一種抗非特異性的捕獲磁珠及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗非特異性的捕獲磁珠及其制備方法和應(yīng)用，納米磁珠表面共價(jià)修飾有數(shù)均分子量為5萬～200萬的親水性高分子，高分子的末端修飾有光交聯(lián)劑。本發(fā)明的捕獲磁珠，是將目標(biāo)分子（小分子，DNA，RNA，抗體蛋白等）通過光交聯(lián)共價(jià)連接在高分子聚合物磁珠載體上，與常規(guī)的捕獲磁珠相比，其抗非特異性能力有大幅提高，大大提高了藥物靶標(biāo)的捕獲成功率。本發(fā)明磁珠，不僅可以與單一藥物分子共價(jià)偶聯(lián)，同時(shí)可以與混合物共價(jià)偶聯(lián)，大大簡(jiǎn)化了藥物分子結(jié)合操作，提高了藥物分子的結(jié)合率。
【專利說明】
一種抗非特異性的捕獲磁珠及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種捕獲磁珠及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種抗非特異性的捕獲 磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物在人體內(nèi)的主要作用是通過與藥物靶標(biāo)結(jié)合，干擾不正常的生理化學(xué)過程， 進(jìn)而達(dá)到治愈某種疾病的效果。目前，已經(jīng)報(bào)道的藥物靶標(biāo)主要集中在受體，酶，離子通道， 核酸等，其中以受體為靶點(diǎn)的占到50%，仍然有20%祀標(biāo)亟待進(jìn)一步的確認(rèn)。不論是藥物小分 子，還是抗體大分子，我們當(dāng)前的研究大部分都集中在信號(hào)通路，表觀遺傳，代謝途徑，藥效 評(píng)價(jià)上，而忽略了藥物分子直接作用的蛋白質(zhì)靶標(biāo)捕獲與鑒定。一部分原因是因?yàn)槲覀兊?藥物來源，種類眾多，物理化學(xué)性質(zhì)差異大，難以用一種通一的方法或平臺(tái)來研究，另一部 分原因是當(dāng)前的靶標(biāo)捕獲和確認(rèn)技術(shù)還不夠成熟，大部分都處于研發(fā)階段或?qū)嶒?yàn)室成果， 離真正的應(yīng)用還有一段距離。因此，開發(fā)一種廣譜性的捕獲技術(shù)對(duì)于藥物開發(fā)與利用有著 現(xiàn)實(shí)的迫切需求。
[0003] 近十年來，藥物研發(fā)進(jìn)入了高速發(fā)展的黃金期，相關(guān)靶標(biāo)蛋白捕獲技術(shù)的研究已 經(jīng)相當(dāng)廣泛，各種技術(shù)不斷涌現(xiàn)，基本上都是通過前期的分離與富集后，再與質(zhì)譜聯(lián)用，進(jìn) 而確認(rèn)靶標(biāo)蛋白的。如親和色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，凝膠電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分子探針與質(zhì) 譜聯(lián)用技術(shù)，及最近的磁珠與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。其中，磁珠與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)最受歡迎，主要 原因是:一、磁珠有著極大的表面積，吸附量比一般富集方法大，這對(duì)于捕獲細(xì)胞內(nèi)微量蛋 白有極大幫助;二、磁珠與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)路線簡(jiǎn)單，實(shí)用，較其他方法成本更低，速度快， 還可以方便地與凝膠電泳等技術(shù)聯(lián)勝，進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性。但這種技術(shù)有一個(gè)最大的難 題，就是當(dāng)磁珠小到納米級(jí)別時(shí)，非特異吸附很大，嚴(yán)重干擾了正常的實(shí)驗(yàn)分析，所以通常 需要凝膠電流技術(shù)進(jìn)一步分離，加大了實(shí)驗(yàn)難度與復(fù)雜程度，由此可見，對(duì)于磁珠非特異性 結(jié)合的問題還有很大改進(jìn)空間。
[0004]最近，國內(nèi)的成都先導(dǎo)藥物開發(fā)有限公司發(fā)明了一種藥物靶標(biāo)捕獲方法，將DNA或 RNA與特異親和材料共價(jià)聯(lián)接，在細(xì)胞內(nèi)捕獲靶標(biāo)蛋白再用蛋白質(zhì)組學(xué)方法逐一確認(rèn)靶標(biāo) 蛋白。這個(gè)方法雖然較體內(nèi)方法更真實(shí)，但操作復(fù)雜，過程繁瑣，檢測(cè)靈敏度不高，且目前限 于DNA，RNA等少數(shù)分子，對(duì)小分子，抗體藥物等無法使用，與種類繁多的藥物靶標(biāo)捕獲需求 還有差距。另一個(gè)有代表性的工作是，福建省農(nóng)業(yè)技術(shù)科學(xué)院在2011年介紹了一種利用蛋 白磁珠的免疫共沉淀富集轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)基因的方法，其基本原理是在PULL DOWN技術(shù)上引 入磁珠而改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方法，更加高效地找到與轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合的靶標(biāo)基因。 此類方法在蛋白-RNA，蛋白-蛋白相互作用方面表現(xiàn)良好，也可以用于大分子藥物靶標(biāo)捕 獲，但無法解決小分子藥物蛋白靶標(biāo)捕獲的問題。
[0005]總之，以上兩種方法都能解決一類或一部分藥物靶標(biāo)捕獲的問題，但不能在交叉 使用與驗(yàn)證及抗非特異性能上還有很大提升空間，因此我們亟待開發(fā)一種技術(shù)，既可以用 于小分子藥物的靶標(biāo)捕獲，也可以用于大分子藥物的靶標(biāo)捕獲固定小分子或蛋白樣品，又 具有良好抗非特異性用于血清，裂解液等各類復(fù)雜樣品的靶標(biāo)蛋白確認(rèn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗非特異性的捕獲磁珠。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種抗非特異性的捕獲磁珠的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種利用上述抗非特異性的捕獲磁珠實(shí)現(xiàn)藥物靶 標(biāo)捕獲的方法。
[0009] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種抗非特異性捕獲磁珠，包括納米磁珠，納米磁珠表面共價(jià)修飾有數(shù)均分子量為5萬 ~200萬的親水性高分子，高分子的末端修飾有光交聯(lián)劑。
[0010] 磁珠的直徑為10 nm~135μηι。
[0011] 親水性高分子選自聚乙二醇、聚酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖。
[0012] 光交聯(lián)劑選自苯基疊氮基類、二苯甲酮基類、三氟甲基苯基雙吖丙啶類、疊氮戊酸 類光交聯(lián)劑。
[0013] -種抗非特異性捕獲磁珠的制備方法，包括如下步驟： 1) 選取表面修飾有錨定基團(tuán)的磁珠，活化后與數(shù)均分子量為5萬~200萬的親水性高分 子反應(yīng)，在磁珠上偶聯(lián)高分子； 2) 繼續(xù)活性磁珠上偶聯(lián)的高分子，之后通過化學(xué)交聯(lián)在高分子末端引入光交聯(lián)劑。
[0014] 錨定基團(tuán)選自羧基、胺基、巰基、鹵代烷烴，炔基、烯基。
[0015] 光交聯(lián)劑選自苯基疊氮基類、二苯甲酮基類、三氟甲基苯基雙吖丙啶類、疊氮戊酸 類光交聯(lián)劑。
[0016] 特別的，磁珠表面修飾有羧基，采用EDC/NHS活化，對(duì)應(yīng)的親水性高分子具有胺基。
[0017] 應(yīng)用抗非特異性捕獲磁珠捕獲藥物靶標(biāo)的方法，包括如下步驟： 1) 將上述抗非特異性捕獲磁珠與藥物分子混合，引發(fā)光交聯(lián)，使藥物分子共價(jià)固定在 抗非特異性捕獲磁珠上，得到藥物靶標(biāo)捕獲磁珠； 2) 將藥物靶標(biāo)捕獲磁珠與待測(cè)液混合，充分反應(yīng)后分離磁珠； 3) 將磁珠上吸附的物質(zhì)洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行檢測(cè)，確定藥物靶標(biāo)。
[0018] 優(yōu)選的，捕獲磁珠與藥物分子混合時(shí)使用的溶劑為DMS0、水、甲醇、乙醇、石油醚、 苯、氯苯、氯仿、丙酮、THF、DMF、二氧六環(huán)中的至少一種。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的捕獲磁珠，是將目標(biāo)分子(小分子，DNA，RNA，抗體蛋白等)通過光交聯(lián)共價(jià)連 接在在高分子聚合物磁珠載體上，與常規(guī)的捕獲磁珠相比，其抗非特異性能力有大幅提高， 大大提高了藥物靶標(biāo)的捕獲成功率。本發(fā)明磁珠，不僅可以與單一藥物分子共價(jià)偶聯(lián)，同時(shí) 可以與混合物共價(jià)偶聯(lián)，大大簡(jiǎn)化了藥物分子結(jié)合操作，提高了藥物分子的結(jié)合率。
[0020] 本發(fā)明捕獲磁珠的制備方法操作簡(jiǎn)單，廣譜性好，能固定的各種藥物分子用于靶 標(biāo)捕獲。不僅適用于高含量（1 mg/mL)蛋白的捕獲，也適用于低含量（10 yg/mL)蛋白的捕 獲，使用極為靈活。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明方法的操作流程； 圖2是小分子藥物雷帕霉素光交聯(lián)磁珠用于不同濃度靶標(biāo)蛋白捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] -種抗非特異性捕獲磁珠，包括納米磁珠，納米磁珠表面共價(jià)修飾有數(shù)均分子量 為5萬~200萬的親水性高分子，高分子的末端修飾有光交聯(lián)劑。
[0023] 優(yōu)選的，親水性高分子的數(shù)均分子量20萬~150萬，更佳為20萬~120萬、40萬~ 100萬，40萬~80萬、40萬~60萬。分子量在40~80萬之間的親水性高分子，可以顯著提高磁 珠的抗非特異性。
[0024] 磁珠的直徑為10 nm~135μηι。
[0025] 親水性高分子選自聚乙二醇、聚酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖。葡聚糖，殼聚糖反 應(yīng)位點(diǎn)眾多，是更佳的選擇。
[0026] 光交聯(lián)劑選自苯基疊氮基類、二苯甲酮基類、三氟甲基苯基雙吖丙啶類、疊氮戊酸 類光交聯(lián)劑。疊氮類光交聯(lián)劑更易于被紫外線激發(fā)產(chǎn)生自由基，更易于藥物分子反應(yīng)，是更 佳的選擇。
[0027] -種抗非特異性捕獲磁珠的制備方法，包括如下步驟： 1) 選取表面修飾有錨定基團(tuán)的磁珠，活化后與數(shù)均分子量為5萬~200萬的親水性高分 子反應(yīng)，在磁珠上偶聯(lián)高分子； 2) 繼續(xù)活性磁珠上偶聯(lián)的高分子，之后通過化學(xué)交聯(lián)在高分子末端引入光交聯(lián)劑。
[0028] 錨定基團(tuán)選自羧基、胺基、巰基、鹵代烷烴，炔基、烯基。
[0029] 光交聯(lián)劑選自苯基疊氮基類、二苯甲酮基類、三氟甲基苯基雙吖丙啶類、疊氮戊酸 類光交聯(lián)劑。光交聯(lián)劑可以通過但不限于胺基偶聯(lián)、取代反應(yīng)、脂化反應(yīng)，點(diǎn)擊化學(xué)等化學(xué) 反應(yīng)共價(jià)在磁珠表面的高分子上。
[0030] 特別的，磁珠表面修飾有羧基，采用H3C/NHS活化，對(duì)應(yīng)的親水性高分子具有胺基。 [0031 ]親水性高分子選自聚乙二醇、聚酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖。葡聚糖，殼聚糖反 應(yīng)位點(diǎn)眾多，是更佳的選擇。
[0032]應(yīng)用抗非特異性捕獲磁珠捕獲藥物靶標(biāo)的方法，包括如下步驟： 1) 將上述抗非特異性捕獲磁珠與藥物分子混合，引發(fā)光交聯(lián)，使藥物分子共價(jià)固定在 抗非特異性捕獲磁珠上，得到藥物靶標(biāo)捕獲磁珠； 2) 將藥物靶標(biāo)捕獲磁珠與待測(cè)液混合，充分反應(yīng)后分離磁珠； 3) 將磁珠上吸附的物質(zhì)洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行檢測(cè)，確定藥物靶標(biāo)。
[0033]操作流程如圖1所示。
[0034]優(yōu)選的，捕獲磁珠與藥物分子混合時(shí)使用的溶劑為DMS0、水、甲醇、乙醇、石油醚、 苯、氯苯、氯仿、丙酮、THF、DMF、二氧六環(huán)中的至少一種，溶劑優(yōu)選為DMS0。溶劑的作用在于 使藥物分子可以和磁珠更為均勻地結(jié)合在一起，利于光交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。
[0035]本發(fā)明的抗非特異性捕獲磁珠末端修飾有光交聯(lián)劑，光激活后，會(huì)產(chǎn)生卡賓自由 基，卡賓自由基通過插入反應(yīng)與藥物分子的C-H、〇-H、N-H等活性基團(tuán)隨機(jī)反應(yīng)。由于反應(yīng)位 點(diǎn)眾多，會(huì)有足夠的藥物分子共價(jià)接合到磁珠的高分子上，同時(shí)有相當(dāng)量藥物分子的活性 基團(tuán)得以保留，可以很好地與蛋白進(jìn)行反應(yīng)。因此， 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0036] 方便比較起見，以下實(shí)施例中使用的磁珠，其直徑均為65μπι，但是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù) 人員的一般認(rèn)識(shí)，本發(fā)明中所使用的磁珠可以是各種直徑的磁珠，特別是抗特異性差的直 徑為10 nm~135μηι的磁珠，Ιμπι~100μπι的磁珠。未經(jīng)改性處理的磁珠在使用公知方法進(jìn)行 改性后，可以用于本發(fā)明。當(dāng)然，磁珠也可以是市售的表面修飾有羧基、胺基、巰基、鹵代烷 烴，炔基、烯基等錨定基團(tuán)。
[0037] 實(shí)施例1:簡(jiǎn)單未修飾高分子的光交聯(lián)磁珠制備 1) 將lml 65μπι羧基磁珠超聲分散，3000 rpm離心后，吸出上清液，重復(fù)一次 2) 用EDC/NHS活化表面后，避光下加入ImM氨基疊氮戊酸類光交聯(lián)劑的DMF溶液lmL，室 溫孵育4小時(shí)，3000 rpm離心，吸出上清液，低溫干燥，制得簡(jiǎn)單未修飾高分子的光交聯(lián)磁 珠。
[0038]實(shí)施例2:葡聚糖光交聯(lián)磁珠制備 1) 將lml 65μπι環(huán)氧磁珠超聲分散，3000 rpm離心后，吸出上清液，重復(fù)一次 2) 加入配制好的1%葡聚糖(數(shù)均分子量50萬）水溶液lmL，孵育半小時(shí)，干燥lh，制得羥 基表面的磁珠 3) 用10 mM PBS清洗后，3000 rpm離心，吸出上清液，加入丁二酸酐（10 mM)和DMAP(15 mM)的DMF溶液，于室溫下反應(yīng)12小時(shí) 4) 用DMF，乙醇，水分別清洗一次，3000 rpm離心，吸出上清液，得到羧基表面的磁珠 5) 用EDC/NHS活化表面后，避光下加入ImM氨基疊氮戊酸類光交聯(lián)劑的DMF溶液lmL，室 溫孵育4小時(shí)，3000 rpm離心，吸出上清液，低溫干燥，制得光交聯(lián)磁珠。
[0039]實(shí)施例3:殼聚糖光交聯(lián)磁珠制備 1) 將lml 65μπι環(huán)氧磁珠超聲分散，3000 rpm離心后，吸出上清液，重復(fù)一次 2) 加入配制好的1%殼聚糖(數(shù)均分子量50萬）水溶液lmL，孵育半小時(shí)，干燥lh，制得羥 基表面的磁珠 3) 用10 mM PBS清洗后，3000 rpm離心，吸出上清液，加入丁二酸酐（10 mM)和DMAP(15 mM)的DMF溶液，于室溫下反應(yīng)12小時(shí) 4) 用DMF，乙醇，水分別清洗一次，3000 rpm離心，吸出上清液，得到羧基表面的磁珠 5) 用EDC/NHS活化表面后，避光下加入ImM氨基疊氮戊酸類光交聯(lián)劑的DMF溶液lmL，室 溫孵育4小時(shí)，3000 rpm離心，吸出上清液，低溫干燥，制得殼聚糖光交聯(lián)磁珠。
[0040]實(shí)施例4:聚乙二醇光交聯(lián)磁珠制備 1) 將lml 65μπι環(huán)氧磁珠超聲分散，3000 rpm離心后，吸出上清液，重復(fù)一次 2) 加入配制好的3%聚乙二醇(數(shù)均分子量50萬）水溶液lmL，孵育半小時(shí)，干燥lh，制得 羥基表面的磁珠 3) 用10 mM PBS清洗后，3000 rpm離心，吸出上清液，加入丁二酸酐（10 mM)和DMAP(15 mM)的DMF溶液，于室溫下反應(yīng)12小時(shí) 4) 用DMF，乙醇，水分別清洗一次，3000 rpm離心，吸出上清液，得到羧基表面的磁珠 5) 用EDC/NHS活化表面后，避光下加入ImM氨基疊氮戊酸類光交聯(lián)劑的DMF溶液lmL，室 溫孵育4小時(shí)，3000 rpm離心，吸出上清液，低溫干燥，制得聚乙二醇光交聯(lián)磁珠。
[0041 ]實(shí)施例5:不同分子量葡聚糖光交聯(lián)磁珠制備 1) 將5ml 65μπι環(huán)氧磁珠超聲分散，3000 rpm離心后，吸出上清液，重復(fù)一次，分成5等 份； 2) 分別在每份磁珠中加入配制好的1%葡聚糖水溶液lmL(數(shù)均分子量分別為:20萬，40 萬，60萬，80萬，120萬），孵育半小時(shí)，干燥lh，制得羥基表面的磁珠5份 3) 將每一份不同分子量修飾的磁珠分別用10 mM PBS清洗后，3000 rpm離心，吸出上 清液，加入丁二酸酐（10 mM)和DMAP(15 mM)的DMF溶液，于室溫下反應(yīng)12小時(shí) 4) 用DMF，乙醇，水分別清洗一次，3000 rpm離心，吸出上清液，得到5份羧基表面的磁珠 5) 用EDC/NHS活化表面后，避光下加入ImM氨基疊氮戊酸類光交聯(lián)劑的DMF溶液lmL，室 溫孵育4小時(shí)，3000 rpm離心，吸出上清液，低溫干燥，制得5份不同分子量修飾的葡聚糖光 交聯(lián)磁珠。
[0042] 實(shí)施例6:小分子藥物固定（以Rapamycin(雷帕霉素)為例） 1) 將新制得的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例2)用10 mM PBS、純水分別清洗1次，低溫干燥，備用； 2) 將小分子藥物雷帕霉素溶解在DMF中，配制成10 mM溶液lmL; 3) 在室溫，避光條件下將雷帕霉素溶液加入到備用光交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，用500 W，365nM紫外光光照10分鐘； 4) 3000 rpm離心后，吸出上清液，分別用DMF，乙醇，純水各清洗一次，得到固定了小分 子藥物雷帕霉素的光交聯(lián)磁珠。
[0043 ]實(shí)施例7:青蒿葉提取物(混合物)的固定 1) 將新制得的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例2)用10 mM PBS，純水分別清洗1次，低溫干燥，備用 2) 將10 g青蒿葉子浸泡在100 mL乙醇溶液中，密封，三天后，過濾，得到青蒿素乙醇提 取液 3) 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮到lmL，再次過濾后，得到濃縮提取液 4) 在室溫，避光條件下將濃縮提取液加入到備用光交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，用500 W， 365nM紫外光光照10分鐘 5) 3000 rpm離心后，吸出上清液，分別用DMF，乙醇，純水各清洗一次，得到固定了青蒿 葉提取物的光交聯(lián)磁珠。
[0044] 通過對(duì)比光交聯(lián)磁珠和固定了提取物的光交聯(lián)磁珠的紅外吸收光譜，可以快速確 認(rèn)提取物確實(shí)固定在光交聯(lián)磁珠上了。
[0045] 實(shí)施例8:抗體蛋白IGG固定 1) 將新制得的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例2)用10 mM PBS，純水分別清洗1次，低溫干燥，備用 2) 將抗體蛋白IGG溶解在純水中，配制成10 mg/ml溶液lmL 3) 在室溫，避光條件下將蛋白IGG溶液加入到備用光交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，用500 W， 365nM紫外光光照10分鐘 4) 3000 rpm離心后，吸出上清液，分別用10mM PBS，純水各清洗一次，得到固定了抗體 蛋白IGG的光交聯(lián)磁珠。
[0046] 通過對(duì)比光交聯(lián)磁珠和固定了提取物的光交聯(lián)磁珠的紅外吸收光譜，可以快速確 認(rèn)提取物確實(shí)固定在光交聯(lián)磁珠上了。
[0047] 實(shí)施例9:DNA分子固定 1)將新制得的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例2)用10 mM PBS，純水分別清洗1次，低溫干燥，備用 2) 將DNA溶解在純水中，配制成1 mM溶液lmL 3) 在室溫，避光條件下將DNA溶液加入到備用光交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，用500 W， 365nM紫外光光照10分鐘 4) 3000 rpm離心后，吸出上清液，分別用DMF，乙醇，純水各清洗一次，得到固定了DNA 的光交聯(lián)磁珠。
[0048] 通過對(duì)比光交聯(lián)磁珠和固定了提取物的光交聯(lián)磁珠的紅外吸收光譜，可以快速確 認(rèn)提取物確實(shí)固定在光交聯(lián)磁珠上了。
[0049] 實(shí)施例10:小分子藥物Rapamycin光交聯(lián)磁珠用于祀標(biāo)蛋白捕獲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組1: 將含有l(wèi)mg/mL的FKBP12蛋白的蛋白質(zhì)水溶液1 mL加入制得的小分子藥物雷帕霉素的 光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例6)內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM roS，純水各 清洗一次，再離心，吸取上清液，低溫干燥，經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0. lmg/ml胰蛋白酶， 在37 °C，保濕條件下酶解12小時(shí)，得到多肽混合物。
[0050] 實(shí)驗(yàn)組2: 將含有l(wèi)mg/mL的FKBP12蛋白的胚胎牛血清10 mM PBS緩沖液1 mL加入制得的小分子 藥物雷帕霉素的光交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM PBS， 純水各清洗一次，再離心，吸取上清液，低溫干燥，經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0. lmg/ml胰蛋 白酶，在37 °C，保濕條件下酶解12小時(shí)，得到多肽混合物。
[0051] 空白組： 將1 mL純水溶液加入制得的小分子藥物雷帕霉素的光交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM roS，純水各清洗一次，再離心，吸取上清液，低溫干燥， 經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0.1mg/ml胰蛋白酶，在37 °C，保濕條件下酶解12小時(shí)，得到酶解 混合物。
[0052] 對(duì)照組： 將含有l(wèi)mg/mL的BSA蛋白的蛋白質(zhì)水溶液1 mL加入制得的小分子藥物雷帕霉素的光 交聯(lián)磁珠內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM PBS，純水各清洗一次，再 離心，吸取上清液，低溫干燥，經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0. lmg/ml胰蛋白酶，在37 °C，保濕 條件下酶解12小時(shí)，得到酶解混合物。
[0053]檢測(cè)： 將上述4種酶解混合物，分別去離子，過濾后，冷凍干燥后，溶解在lmL去離子質(zhì)譜上樣 液中，取10uL上樣，使用反相納升級(jí)液相色譜(Nan〇-RPLC)/ESI-MS/MS進(jìn)行分析。肽段結(jié)使 用Percolator算法控制肽段假陽性率(FDR)低于1%。檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中的FKBP12相關(guān)質(zhì)譜峰。 [0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示： 表1
結(jié)果表明： 實(shí)驗(yàn)組1，有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，且經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分 析，確認(rèn)FKPB12被光交聯(lián)磁珠捕獲到； 實(shí)驗(yàn)組2,有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，且經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分 析，確認(rèn)FKPB12被光交聯(lián)磁珠捕獲到。值得注意的是，即便在復(fù)雜胚胎牛血清液條件下，實(shí) 驗(yàn)中也只檢測(cè)到極少數(shù)歸屬于牛血清中的多肽，說明光交聯(lián)磁珠具備良好的抗非特異性； 空白組沒有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分析， 去掉胰蛋白自身酶解多肽峰后，極少蛋白被捕獲到； 對(duì)照組沒有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，去掉胰蛋白自身酶 解多肽峰后，經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分析，極少蛋白被捕獲到； 結(jié)果表明，固定了小分子藥物雷帕霉素的光交聯(lián)磁珠能有效捕獲FKBP12蛋白，并能過 與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行確認(rèn)，可以用于各類藥物分子的靶標(biāo)蛋白捕獲。
[0055]按上述方法，將實(shí)施例1、2、3、4、5制得的光交聯(lián)磁珠分別固定雷帕霉素并用于胚 胎牛血清中的FKBP12蛋白捕獲，實(shí)施例1、2、3、4的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比說明高分子修飾后的磁珠 (葡聚糖，殼聚糖)具有更好的抗非特異性能，實(shí)施例5中不同分子量修飾磁珠對(duì)比數(shù)據(jù)如表 2所示： 表2
表2的數(shù)據(jù)說明，磁珠上共價(jià)結(jié)合分子量在40~60萬之間的親水性高分子后，具有更好 的抗非特異性能。
[0056]實(shí)施例11:小分子藥物雷帕霉素光交聯(lián)磁珠用于不同濃度靶標(biāo)蛋白捕獲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組一： 將含有1 mg/mL的FKBP12蛋白的蛋白質(zhì)水溶液1 mL加入制得的小分子藥物雷帕霉素 的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例6)內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM PBS，純水 各清洗一次，再離心，吸取上清液，低溫干燥，經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0. lmg/ml胰蛋白 酶，在37°C，保濕條件下酶解12小時(shí)，得到多肽混合物。
[0057] 實(shí)驗(yàn)組二： 將含有100 yg/mL的FKBP12蛋白的蛋白質(zhì)水溶液1 mL加入制得的小分子藥物雷帕霉 素的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例6)內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM PBS，純 水各清洗一次，再離心，吸取上清液，低溫干燥，經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0. lmg/ml胰蛋白 酶，在37°C，保濕條件下酶解12小時(shí)，得到多肽混合物。
[0058] 實(shí)驗(yàn)組三： 將含有10 yg/mL的FKBP12蛋白的蛋白質(zhì)水溶液1 mL加入制得的小分子藥物雷帕霉素 的光交聯(lián)磁珠(實(shí)施例6)內(nèi)，孵育1小時(shí)，3000 rpm離心，吸取上清液后，用10 mM PBS，純水 各清洗一次，再離心，吸取上清液，低溫干燥，經(jīng)50mM NH4HC03清洗后，用0. lmg/ml胰蛋白 酶，在37°C，保濕條件下酶解12小時(shí)，得到多肽混合物。
[0059]檢測(cè):將上述3種酶解混合物，分別去離子，過濾后，冷凍干燥后，溶解在lmL去離子 質(zhì)譜上樣液中，取10uL上樣，使用反相納升級(jí)液相色譜(Nan〇-RPLC)/ESI-MS/MS進(jìn)行分析。 肽段結(jié)使用Percolator算法控制肽段假陽性率(FDR)低于1%。監(jiān)測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中的FKBP12相 關(guān)質(zhì)譜峰，質(zhì)譜圖如圖2所示。
[0060] 結(jié)果表明： 實(shí)驗(yàn)組一有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，且經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分 析，確認(rèn)FKPB12被光交聯(lián)磁珠捕獲到，經(jīng)MASCOT軟件分析，得分95000，相對(duì)豐度80%; 實(shí)驗(yàn)組二有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，且經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分 析，確認(rèn)FKPB12被光交聯(lián)磁珠捕獲到，經(jīng)MASCOT軟件分析，得分55500，相對(duì)豐度53%; 實(shí)驗(yàn)組三有明顯歸屬于FKBP12蛋白的多肽指紋圖譜或分子離子峰，且經(jīng)蛋白質(zhì)學(xué)分 析，確認(rèn)FKPB12被光交聯(lián)磁珠捕獲到，經(jīng)MASCOT軟件分析，得分34800，相對(duì)豐度30%。
[0061] 上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，光交聯(lián)后的磁珠具有很好地捕獲能力，不僅可以用于高濃度 蛋白的捕獲，也可以用于低含量蛋白的捕獲。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗非特異性捕獲磁珠，包括納米磁珠，其特征在于:納米磁珠表面共價(jià)修飾有數(shù) 均分子量為5萬~200萬的親水性高分子，高分子的末端修飾有光交聯(lián)劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗非特異性捕獲磁珠，其特征在于:磁珠的直徑為10 nm~135 μηι〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗非特異性捕獲磁珠，其特征在于:親水性高分子選自聚乙二 醇、聚酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗非特異性捕獲磁珠，其特征在于:光交聯(lián)劑選自苯基疊氮基 類、二苯甲酮基類、三氟甲基苯基雙吖丙啶類、疊氮戊酸類光交聯(lián)劑。5. -種抗非特異性捕獲磁珠的制備方法，包括如下步驟： 選取表面修飾有錨定基團(tuán)的磁珠，活化后與數(shù)均分子量為5萬~200萬的親水性高分子 反應(yīng)，在磁珠上偶聯(lián)尚分子； 繼續(xù)活性磁珠上偶聯(lián)的高分子，之后通過化學(xué)交聯(lián)在高分子末端引入光交聯(lián)劑； 抗非特異性捕獲磁珠組成如權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:錨定基團(tuán)選自羧基、胺基、巰基、鹵代 烷烴，炔基、烯基。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:光交聯(lián)劑選自苯基疊氮基類、二苯甲 酮基類、三氟甲基苯基雙吖丙啶類、疊氮戊酸類光交聯(lián)劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:磁珠表面修飾有羧基，采用EDC/NHS活 化，對(duì)應(yīng)的親水性高分子具有胺基。9. 應(yīng)用抗非特異性捕獲磁珠捕獲藥物靶標(biāo)的方法，包括如下步驟： 1) 將權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的抗非特異性捕獲磁珠與藥物分子混合，引發(fā)光交 聯(lián)，使藥物分子共價(jià)固定在抗非特異性捕獲磁珠上，得到藥物靶標(biāo)捕獲磁珠； 2) 將藥物靶標(biāo)捕獲磁珠與待測(cè)液混合，充分反應(yīng)后分離磁珠； 3) 將磁珠上吸附的物質(zhì)洗脫，對(duì)洗脫物進(jìn)行檢測(cè)，確定藥物靶標(biāo)。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:捕獲磁珠與藥物分子混合時(shí)使用的溶劑 為DMS0、水、甲醇、乙醇、石油醚、苯、氯苯、氯仿、丙酮、THF、DMF、二氧六環(huán)中的至少一種。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK106039320SQ201610357600
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】趙 智, 楊墨, 周文菲, 陸永藝, 溫華杰, 朱勁松
【申請(qǐng)人】廣州高通生物技術(shù)有限公司