一種葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠及其制備方法和應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明涉及一種葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠及其制備方法和應(yīng)用；葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠中，多孔微球是聚乳酸?羥基乙酸共聚物(PLGA)多孔微球，PLGA多孔微球的平均粒徑范圍為1～20μm；聚合物為含有鄰苯二酚基團(tuán)的透明質(zhì)酸本發(fā)明多孔微球/多羥基聚合物復(fù)合凝膠是:將苯硼酸表面改性的多孔微球與多羥基聚合物的水溶液共混；微球表面上的苯硼酸和多羥基聚合物鏈段上的順式二羥基之間發(fā)生鍵合反應(yīng)，形成交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)，制得復(fù)合凝膠。葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)；應(yīng)用于開(kāi)發(fā)胰島素植入凝膠長(zhǎng)效緩釋制劑。在糖尿病治療新劑型的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值?！緦＠f(shuō)明】一種葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠及其制備方法，該復(fù)合凝膠系統(tǒng)具有葡萄糖敏感性，能夠高效大量負(fù)載胰島素并在pH7.4的生理?xiàng)l件下響應(yīng)葡萄糖濃度的變化調(diào)節(jié)胰島素的釋放，屬于藥用高分子水凝膠領(lǐng)域。【
背景技術(shù)：
】[0002]糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為我國(guó)一個(gè)重大公共衛(wèi)生危機(jī)。糖尿病是胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足所致的代謝性疾病，所以自胰島素發(fā)現(xiàn)和成功提取以來(lái)，它一直是糖尿病治療的首選藥物。目前，臨床胰島素給藥的主要途徑是皮下注射。糖尿病患者往往需要長(zhǎng)期頻繁注射，不僅成本高、給藥不便、還會(huì)出現(xiàn)疼痛及皮下組織萎縮等諸多不良反應(yīng)，因而病人的順應(yīng)性極差。此外，該治療方法無(wú)法提供一種模擬生理胰島素分泌模式，不能有效阻止相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[Pillai0.,PanchagnulaR.Insulintherapies:past,presentandfuture,DrugDiscov.Today2001,6(20),1056-1061]。因此，為糖尿病患者提供安全便利的非注射式給藥制劑具有重要社會(huì)意義和廣闊的經(jīng)濟(jì)前景。[0003]在皮下或腹腔植入葡萄糖敏感的胰島素生理自調(diào)式給藥系統(tǒng)，不但可以避免胃腸道及肝臟的首過(guò)效應(yīng)和生物膜障礙，提高生物利用度，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效緩釋，避免頻繁給藥，增加患者依從性;而且還能夠自動(dòng)感知患者體內(nèi)血糖濃度的變化而及時(shí)調(diào)控胰島素的釋放，最大程度地模擬生理胰島素的分泌模式，是治療糖尿病的理想方案[CatargiB.Currentstatusandfutureofimplantableinsulinpumpsforthetreatmentofdiabetes,ExpertRev.Med.Dev.2004,1，181-185.]。苯硼酸及其衍生物能夠可逆、長(zhǎng)期持續(xù)響應(yīng)葡萄糖濃度變化，實(shí)現(xiàn)胰島素循環(huán)開(kāi)-關(guān)式(Closed-loopdelivery)的智能釋放。因此，基于苯硼酸功能化聚合物開(kāi)發(fā)的胰島素植入凝膠給藥系統(tǒng)，同時(shí)具有凝膠的植入定位特性和苯硼酸對(duì)葡萄糖的感應(yīng)識(shí)別能力，不但能夠通過(guò)微創(chuàng)或注射的方式很容易植入體內(nèi)，而且能夠模擬生理胰島素分泌模式，生物兼容性好，對(duì)病人生活無(wú)影響，藥物釋放完后可在體內(nèi)降解無(wú)需取出。顯然，這類高分子凝膠在開(kāi)發(fā)胰島素生理自調(diào)式植入給藥系統(tǒng)方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值。盡管如此，基于苯硼酸的聚合物水凝膠一般在堿性條件下才能響應(yīng)葡萄糖刺激，無(wú)法在在pH7.4的生理?xiàng)l件下發(fā)揮葡萄糖敏感功能，極大的限制其在生物體內(nèi)的應(yīng)用[BratlieK.M.,YorkR.L.,InvernaleM.A.,LangerR.,AndersonD.G.Materialsfordiabetestherapeutics,Adv.HealthcareMater·2012,1,267-284.]。此外，膜島素這種生物大分子藥物(Mn=5808g/mol)，不同于其他小分子藥物，將胰島素完整、高效地包封進(jìn)凝膠載體非常困難[VermondenT.，CensiR.，HenninkW.E.Hydrogelsforproteindelivery，Chem.Rev.2012,112,2853-2888]。此外，具有大分子結(jié)構(gòu)的胰島素，和高分子水凝膠之間往往存在較強(qiáng)的分子間作用力，載入大量胰島素對(duì)凝膠的力學(xué)性能、溶解能力、應(yīng)激靈敏度等都有很大的影響。這些因素進(jìn)一步制約了聚合物凝膠載體對(duì)胰島素的負(fù)載能力，導(dǎo)致載藥量往往很小。對(duì)于植入給藥系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，低載藥量將顯著降低凝膠在體內(nèi)的給藥時(shí)間，導(dǎo)致植入頻率上升。這將急劇增加該類給藥系統(tǒng)的使用成本，降低病人的順應(yīng)性。也就是說(shuō)，現(xiàn)有聚合物凝膠體系對(duì)胰島素這類生物大分子藥物的負(fù)載方式和載藥能力，難以滿足胰島素植入凝膠載體在高效大量負(fù)載、精確長(zhǎng)效控釋等方面的性能要求。[0004]表面或者內(nèi)部具有蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu)的多孔聚合物微球具有很大的比表面積和孔體積，微球的表面和孔道內(nèi)部具備很強(qiáng)的吸附能力，在生物大分子藥物的負(fù)載與控釋方面具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[CaiY.，ChenY.，HongX.，LiuZ.，YuanW.Porousmicrosphereanditsapplications，Inter·J.Nanomedicine2013,8,1111-1120.]。多孔微球的多孔結(jié)構(gòu)用于負(fù)載蛋白質(zhì)類藥物可避免油/水界面、高速攪拌或超聲等導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性和聚集問(wèn)題。而且，通過(guò)調(diào)節(jié)微球大小形態(tài)、孔道結(jié)構(gòu)，不但較容易地控制藥物的載荷量和分布，而且還可調(diào)控藥物釋放速度。這些特性已經(jīng)使多孔聚合物微球成為蛋白質(zhì)類藥物的理想載體，但是由于胰島素獨(dú)特的給藥控釋方式，單一的多孔微球顯然無(wú)法作為胰島素的長(zhǎng)效緩釋給藥載體。[0005]終上所述，利用具有葡萄糖敏感的苯硼酸功能化聚合物，開(kāi)發(fā)具有類似人體胰腺功能的胰島素生理自調(diào)式可植入凝膠給藥系統(tǒng)具有重要意義和廣闊的前景。但是需要解決苯硼酸功能化水凝膠無(wú)法在pH7.4的生理?xiàng)l件下響應(yīng)葡萄糖刺激和對(duì)胰島素高效負(fù)載控釋的問(wèn)題?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]針對(duì)苯硼酸功能化聚合物水凝膠作為胰島素控釋載體面臨的關(guān)鍵問(wèn)題，基于系統(tǒng)工程的思想，本發(fā)明開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)一種在pH7.4的生理?xiàng)l件下葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠系統(tǒng)，該復(fù)合凝膠系統(tǒng)將凝膠載體的可植入定位性能、刺激響應(yīng)功能和多孔微球的高效負(fù)載特性協(xié)同整合，有望解決胰島素生理自調(diào)式可植入凝膠給藥系統(tǒng)面臨的復(fù)雜問(wèn)題。[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：[0008]一種葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠，多孔微球是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)多孔微球，PLGA多孔微球的平均粒徑范圍為1~20μπι;聚合物為含有鄰苯二酚基團(tuán)的透明質(zhì)酸，其結(jié)構(gòu)特征如（1)式所示：[0009]⑴。[0010]所述多孔微球?yàn)楸脚鹚岜砻婀δ芨男缘腜LGA多孔微球，利用氨基苯硼酸，對(duì)PLGA多孔微球的表面進(jìn)行改性，引入苯硼酸基團(tuán)。[0011]所述氨基苯硼酸包括鄰氨基苯硼酸、間氨基苯硼酸和對(duì)氨基苯硼酸。[0012]所述含有鄰苯二酚基團(tuán)的透明質(zhì)酸是，利用多巴胺對(duì)透明質(zhì)酸改性，引入鄰苯二酚基團(tuán)，制得多巴胺改性透明質(zhì)酸，多巴胺改性透明質(zhì)酸鏈段上的多巴胺接枝效率為1~50%〇[0013]本發(fā)明多孔微球/多羥基聚合物復(fù)合凝膠是:將苯硼酸表面改性的多孔微球與多羥基聚合物的水溶液共混;微球表面上的苯硼酸和多羥基聚合物鏈段上的順式二羥基之間發(fā)生鍵合反應(yīng)，形成交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)，制得復(fù)合凝膠。[0014]本發(fā)明的復(fù)合凝膠的制備方法，包括以下步驟：[0015](1)、將苯硼酸表面改性PLGA多孔微球分散于水中，使PLGA多孔微球水分散液的質(zhì)量濃度范圍為1~100%;[0016](2)、將多巴胺改性透明質(zhì)酸溶解于水或者磷酸鹽的緩沖溶液中，使多巴胺改性透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度范圍為1~20%;[0017](3)分別取PLGA多孔微球水分散液和多巴胺改性透明質(zhì)酸溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為6.5-11.5，控制溫度在4-60°C，攪拌均勻，室溫靜置，得到PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠;所制得PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠中，多巴胺改性透明質(zhì)酸質(zhì)量含量范圍為5~20%，PLGA微球含量的質(zhì)量范圍為1~20%。[0018]本發(fā)明的葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)；多孔微球/聚合物復(fù)合凝可以通過(guò)注射或者微創(chuàng)手術(shù)植入體內(nèi)，在pH7.4的生理?xiàng)l件下，能夠響應(yīng)環(huán)境中葡萄糖濃度的變化，實(shí)現(xiàn)胰島素藥物的可控釋放。[0019]葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠應(yīng)用于開(kāi)發(fā)胰島素植入凝膠長(zhǎng)效緩釋制劑。[0020]具體說(shuō)明如下：[0021]本發(fā)明所述的PLGA多孔微球是基于乳化溶劑揮發(fā)法，在致孔劑存在下制備的多孔微球。具體步驟為將致孔劑溶于適量水中，PLGA溶于有機(jī)溶劑中，二者混合后，利用細(xì)胞破碎儀乳化形成Wl(內(nèi)水相）/0(油相）乳濁液，隨后將乳濁液分散于聚乙烯醇（PVA)水溶液(W2)中，形成W1/0/W2雙乳體系，室溫下?lián)]發(fā)溶劑，水洗除去致孔劑，得到PLGA多孔微球。多孔微球的平均粒徑范圍為1~20μπι。[0022]本發(fā)明所述的？11^分子量范圍為5000-5000(^/111〇1，乳酸和羥基乙酸的比為50:50~85:15〇[0023]本發(fā)明所述制備PLGA多孔微球所用的致孔劑包括碳酸氫銨，牛血清蛋白（BSA)，油酸鈉。[0024]本發(fā)明所述制備PLGA多孔微球所用的有機(jī)溶劑包括二氯甲烷，三氯甲烷等。[0025]本發(fā)明所述苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球是利用PLGA多孔微球表面的羧基和氨基苯硼酸的氨基之間的反應(yīng)，在一定量的催化劑的作用下，于中水反應(yīng)制得。[0026]本發(fā)明所述苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球是利用乙二胺將PLGA多孔微球表面的羧基進(jìn)行氨基化后，然后在PLGA微球表面接枝聚丙烯酸，再利用聚丙烯酸鏈段上的羧基與氨基苯硼酸的氨基反應(yīng)，在一定量的催化劑的作用下，于水中將氨基苯硼酸鍵接到PLGA微球表面上，制得苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球。[0027]本發(fā)明所述氨基苯硼酸包括對(duì)氨基苯硼酸和間氨基苯硼酸以及鄰氨基苯硼酸。[0028]本發(fā)明所述聚丙烯酸分子量為1000~5000g/mol。[0029]本發(fā)明所述的含有鄰苯二酚基團(tuán)的聚合物為多巴胺改性的透明質(zhì)酸。[0030]本發(fā)明所述的多巴胺改性透明質(zhì)酸是利用多巴胺的氨基和透明質(zhì)酸的羧基之間的反應(yīng)，在一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)存在下，于水中將多巴胺鍵接到透明質(zhì)酸上，制得多巴胺改性透明質(zhì)酸，其結(jié)構(gòu)特征如式1所示。[0031][0032]本發(fā)明所述的PLGA多孔微球負(fù)載胰島素的過(guò)程是將所制備的多孔微球分散于胰島素的飽和水溶液中，充分吸附，離心分離，冷凍干燥制得。[0033]本發(fā)明所述的葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠的制備是將適量苯硼酸表面改性PLGA多孔微球分散于水中，隨后與一定量的多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液混合，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值6.5-11.5，使多巴胺改性透明質(zhì)酸交聯(lián)，制得PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠。[0034]本發(fā)明所述的制備PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠所用的多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液的濃度范圍為1~20%(重量）。[0035]本發(fā)明所述的制備PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠所用的PLGA多孔微球水分散液的濃度范圍為1~100%(重量）。[0036]本發(fā)明所述的制備PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠中，多巴胺改性透明質(zhì)酸的含量的范圍為5~20%(重量）。[0037]本發(fā)明所述的制備PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠中，PLGA微球含量的范圍為1~20%(重量）。[0038]本發(fā)明所述的葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠可以在生理?xiàng)l件下(pH7.4)響應(yīng)葡萄糖濃度變化發(fā)生溶脹-收縮轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素的生理自調(diào)式的長(zhǎng)期持續(xù)釋放。[0039]本發(fā)明所述的葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠系統(tǒng)可以通過(guò)注射或者微創(chuàng)手術(shù)植入體內(nèi)。[0040]本發(fā)明所述的葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠系統(tǒng)可在體內(nèi)降解。[0041]本發(fā)明所述的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠具有葡萄糖敏感性能，能夠響應(yīng)環(huán)境中葡萄糖濃度的變化，實(shí)現(xiàn)胰島素的可控釋放，如附圖1所示。微球表面上的苯硼酸和多巴胺改性透明質(zhì)酸鏈段上的鄰苯二酚基團(tuán)之間發(fā)生鍵合反應(yīng)，形成交聯(lián)聚合物復(fù)合凝膠。同時(shí)，透明質(zhì)酸被交聯(lián)錨定在多孔微球表面形成緊密的、葡萄糖敏感的智能控釋層。無(wú)葡萄糖存在下，該智能控釋層非常穩(wěn)定，能夠阻止胰島素從多孔微球中釋放，但是在葡萄糖出現(xiàn)的情況下，由于小分子葡萄糖能夠競(jìng)爭(zhēng)微球表面的苯硼酸基團(tuán)，導(dǎo)致透明質(zhì)酸從微球表面剝離，一方面破壞了凝膠的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使凝膠發(fā)生膨脹;另一方面破壞了微球表面的控釋層，打開(kāi)了藥物釋放通道，從而導(dǎo)致胰島素釋放。胰島素的釋放，使體內(nèi)葡萄糖濃度降低，微球表面上的苯硼酸和多巴胺改性透明質(zhì)酸鏈段上的鄰苯二酚基團(tuán)之間重新發(fā)生鍵合反應(yīng)，形成復(fù)合凝膠，并在微球表面重新形成控釋層，控制胰島素的釋放。[0042]本發(fā)明所提供的葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠系統(tǒng)在開(kāi)發(fā)胰島素可植入長(zhǎng)效緩釋制劑，為糖尿病患者提供安全便利的非注射式給藥方式等方面有廣闊的應(yīng)用前景。[0043]本發(fā)明的特征在于：（1)本發(fā)明所述的復(fù)合凝膠中，苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球不但起到交聯(lián)多羥基聚合物形成凝膠的作用，而且，由于多孔聚合物微球具有很大的比表面積和孔體積，能夠大量負(fù)載胰島素，有效解決胰島素等大分子藥物在凝膠中的高效負(fù)載問(wèn)題；（2)本發(fā)明所述的復(fù)合凝膠中，多巴胺改性透明質(zhì)酸不但是形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的基體，還能夠在多孔微球表面形成葡萄糖敏感的智能控釋層，實(shí)現(xiàn)葡萄糖敏感的胰島素可控釋放；（3)本發(fā)明所述的苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球和多巴胺改性透明質(zhì)酸之間可以在pH7.4環(huán)境中實(shí)現(xiàn)交聯(lián)，解決基于苯硼酸的聚合物水凝膠無(wú)法在生理?xiàng)l件下交聯(lián)和響應(yīng)葡萄糖刺激的問(wèn)題；（4)本發(fā)明所述的復(fù)合凝膠充分發(fā)揮了多孔微球、葡萄糖敏感苯硼酸、高分子凝膠的各自功能和協(xié)同效應(yīng)，有望實(shí)現(xiàn)胰島素生理自調(diào)式的長(zhǎng)期持續(xù)釋放，為糖尿病患者開(kāi)發(fā)高效、便利的給藥新技術(shù)和新劑型提供新方案。在糖尿病治療新劑型的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值。【附圖說(shuō)明】[0044]圖1為PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠及其響應(yīng)葡萄糖濃度調(diào)控胰島素釋放原理示意圖[0045]圖2為典型的PLGA多孔微球掃描電鏡圖[0046]圖3為間接改性法制備苯硼酸表面改性PLGA多孔微球的制備過(guò)程[0047]圖4為PLGA多孔微球(PLGA)、表面氨基化的PLGA多孔微球(PLGA-NH2)和表面接枝聚丙烯酸的PLGA多孔微球(PLGA-PAA)的ζ-電位表征[0048]圖5為PLGA多孔微球(PLGA)、面接枝聚丙烯酸的PLGA多孔微球(PLGA-NH2)和苯硼酸表面改性PLGA多孔微球(PLGA-PAAPBA)的紅外表征[0049]圖6為透明質(zhì)酸和多巴胺改性透明質(zhì)酸核磁表征[0050]圖7為多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液和PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠圖[0051]圖8為PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的胰島素釋放曲線，PH7.4【具體實(shí)施方式】[0052]通過(guò)下述實(shí)施例有助于理解本發(fā)明，但并不限制本專利的【
發(fā)明內(nèi)容】。[0053]實(shí)施例1:不同形貌的PLGA多孔微球的制備[0054](1)以BSA為致孔劑制備PLGA多孔微球[0055]稱取乳酸和羥基乙酸的比為50:50、分子量為500(^/111〇1的?1^^聚合物50011^，溶于3mL二氯甲烷中。隨后稱取400mg致孔劑BSA溶于0.6mL水中，將PLGA的二氯甲烷溶液和BSA水溶液用細(xì)胞破碎儀乳化12次，形成W1(內(nèi)水相）/0(油相）乳濁液。讓后將該乳濁液分散到300mL0.4%PVA水溶液中，高速剪切(7000r/min)，形成W1/0/W2雙乳體系，室溫下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑，離心干燥，得到PLGA多孔微球，微球的平均粒徑約為20μπι。[0056](2)以碳酸氫銨為致孔劑制備PLGA多孔微球[0057]稱取乳酸和羥基乙酸的比為75:25、分子量為3000(^/111〇1的？1^^聚合物50011^，溶于3mL三氯甲烷中。隨后稱取10mg致孔劑碳酸氫銨溶于lmL水中，將PLGA的三氯甲烷溶液和碳酸氫銨水溶液用細(xì)胞破碎儀乳化20次，形成W1(內(nèi)水相)/0(油相）乳濁液。讓后將該乳濁液分散到300mL0.4%PVA水溶液中，高速剪切（10000r/min)，形成W1/0/W2雙乳體系，室溫下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑，離心干燥，得到PLGA多孔微球，微球的平均粒徑約為ΙΟμπι。[0058](3)以油酸鈉為致孔劑制備PLGA多孔微球[0059]稱取乳酸和羥基乙酸的比為85:15、分子量為5000(^/111〇1的？1^^聚合物50011^，溶于3mL二氯甲烷中。隨后稱取10mg致孔劑油酸鈉溶于lmL水中，將PLGA的二氯甲烷溶液和油酸鈉水溶液用細(xì)胞破碎儀乳化20次，形成W1(內(nèi)水相)/0(油相)乳濁液。讓后將該乳濁液分散到300mL0.4%PVA水溶液中，高速剪切（10000r/min)，形成W1/0/W2雙乳體系，室溫下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑，離心干燥，得到PLGA多孔微球，微球的平均粒徑約為5μπι。用掃描電鏡觀察PLGA多孔微球的形貌，將凍干后的PLGA多孔微球涂在導(dǎo)電膠上，同時(shí)取少量微球切片，用FEINano450觀察PLGA多孔微球的表面形貌及其斷面。測(cè)試結(jié)果如附圖2所示，圖中結(jié)果顯示，PLGA多孔微球的平均粒徑在5μπι，表面粗糙，有小孔。微球斷面結(jié)果顯示，PLGA內(nèi)部呈不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)。[0060](4)以油酸鈉為致孔劑制備PLGA多孔微球[0061]稱取乳酸和羥基乙酸的比為50:50、分子量為2000(^/111〇1的？1^^聚合物50011^，溶于3mL二氯甲烷中。隨后稱取5mg致孔劑油酸鈉溶于0.5mL水中，將PLGA的二氯甲烷溶液和油酸鈉水溶液用細(xì)胞破碎儀乳化20次，形成W1(內(nèi)水相)/0(油相）乳濁液。形成W1(內(nèi)水相)/0(油相)乳濁液。讓后將該乳濁液分散到300mL0.4%PVA水溶液中，高速剪切（10000r/min)，形成W1/0/W2雙乳體系，室溫下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑，離心干燥，得到PLGA多孔微球，微球的平均粒徑約為lym。[0062]實(shí)施例2:苯硼酸表面改性PLGA多孔微球的制備[0063](1)間接改性法制備苯硼酸表面改性PLGA多孔微球[0064]間接改性法制備苯硼酸表面改性PLGA多孔微球的過(guò)程如附圖3所示，先利用乙二胺將PLGA多孔微球表面的羧基進(jìn)行氨基化，然后在PLGA微球表面接枝聚丙烯酸，再利用聚丙烯酸鏈段上的羧基與氨基苯硼酸的氨基反應(yīng)，將氨基苯硼酸鍵接到PLGA微球表面上，制得苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球。氨基苯硼酸包括對(duì)氨基苯硼酸、間氨基苯硼酸和鄰氨基苯硼酸，其中最佳選擇為間氨基苯硼酸。具體過(guò)程如下，將250mg的PLGA多孔微球分散于2-嗎啉乙磺酸水溶液(1^5,0.1111〇1/1，？!1=5.5)中，隨后加入一定量催化劑1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，室溫?cái)嚢杌罨?h，加入500mg乙二胺，反應(yīng)24h，離心分離，洗滌3-5次，制得表面氨基化的PLGA微球。將氨基化的PLGA微球分散于適量聚丙烯酸水溶液中，丙烯酸的最佳分子量范圍為1000~5000g/mol。隨后，加入適量的EDC和NHS，4°C反應(yīng)24h后離心分離，洗滌制得表面接枝聚丙烯酸的PLGA微球。隨后將得到表面接枝聚丙烯酸的PLGA微球500mg分散于適量的水溶液中，加入EDC和NHS，攪拌活化后，加入250mg的間氨基苯硼酸，反應(yīng)24h，離心分離，洗滌，真空干燥即可得到苯硼酸表面改性PLGA多孔微球。[0065]對(duì)所制得的PLGA多孔微球(PLGA)、表面氨基化的PLGA多孔微球(PLGA-NH2)和表面接枝聚丙烯酸的PLGA多孔微球(PLGA-PAA)的ζ-電位進(jìn)行表征，如附圖4所示。測(cè)試結(jié)果顯示，PLGA，PLGA-NH2，PLGA-PAA多孔微球的ζ-電位分別為-22.6±1.811^，-8.7±0.6711^，-30.1±2mV。PLGA-PAA多孔微球表面電荷的變化表明微球表面上的羧基含量增大，PLGA-PAA被成功制備。PLGA多孔微球(PLGA)、表面接枝聚丙烯酸的PLGA多孔微球(PLGA-PAA)和苯硼酸表面改性的PLGA多孔微球(PLGA-PAAPBA)的紅外表征，如附圖5所示。測(cè)試結(jié)果表明，相對(duì)于PLGA多孔微球，PLGA-PAA多孔球的羧基含量變多，PLGA-PAAPBA在161501^,1530(^1出現(xiàn)了苯環(huán)上C=C的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明微球表面接上了苯硼酸基團(tuán)。[0066](2)直接改性法制備苯硼酸表面改性PLGA多孔微球[0067]將500mg的PLGA多孔微球分散于MES緩沖液(0.lmol/LpH=5.5)中，隨后加入一定量的EDC和NHS，室溫?cái)嚢杌罨?h，隨后加入500mg的氨基苯硼酸，在冰水浴的條件下反應(yīng)24h，離心分離，用蒸餾水洗滌3-5次，冷凍干燥，得到苯硼酸表面改性PLGA多孔微球。[0068]實(shí)施例3:苯硼酸表面改性PLGA多孔微球?qū)σ葝u素的負(fù)載[0069]將胰島素分散于適量的水中，通過(guò)滴加稀鹽酸調(diào)控溶液的pH值范圍為1.0-7.4,調(diào)控胰島素在水中溶解度，離心取上層清液可以得到不同濃度的胰島素飽和水溶液。隨后取2mL胰島素的飽和水溶液，加入100mg苯硼酸表面改性PLGA多孔微球，輕微攪拌2-24h，離心分離，冷凍干燥得到載有胰島素的苯硼酸表面改性PLGA多孔微球。通過(guò)測(cè)試胰島素溶液被微球負(fù)載前后濃度的變化，可測(cè)算出PLGA多孔微球?qū)σ葝u素的負(fù)載量。PLGA多孔微球?qū)σ葝u素的負(fù)載量約為10~45%。[0070]實(shí)施例4:多巴胺改性透明質(zhì)酸的制備[0071]稱取透明質(zhì)酸（1.5g)溶于100mLMES緩沖液中，加EDC(3.19g)，NHS(1.92g)，多巴胺（2g)，4°C反應(yīng)，通氮?dú)?h后密封，反應(yīng)4-48h，透析、凍干得到多巴胺改性透明質(zhì)酸，多巴胺基團(tuán)在透明質(zhì)酸鏈段上的接枝效率為1~50%。對(duì)透明質(zhì)酸和多巴胺改性透明質(zhì)酸進(jìn)行了核磁表征，結(jié)果如附圖6所示，相對(duì)于透明質(zhì)酸，多巴胺改性透明質(zhì)酸在6.5-7.5ppm出有明顯的苯環(huán)上的氫吸收峰，同時(shí)3.3ppm處出現(xiàn)了與氨基相連上的-CH2-的氫的吸收峰，說(shuō)明多巴胺改性透明質(zhì)酸已被成功制備。[0072]實(shí)施例5:多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠的制備[0073]苯硼酸表面改性PLGA多孔微球（100mg)分散于lmL水中，形成10%(重量)的PLGA微球分散液。將多巴胺改性透明質(zhì)酸（l〇〇mg)溶解于2mL磷酸鹽緩沖溶液或者水溶液中，形成5%(重量）的多巴胺改性透明質(zhì)酸溶液。將PLGA微球分散液和多巴胺改性透明質(zhì)酸溶液混合，調(diào)節(jié)溶液pH為6.5-11.5，控制溫度在4-60°C，攪拌均勻，室溫靜置，得到PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠。[0074]制備多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠所用的PLGA多孔微球水分散液的濃度范圍為1~100%(重量），PLGA多孔微球水分散液的濃度的最佳選擇為10~20%(重量）。制備PLGA多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠所用的多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液的濃度范圍為1~20%(重量），多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液的濃度的最佳選擇為5~15%(重量）。制備多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠的pH值范圍為6.5-11.5，其中pH值最佳選擇為中性條件pH=7.4。制備多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠的溫度在4-60°C，其中溫度值最佳選擇為15~30°C。[0075]制備過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)PLGA多孔微球和多巴胺改性透明質(zhì)酸加入的量，可以改變復(fù)合凝膠的交聯(lián)密度、力學(xué)性能和載藥量。最后所制得PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠中，多巴胺改性透明質(zhì)酸含量的合適范圍為5~20%(重量），和PLGA微球含量的范圍為1~20%(重量）。[0076]多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液和PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠如附圖7所示，相對(duì)于多巴胺改性透明質(zhì)酸水溶液，PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠呈白色，并且將玻璃瓶倒置后凝膠的不流動(dòng)，說(shuō)明多巴胺改性透明質(zhì)酸已被交聯(lián)，形成了復(fù)合凝膠。[0077]實(shí)施例6:PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠的胰島素釋放[0078]將濃度為10%的載有胰島素的PLGA多孔微球的水分散液lmL和10%的多巴胺改性透明質(zhì)酸的磷酸鹽緩沖溶液3mL共混，pH為7.4,攪拌均勻，得到載有胰島素的PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠。[0079]分別取0.5mL上述凝膠置于透析袋(截留分子量:8000)中，隨后將透析袋浸入50mL葡萄糖濃度分別為0mg/mL，5mg/mL，10mg/mL的磷酸鹽緩沖溶液中，pH值為7.4，將搖床溫度設(shè)為37°C，分別在15min，30min，45min，60min，90min，120min，180min取樣，用紫外分光光度計(jì)觀察在226.5處測(cè)吸光度。在不同葡萄糖濃度下，胰島素從復(fù)合凝膠體外累計(jì)釋放量-時(shí)間曲線如附圖8所示，可以看出，無(wú)葡萄糖水溶液中，葡萄糖基本不釋放，24小時(shí)累計(jì)釋放量約為5%;隨著葡萄糖的加入，胰島素釋放明顯加快，而且隨葡萄糖濃度的升高，胰島素的釋放量增大。該凝膠體系實(shí)現(xiàn)了在生理?xiàng)l件下，隨葡萄糖含量的變化，調(diào)控胰島素的釋放?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠，其特征在于多孔微球是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)多孔微球，PLGA多孔微球的平均粒徑范圍為1~20wii;聚合物為含有鄰苯二酚基團(tuán)的透明質(zhì)酸，其結(jié)構(gòu)特征如下所示：2.權(quán)利要求1所述的復(fù)合凝膠，其特征在于多孔微球?yàn)楸脚鹚岜砻婀δ芨男缘腜LGA多孔微球，利用氨基苯硼酸，對(duì)PLGA多孔微球的表面進(jìn)行改性，引入苯硼酸基團(tuán)。3.權(quán)利要求1所述的復(fù)合凝膠，其特征在于氨基苯硼酸包括鄰氨基苯硼酸、間氨基苯硼酸和對(duì)氨基苯硼酸。4.權(quán)利要求1所述的復(fù)合凝膠，其特征在于所述含有鄰苯二酚基團(tuán)的透明質(zhì)酸是，利用多巴胺對(duì)透明質(zhì)酸改性，引入鄰苯二酚基團(tuán)，制得多巴胺改性透明質(zhì)酸，多巴胺改性透明質(zhì)酸鏈段上的多巴胺接枝效率為1~50%。5.權(quán)利要求1的復(fù)合凝膠的制備方法，其特征在于包括以下步驟：(1)、將苯硼酸表面改性PLGA多孔微球分散于水中，使PLGA多孔微球水分散液的質(zhì)量濃度范圍為1~100%;(2)、將多巴胺改性透明質(zhì)酸溶解于水或者磷酸鹽的緩沖溶液中，使多巴胺改性透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度范圍為1~20%;(3)分別取PLGA多孔微球水分散液和多巴胺改性透明質(zhì)酸溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為6.5-11.5,控制溫度在4-60°C，攪拌均勻，室溫靜置，得到PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠;所制得PLGA多孔微球/多巴胺改性透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠中，多巴胺改性透明質(zhì)酸質(zhì)量含量范圍為5~20%，PLGA微球含量的質(zhì)量范圍為1~20%。6.葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)；多孔微球/聚合物復(fù)合凝可以通過(guò)注射或者微創(chuàng)手術(shù)植入體內(nèi)，在pH7.4的生理?xiàng)l件下，能夠響應(yīng)環(huán)境中葡萄糖濃度的變化，實(shí)現(xiàn)胰島素藥物的可控釋放。7.葡萄糖敏感的多孔微球/聚合物復(fù)合凝膠應(yīng)用于開(kāi)發(fā)胰島素植入凝膠長(zhǎng)效緩釋制劑?！疚臋n編號(hào)】A61K47/10GK106038478SQ201610493506【公開(kāi)日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2016年6月24日【發(fā)明人】張建華,姚丹,郭睿威,董岸杰【申請(qǐng)人】天津大學(xué)