一種暗紋東方鲀?nèi)后w—家系—分子綜合遺傳育種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖品種良種選育的方法，具體來說是一種暗紋東方飩?cè)后w一家系一分子綜合遺傳育種的方式。
技術(shù)背景
[0002]暗紋東方純屬純形目{Tetraodontiformes),純亞科(7?traodontoidei),純科(Tetraodontidae),東方飩屬(Jakifugii)。目前,全國已有上海、江蘇、浙江、安徽、廣東、福建、四川、河南、湖北、海南等省市開展了淡水暗紋東方飩的養(yǎng)殖，暗紋東方飩?cè)諠u成為一種養(yǎng)殖名優(yōu)品種，是一種經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價(jià)值都比較高的水產(chǎn)品之一。但一般的養(yǎng)殖品種隨著養(yǎng)殖的不斷進(jìn)行都不可避免的出現(xiàn)種質(zhì)資源退化、近交衰退等現(xiàn)象，故要想從根本上提高水產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量，必須培育出優(yōu)良的新品種。目前，水產(chǎn)動(dòng)物中常用的選育方法主要有群體選育、家系選育、分子標(biāo)記輔助育種等。
[0003]群體選育是生產(chǎn)單位進(jìn)行選育常用的方法，具有快速分離出較為理想個(gè)體的優(yōu)點(diǎn)，但該方法選育出的個(gè)體可能是雜合體，長期采用此法可能會(huì)帶來種質(zhì)資源分化、遺傳純度降低等問題且大規(guī)模的群體選育會(huì)消耗大量的人力物力。家系選育是當(dāng)今水產(chǎn)育種中培育新品種的重要方法之一，該法具有遺傳背景清晰、系譜明了、選育后代純合度高、選育效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。然而家系選育是選擇一對親本自交產(chǎn)生后代，基因庫會(huì)不斷地減小，且家系養(yǎng)殖群體內(nèi)規(guī)模不夠大時(shí)，優(yōu)良性狀基因不能得到充分的表達(dá)，影響選育效果。分子標(biāo)記輔助育種具有以下優(yōu)點(diǎn):可同時(shí)以多個(gè)基因?yàn)槟繕?biāo)進(jìn)行材料的篩選，將多個(gè)基因聚合到同一個(gè)育種材料中，使其品質(zhì)得到改良；可提前對目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選；可反映DNA水平上的遺傳變異，因此，能夠在生長的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行選擇，不會(huì)受到環(huán)境的影響，大大提高了目的基因選擇的效率和準(zhǔn)確性，拓寬了育種的方法和途徑，然而分子標(biāo)記的開發(fā)工作較為繁瑣，工作量較大，且很多基因的功能尚未明確，對選育有一定的阻礙。
[0004]中洋集團(tuán)是世界上最大的河豚魚養(yǎng)殖基地，規(guī)模化養(yǎng)殖條件優(yōu)勢突出，擁有足夠數(shù)量的育種群體和生產(chǎn)單元，本發(fā)明利用群體選育快速篩選出具有優(yōu)良性狀的親本，再利用家系選育保留優(yōu)良性狀，純化優(yōu)良基因，保證子代遺傳背景清晰且高的純合度。同時(shí)，在育種過程中配合分子育種的方法挑選遺傳距離較遠(yuǎn)的親本，從而解決了近交衰退的問題。由此依據(jù)此綜合遺傳育種的方法能高效培育出性狀優(yōu)良、遺傳背景清晰、基因庫較大、遺傳穩(wěn)定的群體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)目的:經(jīng)過歷代養(yǎng)殖與選育發(fā)現(xiàn)，最初的暗紋東方飩體呈棕褐色，養(yǎng)殖過程中暗紋東方飩現(xiàn)已出現(xiàn)兩種性狀優(yōu)良、抗病力強(qiáng)的群體，其中一類為保留引種群體體色和花紋的個(gè)體稱為野生型個(gè)體，另一類體色加深、花紋特征不明顯但生長速度較快的稱之為黑色個(gè)體，本發(fā)明中進(jìn)一步將這兩種優(yōu)良性狀的群體作為基礎(chǔ)群體進(jìn)行家系遺傳選育，由此，我們開發(fā)了一種新的育種方法，首先以分子標(biāo)記為指導(dǎo)構(gòu)建家系，每個(gè)家系親本所產(chǎn)后代單獨(dú)養(yǎng)殖在大水體中，將每個(gè)大水體看作一個(gè)生產(chǎn)單元繼續(xù)進(jìn)行家系內(nèi)的群體選育，結(jié)合暗紋東方飩的生產(chǎn)一從魚苗到成熟一共進(jìn)行6次篩選，該育種方法采用家系育種的理念，融合了分子標(biāo)記技術(shù)和群體選育技術(shù)，充分發(fā)揮環(huán)境對基因的影響，克服了家系選育中因家系個(gè)體少而不具代表性的弊病，使得基因充分表達(dá)，達(dá)到生產(chǎn)與科研相結(jié)合的目的。
[0006]技術(shù)內(nèi)容:本發(fā)明所揭示的一種暗紋東方飩?cè)后w一家系一分子綜合遺傳育種的方法，其具體步驟為:
a.基礎(chǔ)親魚選擇
從群體中挑選體格健壯、色澤好、性腺發(fā)育良好的暗紋東方飩作為繁殖的親魚進(jìn)行連續(xù)四代群體選育，在群體選育后出現(xiàn)兩種性狀分離明顯的群體，分別是野生暗紋東方飩及黑色暗紋東方飩；
b.建立家系
以野生暗紋東方飩和黑色暗紋東方飩作為基礎(chǔ)選育群體，利用分子標(biāo)記技術(shù)對親本DNA進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)分析并計(jì)算出親本個(gè)體之間的相似度和遺傳距離等遺傳參數(shù)，并根據(jù)個(gè)體間的遺傳距離指導(dǎo)親本I對I的配組繁殖，結(jié)合遺傳距離以及形態(tài)特征構(gòu)建了 80個(gè)家系，其中分為20個(gè)黑色自交家系，40個(gè)黑色與野生正反交配對家系及20個(gè)野生型自交家系;
c.以生產(chǎn)單元為基礎(chǔ)的群體選育
將每個(gè)家系作為一個(gè)生產(chǎn)單元，從魚苗到親魚分別在孵化后、50日齡、210日齡、370日齡、530日齡和690日齡進(jìn)行篩選，最終選擇出存活率高，體格健壯、無外傷、色澤好、條紋清晰、活力強(qiáng)、性腺發(fā)育良好及生長速度快的家系作為配種親本，在整個(gè)選育的過程中，為了減少環(huán)境條件的差異，確保每個(gè)家系在各階段的養(yǎng)殖空間的大小、水溫、鹽度、光照、溶氧和餌料條件保持一致，同時(shí)在不同的養(yǎng)殖階段，保證各家系的養(yǎng)殖數(shù)量一致；
d.第二代家系選育親魚配種
通過Populat1ns軟件對步驟c中選育出的配種親本進(jìn)行計(jì)算,得到雌雄個(gè)體間的遺傳距離矩陣，根據(jù)雌雄個(gè)體間的遺傳距離和形態(tài)特征指導(dǎo)上述親本進(jìn)行I對I配對繁殖，選取遺傳距離排名前80的雌雄個(gè)體作為待配對的親本，建立第二代選育家系80個(gè)；取遺傳距離較小的雌雄個(gè)體建立對照家系20個(gè)，人工催產(chǎn)授精，受精后每個(gè)家系的受精卵分別放入不同的孵化桶中分別進(jìn)行孵化，孵化水溫20-24 °C，溶氧6 mg/L以上，鹽度小于1%。，孵化時(shí)間4-5天，得到第二代家系選育的魚苗；
e.對80組第二代選育家系和20組第二代對照組家系重復(fù)步驟b~d的選育步驟，得到第三代魚，開展新一輪的家系選育。
[0007]所述步驟c中六次篩選的具體步驟分別為:
第一次篩選:80個(gè)家系的魚苗孵化后統(tǒng)計(jì)各家系魚苗的孵化率和成活率，在產(chǎn)卵量為12-18萬粒卵的個(gè)體中選擇孵化率在90%以上的家系中選擇68個(gè)作為要保留的家系,在每個(gè)家系中選擇10萬尾孵化仔魚轉(zhuǎn)移至溫室苗種培育池進(jìn)行強(qiáng)化培育；
第二次篩選:待魚苗培育至3-4 cm后，挑選成活率高、活力強(qiáng)、趨光性好的家系轉(zhuǎn)移至野化馴養(yǎng)池中，觀察統(tǒng)計(jì)各家系魚苗生長、抗病、攝食的情況，其中選擇的家系數(shù)量為50個(gè)，每個(gè)家系保留5萬尾；
第三次篩選:同年放置的魚苗養(yǎng)至10月底時(shí)要再一次轉(zhuǎn)移至溫室越冬，轉(zhuǎn)移時(shí)選擇標(biāo)準(zhǔn)為活力強(qiáng)，生長速度快，選擇生長和抗逆性排在前40的家系繼續(xù)單獨(dú)養(yǎng)殖，每個(gè)家系保留I萬尾，在溫室養(yǎng)殖時(shí)不斷對養(yǎng)殖條件進(jìn)行優(yōu)化，采用海水養(yǎng)殖并逐漸增加鹽度模擬河豚魚天然海水養(yǎng)殖環(huán)境，保證各家系的養(yǎng)殖環(huán)境一致；
第四次篩選:越冬結(jié)束后還需將魚轉(zhuǎn)移至野外露天池中育肥，在轉(zhuǎn)池的過程中進(jìn)行第四次篩選，選擇目標(biāo)有三:一是生長速度，即選擇魚群中生長最快的個(gè)體；二是形態(tài)特征，凡是形態(tài)特征不明顯的個(gè)體均予以淘汰，三是遺傳純度，選留排名靠前30的家系繼續(xù)單獨(dú)養(yǎng)殖，每個(gè)家系保留5000尾轉(zhuǎn)至野外露天池單獨(dú)養(yǎng)殖；
第五次篩選:此時(shí)暗紋東方飩已基本達(dá)到商品魚的規(guī)格，統(tǒng)計(jì)商品魚的體重、體長、花紋、均勻度的生物學(xué)和商品指標(biāo)，按照體重和花紋指標(biāo)選擇20個(gè)家系，每個(gè)家系保留500尾魚單獨(dú)養(yǎng)殖并使其接近性成熟；
第六次篩選:親魚成熟前，要對其進(jìn)行強(qiáng)化培育，將第五次篩選后的魚轉(zhuǎn)移至親魚培育池，轉(zhuǎn)移時(shí)選留體格健壯、無外傷、色澤好、條紋清晰、活力強(qiáng)、性腺發(fā)育良好的家系10個(gè)，每個(gè)家系保留備用親本50尾，統(tǒng)計(jì)備用親本的表型性狀和遺傳學(xué)特性。
[0008]所述第六次篩選中，表型性狀包括體重、全長、體長、體寬、體厚的指標(biāo)，遺傳學(xué)特性包括個(gè)體的遺傳距離、遺傳相似度、育種值。
[0009]有益效果:本發(fā)明所述的暗紋東方飩?cè)后w一家系一分子綜合遺傳育種的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明采用了群體一家系一分子的育種模式，首先利用群體選育擴(kuò)大育種親本的基因庫，使后面家系選育的候選基因更多更全，然后結(jié)合分子標(biāo)記進(jìn)行家系育種，既提高了遺傳純度，又確保了遺傳多樣性，改善了家系選育中近親交配基因庫快速縮小的弊病。
[0010]2.本發(fā)明采用大水體養(yǎng)殖選育，在生產(chǎn)養(yǎng)殖的環(huán)境條件下直接進(jìn)行選育，這樣選育的結(jié)果更具有代表性，更能發(fā)揮環(huán)境基因?qū)︳~類生長的影響，使選育的基因充分表達(dá)，與此同時(shí)還達(dá)到科研和生產(chǎn)相結(jié)合的目的，在進(jìn)行選育工作的同時(shí)還可以對生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化從而取到雙贏的效果。
[0011]3.采用分子標(biāo)記技術(shù)指導(dǎo)親本配對，計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離、近交系數(shù)