專利名稱：枯草芽孢桿菌降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號及作為抗菌劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域，涉及枯草芽孢桿菌降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號及作為抗菌劑 的用途。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus stibillus)是一株從養(yǎng)殖環(huán)境中分離純化的微生物。根 據(jù)伯杰氏手冊進(jìn)行菌株生理生化特征鑒定，枯草芽孢桿菌在普通培養(yǎng)基上近園形，不透明， 表面干燥，周圍有皺峽，邊緣不齊，顯微鏡下革蘭氏染色陽性，菌體桿狀。還具有以下生化特性甘露醇產(chǎn)酸+，阿拉伯糖產(chǎn)酸+，葡萄糖產(chǎn)氣_，形成吲哚_， V. P試驗(yàn)+，苯丙氨酸脫氨-，V. P培養(yǎng)終PH值5. 8，葡萄糖產(chǎn)酸+，淀粉水解+，檸檬酸鹽利 用+，接觸酶+，硝酸鹽還原+，NaCUKCl需要+，10 % NaCl生長+，7 % NaCl生長+，5 % NaCl 生長+，2% NaCl生長+等特性(注“ + ”代表陽性，“_”代表陰性)。目前枯草芽孢桿菌應(yīng)用研究涉及1.抗菌和溶菌作用；2.提高機(jī)體免疫力；3.調(diào) 節(jié)機(jī)體腸道微生態(tài)；4.促進(jìn)消化和機(jī)體生長；5.改善養(yǎng)殖環(huán)境。文獻(xiàn)報(bào)道的藥理作用有以 下幾方面，但均沒有涉及其對群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制機(jī)制。藥理研究的有關(guān)報(bào)道如下抗菌、 抗病毒、促進(jìn)消化、提高抗病力、改善養(yǎng)殖環(huán)境等多種作用。在抗菌方面，已有的相關(guān)研究結(jié)果有(1)枯草芽孢桿菌T2發(fā)酵液中分離純化出 一種蛋白酶(29. OkD)，其最適溫度為65°C，最適pH為8.0，該酶對棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp. vasinfectum)的孢子萌發(fā)、菌絲生長有明顯抑制作用。表明，枯草芽孢桿 菌有抗真菌作用(邢介帥，等.植物病理學(xué)報(bào)，2008，38 (4) 377-381) ； (2)枯草芽孢桿菌發(fā) 酵液抽提后得到的脂肽類抗生素對多種植物病原菌有抑制作用；其產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌物質(zhì) 能夠抑制灰霉病菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長。表明，枯草芽孢桿菌具有生物防治作用(陳華， 等.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(1) 1-4)。這些抗菌研究都是將從枯草芽孢桿菌中提取的物質(zhì) 作了抗菌效果的研究和證實(shí)，而未對枯草芽孢桿菌菌株的抗菌效果作出研究。另外對枯草 芽孢桿菌菌株的研究表明，其對禽舍分離的變形菌屬細(xì)菌、金黃色葡萄球菌有不同程度的 抑制作用，但是，對大腸桿菌、腸球菌屬細(xì)菌影響不大(王城，等.中國農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，26(3) 23-26)。由于作為菌株存在時，其作用機(jī)理并非簡單的化學(xué)物質(zhì)對細(xì)菌的抑制，而是一個復(fù) 雜的細(xì)菌間的相互影響的有機(jī)系統(tǒng)，因此，枯草芽孢桿菌菌株的抑菌機(jī)理，以及可以加以抑 制的細(xì)菌菌種，目前仍是一個未知的問題。這在一定程度上制約了枯草芽孢桿菌的抑菌應(yīng) 用。群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)是一種細(xì)菌細(xì)胞通訊機(jī)制，即細(xì)菌通過合成、分泌 稱為自誘導(dǎo)物(autoinducehAI)的信號分子，當(dāng)AI濃度隨著細(xì)菌不斷生長、群體密度達(dá)到 一定閾值時，啟動特定基因的表達(dá)。革蘭氏陰性細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)由信號分子及其受體 蛋白構(gòu)成。信號分子是一類高絲氨酸內(nèi)酯分子，不同細(xì)菌的信號分子碳鏈長度不同。受體 蛋白屬于LuxR家族蛋白成員相似性較高。當(dāng)細(xì)菌的密度達(dá)到一定程度時，細(xì)菌周圍存在的 信號分子濃度隨之上升。信號分子濃度到達(dá)一定域值，就會與受體蛋白結(jié)合。結(jié)合了信號分子的受體蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，成為轉(zhuǎn)錄激活因子，啟動生物膜的形成和致病因子的釋 放等群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。銅綠假單胞菌、副溶血、哈維氏弧菌等人或動物的致病菌通 過群體感應(yīng)來調(diào)節(jié)它們的群體行為，調(diào)控生物膜的形成、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和致病因子的表達(dá)等。而生物膜的形成可以使致病菌耐受更高濃度的抗生素的作用，抗藥能力可以提高 數(shù)十倍，甚至數(shù)百倍。因此，通過抑制/降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號分子，抑制生物膜的合成，成 為目前抗菌領(lǐng)域的主要研發(fā)方向。通過干擾致病菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)來抑制生物膜的形成及 其他受該系統(tǒng)調(diào)控的生理活動從而達(dá)到抗菌目的被認(rèn)為是一種新型的抗菌策略。更為重要 的是，由于群體感應(yīng)抑制劑并不直接抑制致病菌的生長，致病菌不會對它產(chǎn)生耐藥性。因 此，開發(fā)安全的群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑有著重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了枯草芽孢桿菌的新應(yīng)用——枯草 芽孢桿菌降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號上及作為抗菌劑的用涂。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號，及其抑制細(xì)菌生物 膜形成?？莶菅挎邨U菌可以降降解革蘭氏陰性細(xì)菌的群體感應(yīng)信號，尤其是假單胞菌屬 (Pseudomonas)(如銅綠假單胞菌)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)、弧菌科(Vibrionaceae) (如溶藻弧菌)等的微生物類群。這些革蘭氏陰性類群的致病菌或有害菌均具有相似的群 體感應(yīng)系統(tǒng)，信號分子的受體蛋白為LuxR或TraR，或者為結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制與此兩種受體相 似的蛋白。在降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號的應(yīng)用中，枯草芽孢桿菌存在的適宜濃度為5*102 5*104cfu/ml。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在5*103cfu/ml時即可抑制銅綠假單胞菌生物 膜的形成，在5*104cfu/ml時抑制效果更好；枯草芽孢桿菌在5*102cfu/ml時即可抑制溶藻 弧菌和鰻弧菌生物膜的形成；枯草芽孢桿菌可使群體感應(yīng)受體蛋白TraR濃度降低，從而無 法有效啟動群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)(如生物膜的形成和致病因子的表達(dá))，因而降低了 致病菌的致病活性，并提高了宿主免疫系統(tǒng)和其他抗菌劑的殺菌效果。在這些實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ) 上，研究者可通過現(xiàn)有的臨床實(shí)驗(yàn)手段確定枯草芽孢桿菌的有效治療量。由于枯草芽孢桿菌的這一特性，可以進(jìn)一步將枯草芽孢桿菌作為抗菌劑。應(yīng)用于 抑制假單胞菌屬、土壤桿菌屬、腸桿菌科或弧菌科的微生物類群?？咕鷦┛梢允峭庥盟幐?、 外用液體藥劑、口服藥片、口服液、消毒劑、清潔劑或水質(zhì)改良劑。作為抗菌劑，枯草芽孢桿 菌的濃度為IO5 106cfu/g。發(fā)明發(fā)現(xiàn)，由于枯草芽孢桿菌的特性，枯草芽孢桿菌可作用于 環(huán)境中的菌群，達(dá)到有效的抑制作用，并且不會使這些細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，是一種可以安全使 用并有效作用的殺菌劑。而制成該濃度的抗菌劑，其活性可以得到較好的保留，當(dāng)稀釋進(jìn)入 環(huán)境時，枯草芽孢桿菌充分發(fā)揮其降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號，可以適用于多種場合的消毒，尤 其適用于在水體環(huán)境下通過加入抗菌劑進(jìn)行消毒。由于試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌可降解具群體感應(yīng)細(xì)菌的信號分子，干擾細(xì)菌的群體 感應(yīng)系統(tǒng)，從而使細(xì)菌無法有效啟動群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控其生理生化特性(如 生物膜的形成和致病因子的表達(dá))，因而降低了致病活性，并提高了宿主免疫系統(tǒng)。因此枯 草芽孢桿菌也可以作為抗菌藥物，該藥物包含有效菌含量的枯草芽孢桿菌和藥學(xué)上可接受 的藥物載體。藥學(xué)上可接受的溶劑化物或者水合物的形式來提供的。例如，可把枯草芽孢桿菌從平板或斜面上活化，其發(fā)酵液或稀釋后，再添加到其他載體或物料中。藥物的劑型為 藥劑學(xué)上允許的液體或固體劑型，用枯草芽孢桿菌制備的藥物劑型可為外用藥膏等；用枯 草芽孢桿菌制備的藥物劑型還可為外用液體藥劑。這些藥物可以用于防治具群體感應(yīng)細(xì)菌引起的動物的體內(nèi)、外微生物感染，或者 對養(yǎng)殖水體相關(guān)細(xì)菌的抑制，或者對植物的相關(guān)病原菌的防治。用枯草芽孢桿菌制備的藥 物用于防治細(xì)菌引起的各種健康問題，包括腸道細(xì)菌感染、人和動物的其它細(xì)菌感染、防治 植物的病原菌，還可以調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生態(tài)，促進(jìn)消化和機(jī)體生長，改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境。為了驗(yàn)證本發(fā)明的效果，發(fā)明通過具群體感應(yīng)細(xì)菌的信號降解實(shí)驗(yàn)和弧菌生物膜 實(shí)驗(yàn)等，驗(yàn)證了枯草芽孢桿菌是一株細(xì)菌信號降解菌，可用做一個有效的群體感應(yīng)抑制劑。 通過降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號分子，干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)來抑制生物膜的形成和降解細(xì) 菌信號受體分子的活性，從而達(dá)到抗菌作用。群體感應(yīng)抑制劑可以通過DOCK軟件，運(yùn)用計(jì)算機(jī)虛擬篩選獲得，也可以通過構(gòu)建 指示菌來篩選。已知有些群體感應(yīng)抑制劑可以降解細(xì)菌群體感應(yīng)的信號分子，干擾細(xì)菌的 群體感應(yīng)系統(tǒng)而抑制細(xì)菌生物膜的形成。因此，可以通過檢測細(xì)菌生物膜的形成情況來鑒 定該物質(zhì)是否有群體感應(yīng)抑制劑活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1.本發(fā)明首次應(yīng)用了枯草芽孢桿菌抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的活性，利用它來降解細(xì)菌 群體感應(yīng)信號，抑制細(xì)菌生物膜的生長。2.本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用及抗菌劑，通過干擾病原菌群體感應(yīng)系統(tǒng) 達(dá)到抑制病原菌的效果，是一種新的控制病原菌的策略，而不是現(xiàn)有多數(shù)抗菌劑采用的利 用化合物來直接抗菌滅菌，由此避免了抗菌過程中的耐藥性問題。3.本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，在有效利用其群體感應(yīng)抑制能力和抗菌 效果的同時，不會對環(huán)境造成負(fù)面影響，副作用小。4.本發(fā)明提供的抗菌劑，使用安全，且其生產(chǎn)成本非常低廉，適于推廣使用。5.本發(fā)明將有利于研究具群體感應(yīng)細(xì)菌的生物防控，探討防治具群體感應(yīng)細(xì)菌的 新技術(shù)。6.本發(fā)明有利于從機(jī)制方面解決具群體感應(yīng)細(xì)菌由于大量使用抗生素而產(chǎn)生的 耐藥性問題，發(fā)展非抗菌素類為主的致病菌生態(tài)防控新技術(shù)。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌的篩選、分離和純化2216E平板30度培養(yǎng)2_3天，多次劃線分離和純化，接種斜面，4度保存?zhèn)溆?。?shí)施例2枯草芽孢桿菌降解細(xì)菌信號分子的初篩實(shí)驗(yàn)初篩實(shí)驗(yàn)使用信號分子為OOHL分子，指示菌為WCF47。96孔板初篩1)從平板挑取待測菌，在96孔培養(yǎng)板A中用相應(yīng)液體培養(yǎng)基200 μ 1培養(yǎng)至生長對數(shù)晚期，設(shè)立陰性對照(LB+AHL)和陽性對照(Bt+AHL)。2)向96孔培養(yǎng)板B的每個孔中加入100μ 1匪液體培養(yǎng)基，0. 2 μ 1信號分子 AHL (lmg/ml)，用移液槍從96孔培養(yǎng)板A取待測菌100 μ 1到96孔培養(yǎng)板B對應(yīng)的孔中，混 勻。30°C共培養(yǎng)4hr。3)向96孔培養(yǎng)板C的每個孔中加入130 μ 1匪液體培養(yǎng)基，20 μ 1指示菌WCF47 菌液，1 μ 1 X-Gal。用移液槍從96孔培養(yǎng)板B取共培養(yǎng)物50 μ 1到96孔培養(yǎng)板C對應(yīng)的 孔中，混勻。4)30°C過夜培養(yǎng)。在16hr左右可以觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果信號分子被降解后，指示菌落呈白色，否則呈藍(lán)色。根據(jù)顏色反應(yīng)，初步 篩出具有降解信號分子AHL的枯草芽孢桿菌微生物菌株。實(shí)施例3枯草芽孢桿菌降解細(xì)菌信號分子的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)瓊脂條復(fù)篩將涂有X-gal的MM培養(yǎng)基平板切成條狀，在細(xì)條一測加入待測菌與AHLs抽提物 的混合物，在另一測依次加指示菌WCF47，30°C培養(yǎng)18h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。LB或ddH20和AHL 的混合物作為陰性對照，以AiiA活性菌B. thuringiensis培養(yǎng)物與AHL的混合物為陽性對 照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)顏色反應(yīng)，陰性對照呈藍(lán)色，陽性對照和枯草芽孢桿菌呈白色，表 明枯草芽孢桿菌具有降解AHLs信號分子的活性。實(shí)施例4枯草芽孢桿菌的生化鑒定實(shí)驗(yàn)根據(jù)伯杰氏手冊進(jìn)行菌株生理生化特征鑒定。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌在普通培 養(yǎng)基上近園形，不透明，表面干燥，周圍有皺峽，邊緣不齊，顯微鏡下革蘭氏染色陽性，菌體 桿狀。還具有以下生化特性甘露醇產(chǎn)酸+，明膠水解+，卵磷脂酶_，阿拉伯糖產(chǎn)酸+，葡 萄糖產(chǎn)氣_，酪氨酸水解_，形成吲哚_，V. P試驗(yàn)+，苯丙氨酸脫氨_，V. ρ培養(yǎng)終pH值5. 8， 葡萄糖產(chǎn)酸+，丙酸鹽利用_，淀粉水解+，木糖產(chǎn)酸_，檸檬酸鹽利用+，接觸酶+，硝酸鹽還 原 +，酪阮水解 +，NaCUKCl 需要 +，10 % NaCl 生長 +，7 % NaCl 生長 +，5 % NaCl 生長 +，2 % NaCl生長+(注“ + ”代表陽性，“_”代表陰性)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)菌落特點(diǎn)、染色特征和生化指標(biāo)特性，初步確定菌株Zou 03為枯 草芽孢桿菌。實(shí)施例5枯草芽孢桿菌16S rRNA的分子鑒定實(shí)驗(yàn)以細(xì)菌總DNA為模板，以Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增菌株Zou 03的16SrDNA序 列，引物為 27f :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1492r :5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，， PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min ；94°C lmin、45°C lmin、72°C lmin,30 個循環(huán)；72°C延長延 伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收柱純化后與pMD_18T載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 D感受態(tài)細(xì) 胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測序。將測得的16S rDNA序列與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast序 列相似性分析，選取同源性較高細(xì)菌的16S rDNA序列采用Clustalx 1.8進(jìn)行序列比對，運(yùn)用Phylip3. 65進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析，Neighbor joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Boostrap 1000次重復(fù)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，細(xì)菌Zou 03的16S rDNA序列長度約 1.45kb左右，接近于全長，與預(yù)期大小一致。通過NCBI BLAST分析，序列同源比對結(jié)果 顯示細(xì)菌 Zou 03 的 16SrDNA 序列與 Bacillus subtilis 16S rDNA(GQ861468. 1)的序 列片段有99%的同源性，初步確定Y5為一株新的芽孢桿菌。選取同源性在95%以上 的12株細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可知細(xì)菌Zou 03與已報(bào)道的地衣芽孢桿菌亞型Bacillus licheniformis (GenBank accession no. AB361368)的親源關(guān)系較近。綜合傳統(tǒng)的細(xì)菌形態(tài)、生理生化特征，結(jié)合細(xì)菌的16S rDNA序列同源性分析和構(gòu) 建細(xì)菌體統(tǒng)進(jìn)化樹，可以確定菌株Zou 03為枯草芽孢桿菌。實(shí)施例6枯草芽孢桿菌抑制溶藻弧菌和鰻弧菌生物膜形成的實(shí)驗(yàn)在2ml塑料離心管中分別加入975 μ 1過夜培養(yǎng)的溶藻弧菌和鰻弧菌菌液，25 μ 1 40%的甘油，lyl(105cfU/g)的枯草芽孢桿菌。以不加枯草芽孢桿菌的處理作為陰性對照。 37°C靜置培養(yǎng)3天。小心傾去離心管中的液體，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數(shù)次，確保 沖洗掉離心管內(nèi)游離的細(xì)菌。等離心管內(nèi)壁的水珠蒸發(fā)后，加入Iml 0.5%的結(jié)晶紫溶液， 室溫靜置30分鐘。將結(jié)晶紫倒掉，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數(shù)次，確保沒有吸附在 生物膜上的結(jié)晶紫被沖掉。待離心管內(nèi)壁水珠蒸發(fā)后，加入Iml 95%乙醇，室溫靜置15分 鐘。最后將離心管內(nèi)乙醇倒入比色皿內(nèi)，在分光光度計(jì)中以570nm波長測OD值。OD值越 低，說明溶藻弧菌和鰻弧菌形成的生物膜越少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌在該濃度(5*102cfu/ml)下可抑制溶藻弧菌和鰻弧 菌生物膜的形成。但不直接抑制溶藻弧菌和鰻弧菌的生長，表明抑制作用可能是通過抑制 細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到的。實(shí)施例7枯草芽孢桿菌抑制銅綠假單胞菌生物膜的實(shí)驗(yàn)在2ml塑料離心管中加入975 μ 1過夜培養(yǎng)的綠膿桿菌菌液，25 μ 1 40%的甘油， μ 107cfu/g的枯草芽孢桿菌。以不加枯草芽孢桿菌的處理作為陰性對照。37°C靜置培 養(yǎng)3天。小心傾去離心管中的液體，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數(shù)次，確保沖洗掉離心 管內(nèi)游離的細(xì)菌。等離心管內(nèi)壁的水珠蒸發(fā)后，加入Iml 0.5%的結(jié)晶紫溶液，室溫靜置30 分鐘。將結(jié)晶紫倒掉，用滅菌的蒸餾水輕輕沖洗離心管數(shù)次，確保沒有吸附在生物膜上的結(jié) 晶紫被沖掉。待離心管內(nèi)壁水珠蒸發(fā)后，加入Iml 95%乙醇，室溫靜置15分鐘。最后將離 心管內(nèi)乙醇倒入比色皿內(nèi)，在分光光度計(jì)中以570nm波長測OD值。OD值越低，說明銅綠假 單胞菌形成的生物膜越少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌在該濃度(5*104cfu/ml)下可抑制銅綠假單胞菌生 物膜的形成，但不直接抑制銅綠假單胞菌的生長，表明枯草芽孢桿菌可能干擾了細(xì)菌的群 體感應(yīng)系統(tǒng)而抑制生物膜的形成。實(shí)施例8枯草芽孢桿菌降解群體感應(yīng)受體蛋白TraR的實(shí)驗(yàn)TraR蛋白是根農(nóng)桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子的受體蛋白，與綠膿桿菌的LasR蛋性位點(diǎn)區(qū)域的同源性高達(dá)70%，因此，對TraR蛋白起作用的 抑制劑往往也會對LasR蛋白有抑制作用。LuxR蛋白在群體感應(yīng)抑制劑如鹵化呋喃酮的作 用下，變得極不穩(wěn)定，會在短時間(約30分鐘)內(nèi)被細(xì)菌自身的蛋白酶迅速水解掉，導(dǎo)致 LuxR蛋白的濃度下降。因此，通過檢測LuxR蛋白與抑制劑作用后的濃度是否下降，可知抑 制劑是否有抑制活性，以及抑制活性的高低。用PCR的方法獲得TraR蛋白的基因trar。將該基因片斷用雙酶切的方法插入表 達(dá)載體PET-17b中構(gòu)建pETtrar質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒用鈣轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，最 后獲得高效表達(dá)TraR蛋白的工程菌。該工程菌用IPTG誘導(dǎo)4個小時后，離心收集菌體，再 用無菌水重懸細(xì)菌，加入枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的粗提抗菌液，37°C培養(yǎng)35分鐘。最后用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測菌體TraR蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌在35分鐘內(nèi)即可明顯降低群體感應(yīng)受體蛋白TraR 的濃度。TraR濃度降低后，將無法有效啟動群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)(如生物膜的形成和 致病因子的表達(dá))，因而降低了致病活性。該實(shí)驗(yàn)從分子水平證明了枯草芽孢桿菌是一個有 效潛在的群體感應(yīng)抑制劑。實(shí)施例9以枯草芽孢桿菌為有效成分制備的外用藥膏參照藥劑學(xué)手冊，將適量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液加入適量液體石蠟或黃凡士林，制 成外用藥膏。實(shí)施例10以枯草芽孢桿菌為有效成分制備的外用液體藥劑參照藥劑學(xué)手冊，將適量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液加水溶解，制成外用液體藥劑。實(shí)施例11以枯草芽孢桿菌為有效成分制備的口服藥片參照藥劑學(xué)手冊，將適量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液加入適量潤滑劑制成軟材，用10目 篩制粒，干燥，干粒加入硬脂酸鎂，混勻，壓片機(jī)壓片成片劑，薄膜包衣，分裝，即得包衣片 劑。實(shí)施例12以枯草芽孢桿菌為有效成分制備的口服液參照藥劑學(xué)手冊，將適量枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液加水溶解，加入矯味劑，加水調(diào)節(jié)容 量，制成口服液。
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權(quán)利要求
枯草芽孢桿菌在降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號上的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)菌。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的細(xì)菌為假單胞菌屬、土壤桿菌屬、腸桿 菌科或弧菌科的微生物類群。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用濃度為 5*102-5*104cfu/ml。
5.枯草芽孢桿菌作為抗菌劑的用途。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的用途是應(yīng)用于假單胞菌屬、土壤桿菌 屬、腸桿菌科或弧菌科的微生物類群。
7.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的抗菌劑是外用藥膏、外用液體藥劑、口 服藥片、口服液、消毒劑、清潔劑或水質(zhì)改良劑。
8.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌的濃度為IO5 IO6Cfu/
全文摘要
本發(fā)明屬于衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域，涉及枯草芽孢桿菌降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號及作為抗菌劑的用途。發(fā)明枯草芽孢桿菌降解革蘭氏陰性細(xì)菌的群體感應(yīng)信號，及其細(xì)菌生物膜形成。在降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號的應(yīng)用中，枯草芽孢桿菌的適宜濃度為5*102～5*104cfu/ml。進(jìn)一步將枯草芽孢桿菌作為抗菌劑。應(yīng)用于抑制假單胞菌屬、土壤桿菌屬、腸桿菌科或弧菌科的細(xì)菌?？咕鷦┛梢允峭庥盟幐?、外用液體藥劑、口服藥片、口服液、消毒劑、清潔劑或水質(zhì)改良劑。作為抗菌劑，枯草芽孢桿菌的濃度為105～106cfu/g。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用及抗菌劑，利用了微生物群體感應(yīng)抑制來抑制致病菌的生物膜生成及細(xì)菌的生長，而不是現(xiàn)有多數(shù)抗菌劑采用的利用化合物來抗菌滅菌，由此避免了抗菌過程中的耐藥性問題。
文檔編號C11D3/48GK101926829SQ20101025040
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者丁賢, 周世寧, 殷波, 江世貴 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所