,871,4,501,728，4,837,028，和5,019,369，在此作為參考。為定位在免疫細(xì)胞上，連接進(jìn)脂質(zhì)體的配體包括如，特異細(xì)胞表面的抗體或片段，想要的免疫系統(tǒng)細(xì)胞決定劑。含肽類(lèi)的脂質(zhì)體懸液通過(guò)靜脈內(nèi)、局部地、表面地等途經(jīng)給藥，劑量隨著給藥方法、運(yùn)送的肽、治療的疾病所屬階段而變化。
對(duì)固體組合物，可以使用常規(guī)非毒性固體載體，其中包括如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)口服，可藥用無(wú)毒組合物通過(guò)結(jié)合常用受體形成，如以前列舉的那些載體，通常含10—95％的活性成分，即本發(fā)明中的一個(gè)或多個(gè)肽類(lèi)，更優(yōu)選濃度為25％—75％。
通過(guò)氣霧給藥，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞刺激肽最好同表面活性劑及推進(jìn)劑一道，經(jīng)細(xì)分形式使用。典型肽的百分率是體重的0.01％—20％，最好在1％—10％。當(dāng)然表面活性劑必須無(wú)毒、最好溶于推進(jìn)劑中。此種試劑的代表物是含6到22個(gè)碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、合成樹(shù)脂酸及油酸，它們都帶有脂肪族多元醇或其環(huán)化酐?？梢允褂没旌硝ィ缁旌匣蛱烊桓视王?。表面活性劑占組合物重的0.1％—20％，最好在0.25—5％。這種組合物的平衡物是推進(jìn)劑。載體也可含如所述的用于鼻內(nèi)傳運(yùn)的卵磷酯。
本發(fā)明的另一方面是疫苗，它包含此處所述的作為活性成分的免疫原有效量的細(xì)胞毒T—淋巴細(xì)胞刺激肽。肽類(lèi)可引入宿主，包括人類(lèi)，和其自身載體連接或作為活性肽單位的同源聚合物或異源聚合物。這種聚合物有利于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。不同的肽用于構(gòu)建聚合物，這種增強(qiáng)能力誘導(dǎo)抗體和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和不同的HBV抗原決定簇反應(yīng)。有用的載體技術(shù)已眾所周知，包括如鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白、甲狀腺球蛋白、白蛋白，如血清白蛋白，破傷風(fēng)類(lèi)毒素，聚合氨基酸如聚合(D—賴(lài)氨酸D—谷氨酸)等。疫苗也包括生理上可耐受的(可接受的)稀釋劑，如水，磷酸鹽緩沖的鹽水或鹽水，進(jìn)一步典型地包括輔劑。輔劑，如不完全的Freund輔劑，磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬都是現(xiàn)有技術(shù)中已知材料。如上所述，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答通過(guò)將本發(fā)明中的肽類(lèi)接合到類(lèi)脂上，如P3CSS上啟動(dòng)。一旦如此處所述通過(guò)注射、氣霧、口服、經(jīng)皮膚或其它途徑用肽組合物免疫，宿主免疫系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生大量對(duì)HBV抗原特異性的細(xì)胞毒T—淋巴細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)答。宿主至少部分地對(duì)HBV感染有免疫性，或抵抗?jié)u進(jìn)性慢性HBV感染。
以含本發(fā)明肽類(lèi)的疫苗組合物給患HBV感染或有HBV感染危險(xiǎn)性的患者給藥，以增強(qiáng)患者自身免疫力。這樣的量稱(chēng)為“免疫原效有劑量”。在此應(yīng)用中，精確量還是依賴(lài)于患者的健康狀況和體重、用藥方式、制劑特性等，但常規(guī)范圍是從約1.0μg—約500mg，這對(duì)70公斤患者而言，更常用的是對(duì)70公斤體重患者，從約50μg—約200mg。這些肽類(lèi)對(duì)合適的HLA型個(gè)體給藥，如來(lái)自于HBenv183—191(Seq.ID No.1)，HBenv248—260(Seq.ID No.2)，HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，HBenv204—212(Seq.ID No.13)，和/或HBenv370—379(Seq.ID No.14)，
區(qū)的肽類(lèi)疫苗組合物，對(duì)至少HLA—A2個(gè)體給藥。
在某些實(shí)例中，理想的是把本發(fā)明中的肽類(lèi)疫苗和對(duì)HBV誘導(dǎo)中和抗體應(yīng)答的疫苗結(jié)合起來(lái)，特別是對(duì)HBV外殼抗原，如重組HBV編碼的外殼抗原或從HBV感染的個(gè)體獲得了純化血漿制品制備的疫苗。各種各樣的HBV疫苗制品已描述了，主要根據(jù)其中的HBsAg和多肽片段。如可用本發(fā)明中多肽配制的疫苗例子，通常見(jiàn)EP154,902和EP 291,586，U.S.Pat.Nos.4,565,599，4,624,145，4,599,230，4,599,231，4,803,164，4,882,145，4,977,092，5,017,588和5,019,386，此處都為參考。這些疫苗能結(jié)合在一起同時(shí)給藥，或各自給藥。
為了治療和免疫目的，本發(fā)明的肽類(lèi)也可以衰減病毒宿主，如牛痘表達(dá)。此方法涉及牛痘病毒的使用，牛痘病毒在本發(fā)明中作為表達(dá)編碼HBV肽類(lèi)核苷酸序列的載體。一旦重組牛痘病毒引入急性或慢性HBV感染的宿主或非感染的宿主，就表達(dá)HBV肽，由此產(chǎn)生對(duì)HBV的宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。在免疫方法中有用的牛痘載體和方法記載在如U.S.Patent No.4,722,848，此處作為參考。另一個(gè)載體是BCG(bacille Calmette Guerin)。BCG載體記載在Stover等的Nature351456—460(1991)，此處作為參考。用于本發(fā)明肽類(lèi)治療給藥或免疫的各種其它媒介物，如Salmonellatyphi媒介物等，對(duì)所述的本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
有權(quán)利要求的本發(fā)明的組合物及方法可用作活體外治療。活體外治療意思是在體外進(jìn)行治療和免疫原操作，如可從患者去除淋巴細(xì)胞或其它靶細(xì)胞，用高劑量的目標(biāo)肽治療，在細(xì)胞培養(yǎng)基中提供一種刺激肽濃度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)患者達(dá)到或耐受的水平。接著治療是刺激CTLs，細(xì)胞僅用于宿主治療HBV感染，宿主的細(xì)胞也可暴露于帶有編碼上述多肽的基因的載體。一旦用載體轉(zhuǎn)染，細(xì)胞便可在體外增殖并反用到患者。達(dá)到一個(gè)預(yù)定細(xì)胞密度體外增殖的細(xì)胞可反用于患者。
肽類(lèi)也可作用診斷試劑，如本發(fā)明的肽類(lèi)可用于確定特定個(gè)體對(duì)治療過(guò)程的易感性，此治療過(guò)程使用了肽或相關(guān)肽類(lèi)，所以是對(duì)感染個(gè)體，改善其現(xiàn)有治療條件或缺定預(yù)后有幫助的。此外，肽類(lèi)也可用于預(yù)測(cè)個(gè)體在發(fā)展成慢性HBV感染的實(shí)際危險(xiǎn)期。
下列實(shí)施例只作說(shuō)明，而不是限制。
實(shí)施例1CTL特異性HBenv抗原決定簇的鑒定本實(shí)施例描述刺激HLA限制性CTL特異性應(yīng)答HBV外殼抗原的HBenv肽的鑒定。
用于本實(shí)驗(yàn)的病人為HLA—2陽(yáng)性。研究了13個(gè)處于急性肝炎過(guò)程中的病人(A—1到A—13，表II)，6個(gè)被HBV慢性感染的病人(C—1到C—6)，和6個(gè)用作正常對(duì)照的來(lái)感染的健康自愿者(N—1到N—6)。病人及其HLA單型樣品用PBMC在HLA分型盤(pán)中的微量細(xì)胞毒性試驗(yàn)來(lái)鑒定，如表II所示。
急性肝火的診斷以基本診斷標(biāo)準(zhǔn)為根據(jù)。診斷參數(shù)包括肝損傷的臨床(黃疸)和生化證據(jù)(ALT活性至少比正常的上限高20倍)，以及急性HBV感染(存在HBV表面抗原(HBsAg)和IgG抗HBc抗體)的血清學(xué)證據(jù)，在肝炎δ和肝炎C病毒感染時(shí)無(wú)血清學(xué)證據(jù)(Abbott Laboratories，North Chcago.IL)。
所有病人在出現(xiàn)黃疸后頭4周期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此時(shí)他們的血清為HBsAg陽(yáng)性而且其ALT水平明顯反常。13個(gè)病人中11人隨后康復(fù)，在開(kāi)始診斷后的4個(gè)月內(nèi)血清轉(zhuǎn)氨酶正常化且HBsAg被清除。1個(gè)病人(A—11，表Ⅱ)發(fā)展成慢性發(fā)作肝炎而且在開(kāi)始診斷后的13個(gè)月內(nèi)保持HBsAg陽(yáng)性。1個(gè)病人(A—10)在初次診斷會(huì)面后失去了聯(lián)系。攜帶慢性肝炎B的病人在超過(guò)6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)為重復(fù)的血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性而且表現(xiàn)出血清ALT活性輕微地到中等程度地升高。正常對(duì)照沒(méi)有HBV感染的臨床病史且對(duì)HBV標(biāo)記物血清學(xué)反應(yīng)為陰性。所有病人和正常對(duì)照對(duì)HIV抗體為血清學(xué)陰性。
表II實(shí)驗(yàn)對(duì)象的特征對(duì)象性別 診斷HLA單型分類(lèi)A—1男 急性A2，A30，B35，B44，Cw4，cw7A—2男 ″A2，A31，8w58(5Y)，B51，Cw3A—3男 ″A2，Bw41，Bw71，Cw4，Cw7A—4男 ″A2，A32，Bw41，Bw71，Cw4，Cw7A—5男 ″A2，A1，B8，8w58(5Y)，Cw7A—6女 ″A2，Aw68，B35，Cw3，Cw4A—7男 ″A2，A1，B8，Bw73，Cw3，Cw4A—8女 ″A2，Aw69，Bw53，Cw4A—9男 ″A2，A24，B7，B27，Cw2，Cw7A—10 男 ″A2，A3，Bw62，Bw71，Cw3，Cw4A—11 男 ″A2，A24，B35，Cw4A—12 男 ″A2，A3，Cw5A—13 男 ″A2，A3，B7，Bw60，Cw3，Cw7C—1男 慢性 A2，B27，B35，Cw2，Cw4C—2男 ″A2，A1，B8，B44C—3男 ″A2，A24，B44，Bw67C—4男 ″A2，Aw69，Bw41，Bw52C—5男 ″A2，B5，Bw62，Cw4C—6男 ″A2，A26，B36，Cw4N—1男 正常 A2，A11，B44，cw4N—2男 ″A2，Bw56，B35N—3男 ″A2，A11，B8，Bw62，Cw4N—4男 ″A2，A23，B5，Bw58，Cw2，Cw6N—5男 ″A2，B44，Bw63N—6女 ″A2，A11，Bw58在Ficoll—Hypaque密度梯度(sigma，st，Louis，Mo)中分離病人和正常供血者的PBMC，在Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco，Grand Island，NY)中洗三次，重懸于含L—谷氨酰胺(2mM)，慶大霉素(10μg/ml)，青(50U/ml)，鏈霉素(50μg/ml)，HEPES(5mM)，10％熱滅活的人AB血清之RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)(完全培養(yǎng)基)中，在24孔平板上以4×106細(xì)胞/孔涂板。向細(xì)胞培養(yǎng)物中以終濃度為10μg/ml加入合成肽，除非另有提示。在剌激的第一周內(nèi)以1μg/ml加入rHBcAg。在第3天，向每孔中加入1ml含rIL2(Hoffman—La Roche，Nutley，N.Y)終濃度為10U/ml的完全培養(yǎng)基。在第7天，用肽，rIL2和輻射過(guò)(3000rads)的自體或HLA—A2相配的飼養(yǎng)細(xì)胞再剌激培養(yǎng)物，在第14天，對(duì)培養(yǎng)的PBMC測(cè)CTL活性。經(jīng)每周用1×106輻射過(guò)的(6000rads)異源PBMC和1×105輻射過(guò)的(18000rads)JY細(xì)胞(異源EBV—B轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，HLA—A2.1，B7，Cw7)(14)在1ml含1μg/ml肽，20U/ml IL2和1μg/ml植物凝集素(PHA)(Sigma，st，Louis.Mo)的完全培養(yǎng)基中再刺激來(lái)擴(kuò)散挑選出的表現(xiàn)出肽特異性細(xì)胞溶融活性的培養(yǎng)物。
由a)以10μg/ml的合成肽培養(yǎng)過(guò)夜的自體PHA剌激過(guò)的胚細(xì)胞和異源HLA相配或不相配的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(B—LCL)；b)上述穩(wěn)定B—LCL轉(zhuǎn)染體；或C)以重組疫苗病毒(在下面描述)感染的B—LCL中任一組成靶細(xì)胞用于細(xì)胞毒性評(píng)估。B—LCL從美國(guó)組織親合性和免疫遺傳學(xué)組織(Boston，MA)購(gòu)買(mǎi)或按在同時(shí)待審批的申請(qǐng)07/935，898中所述由我們自己從病人和正常供血者中匯集而產(chǎn)生。細(xì)胞在含L—谷氨酰胺(2mM)，慶大霉素(10μg/ml)，青霉素(50U/ml)，鏈霉素(50μ/ml)，HEPES(5mM)，和10％(體積/體積)加熱滅活的FCS(Gibco，Grand Island，NY)之RPMI1640培養(yǎng)基中保持。自體PBMC胚細(xì)胞的短期細(xì)胞系在用作靶細(xì)胞前，經(jīng)過(guò)用1μ/mlPHA在含L—谷氨酰胺(2mM)，慶大霉素(10μm/ml)，青霉素(50U/ml)，鏈霉素(50μg/ml)，HEPES(5mM)，10％(體積/體積)加熱滅活的FCS，和10U/ml rIL2的RPMI1640中刺激外周血PBMC7天來(lái)產(chǎn)生。在振蕩盤(pán)中以50噬菌斑形成U/細(xì)胞室溫感染1×106個(gè)細(xì)胞1小時(shí)，然后洗一次并37C培養(yǎng)過(guò)夜以制備疫苗感染的靶細(xì)胞。
用100μCi的51Cr(Amersham，Arlington Heights，IL)標(biāo)記靶細(xì)胞1小時(shí)并用HBSS洗滌3次。使用含5000靶細(xì)胞/孔的U型底96孔板在標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)來(lái)測(cè)定細(xì)胞溶融活性。所有試驗(yàn)一式二份。細(xì)胞性百分?jǐn)?shù)按公式100×[(實(shí)驗(yàn)釋放—自發(fā)釋放)/(最大釋放—自發(fā)釋放)]來(lái)測(cè)定。用加去污劑(1％Triton X—100，Sigma)后靶細(xì)胞的裂解來(lái)測(cè)定最大釋放。在所有試驗(yàn)中，自發(fā)釋放不到最大釋放的25％。
最初挑選了兩個(gè)HLA—A2陽(yáng)性的急性肝炎病人，分析CTL應(yīng)答含有2個(gè)重迭的HLA2.1等位特異性結(jié)合靶(WLSLLVPFV和LLVPFVQWFV)的HBsAg329—348(ASARFSWLSLLVPFVQWFVG(序列ID號(hào)22))。從前面的的實(shí)驗(yàn)已知。其中一個(gè)病人(A—3)表現(xiàn)出HLA A2限制性CTL應(yīng)答，代表—HLA A2.1等位特異性結(jié)合靶(FLPSOFFRSV)的10個(gè)殘基HBV病毒粒子抗原決定簇(HBcAg18—27)。認(rèn)為這個(gè)病人對(duì)HBsAg329—348中的1個(gè)或兩個(gè)靶位點(diǎn)具有潛在的應(yīng)答力。研究另一已知對(duì)HBcAg18—27不具應(yīng)答力的病人用于比較。
按上面所述以肽刺激兩個(gè)病人的PBMC產(chǎn)生HB-sAg329—348特異性CTL細(xì)胞系。刺激2～3周后，兩個(gè)病人對(duì)預(yù)先以HBsAg329—348肽脈沖過(guò)的純合性HLA A2.1陽(yáng)性EBV細(xì)胞系(JY)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性反應(yīng)。挑選病人A—1的HBsAg329—348特異性細(xì)胞系用于克隆。
在96孔微滴定板上開(kāi)始1，10，和100個(gè)細(xì)胞/孔克隆細(xì)胞系，再以0.3或1個(gè)細(xì)胞每孔亞克隆。細(xì)胞在存在有肽(1μg/ml)，PHA(1μg/ml)，rIL—2(20U/m)，輻射過(guò)(6000rads)的異源PBMC(105細(xì)胞/孔)，和輻射過(guò)(18000rads)JY細(xì)胞(104細(xì)胞/孔)的系件F涂板。按上面所述，除了不用肽而且以能穩(wěn)定表達(dá)HBV大型外殼抗原(EBO preS1，參考文獻(xiàn)10)的質(zhì)?；^(guò)的已輻射的JY細(xì)胞以105細(xì)胞每孔加入外，在24孔平板上再刺激HBV特異性克隆。
使用病人A—1的HBsAg329—348特異性細(xì)胞系從以1個(gè)細(xì)胞每孔(克隆B13，B16，B17)或0.3個(gè)細(xì)胞每孔(克隆B3)涂板的細(xì)胞中得到4個(gè)克隆。以一組在HLAI型等位基因水平與效應(yīng)器部分匹配的異源靶細(xì)胞克隆B3。由于在肽上存在2個(gè)HLA—A2.1結(jié)合靶位點(diǎn)，使用在HLAI型水平與病人A1部分匹配的異源靶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)克隆B1的細(xì)胞溶融活性為HLA—A2限制性。以同樣方式鑒定得自病人A—3的HBsAg329—348特異性多克隆CTL細(xì)胞系為HLA—A2限制性。由于病人的HLA—A2亞型尚束鑒別，因此不知CTL應(yīng)答肽是僅為HLA—A2·1等位基因限制性的還是延伸到其它的HLA—A2亞型。
為測(cè)定HBsAg329—348上最小的優(yōu)選HLA—A2限制性CTL抗原決定簇，以HBsAg329—348序列生產(chǎn)一組氨基末端截短并重疊的9殘基部分和10殘基部分來(lái)測(cè)量含有2個(gè)重疊的理想HLA—22·1結(jié)合靶的20殘基肽上之HLA—A2限制性CTL抗原決定簇。經(jīng)過(guò)上述起始細(xì)胞系和HB-sAg329—348重復(fù)刺激，從病人A—1產(chǎn)生出HLA—A2限制性CTL克隆，以病人A—3產(chǎn)生出多克隆CTL細(xì)胞系1B9，用作效應(yīng)細(xì)胞，以形成CTL應(yīng)答HBsAg329—348的靈敏的特異性。經(jīng)過(guò)以起始20殘基或以截短肽培養(yǎng)HLA—A2·1陰性B細(xì)胞系(JY)產(chǎn)生靶細(xì)胞。
如圖1所示，結(jié)果表明2個(gè)HLA—A2·1結(jié)合靶(HB-sAg335—343)中僅第一個(gè)被CTL識(shí)別。而且資料表明該肽(WLSLLVPFV)是被HBsAg329—348刺激的CTL所識(shí)別的最小的優(yōu)選HLA—A2限制性抗原決定簇，由于HB-sAg335—343上氨基末端或羧基末端殘基的丟失導(dǎo)致CTL識(shí)性的喪失。
當(dāng)用肽刺激來(lái)自病人A—1的PBMC之CTL應(yīng)答時(shí)，HBsAg335—343在效應(yīng)器水平的優(yōu)勢(shì)是重復(fù)的。代表與HBsAg329—348亞基相配的合成肽用于以10μM剌激病人A—1的PBMC。刺激兩周后，按EF為60∶1用以10μM的相同肽預(yù)先脈沖輻射過(guò)的JY靶細(xì)胞和以10μM HBsAg335—343預(yù)先脈沖輻射過(guò)的JY靶細(xì)胞試驗(yàn)這些細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。圖2所示在4小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)結(jié)果代表溶胞％。在圖2中可見(jiàn)，盡管HBsAg335—343和其延伸的變異體證實(shí)能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，但氨基末端和羧基末端的氨基酸丟失導(dǎo)致肽刺激CTL應(yīng)答的能力完全喪失，因此支持了在HBsAg的329—348殘基間，HBsAg335—343是最小的優(yōu)選HLA—A2限制性抗原決定簇這一結(jié)論。
實(shí)施例IIHBVenv中對(duì)7個(gè)HLA—A2·1結(jié)合靶位點(diǎn)的CTL應(yīng)答HBV外殼蛋白的HBsAg區(qū)存在7個(gè)理想的HLA—A2·1等位特異性結(jié)合靶位點(diǎn)(表III)，這些位點(diǎn)定義為長(zhǎng)度為9—10個(gè)殘基，在第二位含亮氨酸，羧基末端殘基為纈氨酸。根據(jù)實(shí)施例I得到的結(jié)論，檢查了12個(gè)攜帶急性肝炎B的HLA—A2陽(yáng)性病人這7個(gè)外殼肽，加上已知的HLA—A2限制性HBV病毒粒子抗原決定簇(HBcAg18—17)刺激CTL應(yīng)答的能力。作為比較，試驗(yàn)了6個(gè)攜帶慢性肝炎的HLA—A2陰性病人和6個(gè)未感染的正常對(duì)照者對(duì)相同的一組肽的應(yīng)答。
表III，來(lái)自HBV的HLA—A2·1結(jié)合靶位點(diǎn)和肽
按實(shí)施例I所述，以下列合成肽1＝HBcAg18—27，2＝HBsAg201—210，3＝HBsAg21—257，4＝HBsAg260—269，5＝HBcAg335—343，6＝HBsAg338—347，7＝HBsAg348—357，8＝HBsAg378—387，刺激來(lái)自急性病人(A—1到A—12)，慢性病人(C1到C6)，和正常對(duì)象(N—1到N—6)的PBMC2周，檢測(cè)對(duì)以相同肽預(yù)先脈沖過(guò)夜的JY靶細(xì)胞在4小時(shí)內(nèi)的51Cr釋放。通過(guò)從預(yù)先以該肽脈沖過(guò)的JY靶細(xì)胞51Cr釋放量中減去未用肽預(yù)先脈沖的JY靶細(xì)胞51Cr釋放量來(lái)測(cè)定肽特異性細(xì)胞毒性。結(jié)果如圖3所示，4小時(shí)內(nèi)51Cr釋放試驗(yàn)代表特異性溶胞％。
如圖3所見(jiàn)，12個(gè)攜帶急性肝炎的HLA—A2陽(yáng)性病人中有9個(gè)至少對(duì)這一組多肽中的一個(gè)產(chǎn)生應(yīng)答。作為對(duì)照，按同樣的體外剌激方法，在6個(gè)HLA—A2陽(yáng)性未感染的正常對(duì)照者沒(méi)有一個(gè)對(duì)其中的任一肽產(chǎn)生應(yīng)答，這表明通過(guò)病人的體內(nèi)反射對(duì)這些肽的應(yīng)答由相應(yīng)的來(lái)自HBV的抗原決定簇引發(fā)。
重要的是在9個(gè)應(yīng)答者中有8個(gè)識(shí)別這一組肽中的多個(gè)抗原決定簇，表明在急性肝炎期間對(duì)HBV的CTL應(yīng)答既是多克隆的，又是多特異性的。而且，在9個(gè)應(yīng)答者中被識(shí)別的抗原決定簇譜存在很大的變化，有些抗原決定族比其它更頻繁地被識(shí)別。例如，HBcAg18—27和HBcAg335—343分別被9個(gè)應(yīng)答者中的7個(gè)和8個(gè)所識(shí)別，而且當(dāng)它們組合起來(lái)后9個(gè)應(yīng)答者都能識(shí)別。作為對(duì)照，HBsAg348—357，HBsAg251—259和HBsAg260—269在其所試驗(yàn)的應(yīng)答者中分別只被319，215和316的應(yīng)答者所識(shí)別。
急性感染病人的環(huán)狀病毒DNA核苷酸序列分析表明，包括CTL非應(yīng)答者的所有病人被表達(dá)以原型HBsAg335—343肽存在用于刺激體外CTL擴(kuò)散的精確氨基酸序列之病毒所感染。由于已知在所有公開(kāi)的來(lái)自全部4種HBV亞型的HBV序列中，如在GenBank—72數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的，以及此處所研究的10個(gè)病人中，殘基335—343的保守的，可推斷HBsAg335—343是HBV組—特異性的CTL抗原決定簇。然而，對(duì)HBsAg348—357卻不是這樣，因?yàn)樵?0個(gè)病人中發(fā)現(xiàn)只有7個(gè)被編碼原型序列用于體外刺激(GLSPTVWLSV)的病毒所感染。制下的3個(gè)病人(A—9，A—10，A—13)表現(xiàn)為變異序列，其中在357位的羧基末端纈氨酸被丙氨酸代替。在被原型病毒感染的病人中，與對(duì)HB-sAg335—343的應(yīng)答一樣，觀察了對(duì)HBsAg348—357的CTL應(yīng)答者和非應(yīng)答者。與此相反，在3個(gè)被變異病毒感染的病人中沒(méi)有一個(gè)表現(xiàn)出對(duì)原型肽的CTL應(yīng)答。
值得注意的是，所有9個(gè)應(yīng)答者后來(lái)變?yōu)镠BsAg陰性而且其肝臟疾病完全康復(fù)。相反，攜帶慢性肝炎的6個(gè)病人都不能清除病毒，也不能引發(fā)對(duì)這些抗原決定簇中任何一個(gè)的外周血CTL應(yīng)答。3個(gè)急性感染的病人(A—10，A—11，A—12)也不能對(duì)這些肽中的任何一個(gè)發(fā)生應(yīng)答。而且一個(gè)非應(yīng)答者(A—11)發(fā)展成慢性發(fā)作肝炎而且在其急性疾病后的13個(gè)月時(shí)仍為HBsAg陰性。綜合這些資料有力地證實(shí)了CTL應(yīng)答與病毒清除之間的相關(guān)性。然而，非應(yīng)答者病人A—12在疾病出現(xiàn)后的1—4個(gè)月內(nèi)血清轉(zhuǎn)化為HBsAg陰性。
如表II和圖3所示，本實(shí)驗(yàn)用JY靶細(xì)胞時(shí)，9個(gè)應(yīng)答者中有4個(gè)只共用HLA A等位基因(HLA—A2，B7，Cw7)，證實(shí)在這些個(gè)體中對(duì)所有肽的應(yīng)答為HLA—A2限制性。由于存在JY靶細(xì)胞時(shí)剩余的反應(yīng)者除A2外也共用HLA B7和/或Cw7等位基因，所以可能在這些病人中(盡管靠不住)，這些等位基因可能也用作這些抗原決定簇的限制性單元。
7種HBV外殼肽不同免疫原性的分子基礎(chǔ)不能從其序列的比較中直接得到證據(jù)。通過(guò)測(cè)定7種外殼肽與一種無(wú)關(guān)的HLA—A2限制性病毒粒子抗原決定簇(HBcAg18—27)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合純合HLA—A2.1陽(yáng)性B細(xì)胞系(JY)的能力來(lái)檢查肽對(duì)HLA—A2.1有關(guān)的結(jié)合親合性之潛在區(qū)別。
使用來(lái)自病人A—4的HBcAg18—27特異性CTL克隆作為效應(yīng)細(xì)胞來(lái)源分析競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制。在加入一不飽和濃度(0.03μM)的目標(biāo)肽(HBcAg18—27)之前，向51Cr標(biāo)記的HLA—2.1陰性JY靶細(xì)胞和效應(yīng)器細(xì)胞(E∶T＝40∶1,3000靶細(xì)胞/孔)混合物中加入封閉肽(1，10，100μM)封閉40分鐘。通過(guò)計(jì)算封閉的靶細(xì)胞4小時(shí)內(nèi)51Cr的釋放水平來(lái)分析每個(gè)肽的結(jié)合能力。
如圖4所示，4個(gè)免疫原性肽的全部和3個(gè)非免疫原性肽中的2個(gè)與HLA—A2.1分子結(jié)合，但具有與其相應(yīng)的免疫原性無(wú)關(guān)聯(lián)的大范圍(超過(guò)100倍)可變效率。重要的是，在這一試驗(yàn)中唯一的一個(gè)不與HLA—A2.1結(jié)合的肽(HB-sAg337—348)是非免疫原性的。然而，另外兩個(gè)非免疫原性肽對(duì)HLA—A2.1的結(jié)合親和力與一些免疫原性肽相比一樣高或更高。因此，盡管肽結(jié)合該I型分子的能力為免疫原性所必需，但這種能力并不保證其免疫原性。這暗示在抗原加工水平上的其它因子和T細(xì)胞的所有成份可能在決定病毒蛋白質(zhì)中的那一個(gè)HLA—A2.1結(jié)合肽能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答時(shí)發(fā)揮作用。
實(shí)施例III肽特異性CTL識(shí)別內(nèi)源性HBenV抗原通過(guò)測(cè)量HBsAg335—343和HBsAg348—357特異性CTL溶融被2組編碼來(lái)自克隆的HBVayw或adw亞型的HBV基因組之大型、中型和主要外殼多肽的重組牛痘病毒感染過(guò)的靶細(xì)胞之能力來(lái)檢查它們識(shí)別內(nèi)源性的合成抗原的能力。
獲得表達(dá)HBV大型、中型和主要外殼多肽(adw亞型)的重組牛痘病毒和相應(yīng)的對(duì)照野生型牛痘(Smith et al.，Nature302490(1983)；Cheng et al.，J.Virol.(1986)；andCheng and Moss，J.Virol，611286(1987)，此處的每一篇以參考文獻(xiàn)編寫(xiě))。按下面所述得到一系列獨(dú)立表達(dá)HBVayw亞型同樣的三種HBV外殼多肽的重組牛痘病毒。為表達(dá)HBsAg，含HBV序列核苷1409—2514的XhoI/SphI限制性片段克隆到牛痘病毒表達(dá)載體7.5K早期/晚期啟動(dòng)子下游。為構(gòu)preS1表達(dá)牛痘病毒，使用含核苷937—2514的BglII/SphI片段。為克隆preS2編碼序列，先合成一段從核苷1267起(例如，preS2編碼序列，先合成一段從核苷1267起(例如，preS2起始密碼子上游6個(gè)堿基對(duì))跨越1280位的EcoRI位點(diǎn)的短銜接寡核苷。將該寡聚核苷克隆到牛痘病毒表達(dá)載體上后，以將EcoRI/SphI HBV片段(核苷1280—2514)克隆到該中介構(gòu)建體來(lái)完成編碼序列的克隆。按Smith等(出處同上)所述的標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生重組牛痘病毒。按Guilhot等所述(J.Virol，662670(1992)，此外以參文獻(xiàn)來(lái)描述)，經(jīng)過(guò)用一組以EBV為基礎(chǔ)的含有相應(yīng)的HBV(ayw亞型)編碼區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染B—LCL來(lái)產(chǎn)生表達(dá)HBV外殼蛋白質(zhì)(ayw亞型)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
分別以肽序列WLSLLVPFV和GLSPTVWLSV剌激來(lái)產(chǎn)生—HBsAg335—343特異性CTL細(xì)胞系(病人A—1)和—HBsAg348—357特異性CT L細(xì)胞系(病人A—4)。CTL與經(jīng)51Cr—標(biāo)記的預(yù)先與培養(yǎng)基，或誘導(dǎo)肽或(對(duì)于HBsAg348—357)變異肽(GLSPTVWLSA)一起培養(yǎng)過(guò)的JY靶細(xì)胞一起保溫。CTL也與經(jīng)51Cr—標(biāo)記過(guò)的，以一組表達(dá)來(lái)自ayw和adw HBV基因組的HBV主型(V—HBs)，中型(V—preS2)和大型(V—preS1)外殼多肽的6個(gè)重組牛痘病毒感染過(guò)的JY靶細(xì)胞一起保溫。野生型牛痘病毒(V—wt)用作對(duì)照。HBsAg335—343特異特CTL細(xì)胞系(右組)以ET＝40∶1使用。HBsAg348—357特異性CTL細(xì)胞系(左組)以E∶T＝3∶1使用。所示的結(jié)果以4小時(shí)內(nèi)51Cr的釋放試驗(yàn)代表溶胞％。
來(lái)自病人A—1和A—4的HBsAg335—343和HB-sAg348—357特異性CTL能溶融重組牛痘病毒感染的合成所有3種HBV外殼蛋白的靶細(xì)胞(圖5)。這表明，這兩個(gè)合成的肽代表由感染的細(xì)胞對(duì)大型，中型和主型HBV外殼多肽進(jìn)行內(nèi)源性加工產(chǎn)生的抗原決定簇。
重要的是HBsAg335—343特異性CTL能溶融被兩套具有相同效力的重組牛痘病毒所感染的靶細(xì)胞，而且HB-sAg348—357特異性CTL對(duì)ayw感染的靶細(xì)胞組的溶胞效力比對(duì)adw靶細(xì)胞要高。
上面實(shí)施例所述的結(jié)果表明人HBV的CTL反應(yīng)表現(xiàn)為相當(dāng)多價(jià)的，可能承擔(dān)對(duì)這一系列的病毒感染更有效的保護(hù)。而且資料表明此處所用的肽刺激策略對(duì)由多態(tài)的HLAI型基因座位所限制的多價(jià)反應(yīng)之鑒定和分析既是有效的，也是有力的。由于另外的HLA等位特異性結(jié)合靶位點(diǎn)被鑒別，含有這些靶位點(diǎn)來(lái)自于HBV的肽可用CTL前體的體外刺激。
本說(shuō)明書(shū)提到的所有出版物，專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)按相同范圍以參考文獻(xiàn)的形式編入說(shuō)明書(shū)。如特別是每個(gè)單獨(dú)的出版物，專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)分別以參考文獻(xiàn)的形式被編入。
從上所述應(yīng)懂得盡管為說(shuō)明本發(fā)明的目的而描述了本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)此的各種修改可能不會(huì)偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。因此，本發(fā)明不受從屬權(quán)利要求的限制。
序列表一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Chisari，F(xiàn)ancis V.(ⅱ)發(fā)明題目誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答肝炎B病毒的肽類(lèi)(ⅲ)序列號(hào)27(ⅳ)通信地址(A)聯(lián)系人Townsend和Townsend(B)街道One Market Plaza，Steuart Street Tower(C)城市三藩市(D)州CA(E)國(guó)家USA(F)郵編94105(ⅴ)可讀計(jì)算機(jī)類(lèi)型(A)介質(zhì)類(lèi)型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IMB可兼容的PC(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS
(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(ⅵ)目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)(ⅷ)代理/代理人信息(A)姓名Parmelee，Steven W.
(B)登記號(hào)31,990(C)檔案號(hào)14740—4(ⅸ)電訊信息(A)電話(huà)206—467—9600(B)電傳415—543—5043(2)SEQ ID No1信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No1Phe Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile1 5(2)SEQ ID NO2信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu1 5 10(2)SEQ ID NO3信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu1 5 10(2)SEQ ID NO4信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu1 5(2)SEQ ID NO5信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO6信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸
(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu1 5(2)SEQ ID NO7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val1 5(2)SEQ ID NO8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu1 5 10(2)SEQ ID NO9信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val15 10(2)SEQ ID NO10信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val1 5(2)SEQ ID NO11信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro Val1 5 10(2)SEQ ID NO12信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu1 5(2)SEQ ID NO13信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5(2)SEQ ID NO14信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€(xiàn)型(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leul 5 10(2)SEQ ID NO15信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val1 5 10(2)SEQ ID NO16信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln1 5 10(2)SEQ ID NO17信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala1 5 10Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro15 20(2)SEQ ID NO18信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18Pro His His Tyr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu1 5 10Cys Trp Gly Glu Leu Met Tyr Leu Ala15 20(2)SEQ ID NO19信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly1 51OArg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu15 20(2)SEQ ID NO20信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro1 5 10Pro Ala15(2)SEQ ID NO21信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg1 5 10Pro Pro Asn Ala Pro Ile15 20(2)SEQ ID NO22信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro1 5 10Phe Val Gln Trp Phe Val Gly15 20(2)SEQ ID NO23信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val1 5 10(2)SEQ ID NO24信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val1 5 10(2)SEQ ID NO25信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)單鏈(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val1 5 10(2)SEQ ID NO26信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val1 5 10(2)SEQ ID NO27信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單線(xiàn)(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val1 5 10
權(quán)利要求
1.含有以下序列的可誘導(dǎo)CTL的肽HBenv183—191(Seq.ID No.1)Phe—Leu—Leu—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile.
2.如權(quán)利要求1的可誘導(dǎo)CTL的肽，其中此肽也含有T助抗原決定簇。
3.如權(quán)利要求1的肽，與致免疫的脂載體結(jié)合。
4.可誘導(dǎo)CTL的肽，含有8到13個(gè)氨基酸，其中至少大部分氨基酸與具有序列HBenv248—260(Seq.ID No.2)Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu的HBenv的相應(yīng)部分同源。
5.如權(quán)利要求4的可誘導(dǎo)CTL的肽，它含有9到11個(gè)氨基酸。
6.如權(quán)利要求4的可誘導(dǎo)CTL的肽，它含有HBenv248—257(Seq.ID No.3)Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；HBenv249—257(Seq.ID No.4)Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；HBenv249—258(Seq.ID No.5)Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；HBenv250—258(Seq.ID No.6)Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；HBenv251—259(Seq.ID No.7)Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val；或HBenv251—260(Seq.ID No.8)Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu.
7.含有9到11個(gè)氨基酸的可誘導(dǎo)CTL的肽，其中至少大多數(shù)氨基酸與具有序列HBenv334—344(Seq.ID No.)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val的HBenv相應(yīng)部分同源。
8.如權(quán)利要求7的可誘導(dǎo)CTL的肽，含有HBenv335—343(Seq.ID No.10)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val ；HBenv334—343(Seq.ID No.15)Ser—Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val；或HBenv335—344(Seq.ID No.16)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val—Gln.
9.如權(quán)利要求8的肽，與致免疫的脂蛋白質(zhì)載體結(jié)合。
10.如權(quán)利要求9的肽，懸浮于含有脂質(zhì)體的藥物可接受的載體中。
11.治療或防治乙型肝炎病毒感染的方法，包括給具有HLA—A2單型的宿主以有效劑量的肽給藥，其中的肽是含有以下序列的可誘導(dǎo)CTL的肽HBenv183—191(Seq.ID No.1)Phe—Leu—Leu—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile.
12.治療或防治乙型肝炎病毒感染的方法，包括給具有HLA—A2單型的宿主以有效劑量的肽給藥，其中的肽是含有8至13個(gè)氨基酸可誘導(dǎo)CTL的肽，其中至少大部分氨基酸與具有序列HBenv248—260(Seq.ID No.2)Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu，或HBenv335—343(Seq.ID No.10)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val的HBenv的相應(yīng)部分同源。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中可誘導(dǎo)CTL的肽是HBenv248—257(Seq.ID No.3)Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；HBenv249—257(Seq.ID No.4)Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；HBenv249—258(Seq.ID No.5)Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Ieu—Ile—Phe—Leu—Leu；HBenv250—258(Seq.ID No.6)Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；HBenv251—259(Seq.ID No.7)Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val；或HBenv251—260(Seq.ID No.8)Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu。
14.如權(quán)利要求13的方法，基中宿主經(jīng)慢性乙型肝炎病毒感染或是乙型肝炎病毒的攜帶者。
15.如權(quán)利要求12的方法，其中可誘導(dǎo)CTL的肽是HBenv335—343(Seq.ID No.10)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val；HBenv334—343 (Seq.ID.No.15)Ser—Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val；或HBenv335—344(Seq.ID.No.16)Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val—Gln.
16.如權(quán)利要求12的方法，其中宿主經(jīng)急性乙型肝炎毒感染。
17.如權(quán)利要求12的方法，其中可誘導(dǎo)CTL的肽被預(yù)防性地給藥。
18.如權(quán)利要求13的方法，其中宿主經(jīng)慢性乙型肝炎感染或是乙型肝炎病毒的攜帶者。
19.如權(quán)利要求12的方法，其中可誘導(dǎo)CTL的肽與可產(chǎn)生對(duì)HBVT助應(yīng)答的第二肽一起給藥于宿主。
20.如權(quán)利要求19的方法，基中可誘導(dǎo)CTL的肽與可誘導(dǎo)T助的肽相連接。
全文摘要
肽類(lèi)被用來(lái)限定刺激抗乙型肝炎病毒的HLA限制性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的抗原決定簇。所述肽由HBV外殼區(qū)衍生出，且特別用于治療或防治HBV感染，包括刺激應(yīng)答于HBV抗源的慢性感染個(gè)體的免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)C07K14/02GK1118573SQ94191295
公開(kāi)日1996年3月13日 申請(qǐng)日期1994年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月26日
發(fā)明者弗朗西斯·V·齊賽瑞 申請(qǐng)人:斯克瑞普斯研究所