一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法及其檢測(cè)設(shè)備的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法及其檢測(cè)設(shè)備。皮膚經(jīng)過(guò)紫外光照射后，在波長(zhǎng)為440?510nm激發(fā)光的激發(fā)下皮下會(huì)產(chǎn)生波長(zhǎng)為490?640nm的自發(fā)熒光，這種波長(zhǎng)為490?640nm的自發(fā)熒光的變化與皮膚損傷成正相關(guān)。
【專利說(shuō)明】
一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法及其檢測(cè)設(shè)備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物體自發(fā)熒光的檢測(cè)方法及檢測(cè)設(shè)備。具體來(lái)說(shuō)，涉及一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法及其檢測(cè)設(shè)備。
【背景技術(shù)】
[0002]陽(yáng)光中的紫外光是人的皮膚受到紫外光輻射損傷的主要原因，紫外光輻射對(duì)于皮膚會(huì)產(chǎn)生多種病理作用，例如皮膚紅腫，脫皮，炎癥，潰爛，以及多種皮膚疾病等，并會(huì)產(chǎn)生大量活性氧化物，造成皮下細(xì)胞的DNA損傷，加速皮膚衰老。事實(shí)上，人體皮膚衰老90 %的原因是由于紫外光照射，而紫外光誘導(dǎo)的最嚴(yán)重的疾病是皮膚癌，已有研究證明，90%以上的皮膚癌是由陽(yáng)光中的紫外光照射引起的。皮膚癌患者占所有癌癥患者中的40%，全世界每年有300多萬(wàn)新發(fā)皮膚癌病例，而皮膚癌基金會(huì)也指出，五分之一的美國(guó)人在一生中的某個(gè)階段會(huì)得皮膚癌。隨著人類工業(yè)化的進(jìn)展，大氣層中負(fù)責(zé)阻擋紫外光的臭氧層在不斷變薄，有專家曾預(yù)測(cè)，臭氧層厚度減少1%，紫外光輻射強(qiáng)度增加2%。因此，對(duì)于皮膚紫外光損傷的檢測(cè)對(duì)于人們提高皮膚的健康水平、防止皮膚癌等重大皮膚疾病的產(chǎn)生，都有著重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義和臨床價(jià)值。
[0003]而在我國(guó)，由于人口壓力巨大，診斷和就醫(yī)困難，紫外皮膚損傷尚未得到足夠的重視，往往很多皮膚受創(chuàng)患者只有受到特別強(qiáng)的皮損后才會(huì)門診就醫(yī)，而使得近年來(lái)，我國(guó)乃至于全世界紫外創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚病和皮膚癌患者數(shù)量逐漸增多。因此，有效的皮膚紫外損傷的檢測(cè)方法和手段，以及低成本便攜式的紫外損傷檢測(cè)設(shè)備，對(duì)于皮膚健康的監(jiān)測(cè)、皮膚疾病特別是皮膚癌的診斷和治療，意義重大。
[0004]現(xiàn)在臨床上皮膚紫外光損傷的診斷以皮膚科醫(yī)生目測(cè)為主，對(duì)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)依賴性強(qiáng)，且只能對(duì)較嚴(yán)重的皮膚損傷進(jìn)行評(píng)估，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)紫外光造成的積累性皮膚損傷，特別是皮膚癌變的早期診斷?，F(xiàn)有的皮膚損傷檢測(cè)儀器，只能通過(guò)紫外光在組織傳播過(guò)程中的吸收不同，對(duì)皮下進(jìn)行反射成像實(shí)現(xiàn)一個(gè)非常粗略的估計(jì)。其原理是:紫外燈照射皮膚，檢測(cè)皮膚反射回的光線，由于正常皮膚組織和受損區(qū)域?qū)饩€的吸收系數(shù)不同，將反射或散射回來(lái)的光線進(jìn)行成像，從而可以對(duì)皮膚內(nèi)黑色素、水分、脂質(zhì)的含量做一個(gè)非常粗略的估計(jì)。由于激光在組織中的傳播對(duì)于散射非常敏感，而且根據(jù)瑞利散射和彌散射原理，光子散射量與波長(zhǎng)的四次方成反比，對(duì)于紫外光這種超短波長(zhǎng)而言，其在皮膚組織的傳播受到散射的干擾已經(jīng)非常顯著，同時(shí)紫外光在正常細(xì)胞中的吸收也非常強(qiáng)烈，因此，這種反射成像會(huì)受到非常多因素的干擾，準(zhǔn)確率和重復(fù)性都非常低。對(duì)于同樣一個(gè)人而言，在不同組織，或同樣組織中的不同肌肉狀態(tài)下的測(cè)量，可能測(cè)得的結(jié)果差異已經(jīng)與紫外受損造成的差異相當(dāng)。因此，這類儀器清晰度、靈敏度差，無(wú)法檢測(cè)紫外光造成的早期皮膚損傷，對(duì)皮膚損傷及進(jìn)一步的皮膚疾病的早期檢測(cè)和預(yù)防毫無(wú)指導(dǎo)意義，在臨床上幾乎沒(méi)有應(yīng)用。特別地，對(duì)于皮膚科門診，往往只能使用光實(shí)驗(yàn)對(duì)皮膚的紫外敏感性做一個(gè)定性評(píng)估，其方法是，在一個(gè)非見(jiàn)光皮膚區(qū)域，如背部的一塊皮膚上進(jìn)行紫外光照射，然后通過(guò)這塊皮膚出現(xiàn)的紅斑面積來(lái)評(píng)價(jià)患者的皮膚紫外敏感性，既不準(zhǔn)確，也無(wú)法進(jìn)行損傷的直接檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，皮膚經(jīng)過(guò)紫外光照射后，在波長(zhǎng)為440-510nm激發(fā)光的激發(fā)下皮下會(huì)產(chǎn)生波長(zhǎng)為490-640nm的自發(fā)焚光，并且這種波長(zhǎng)為490_640nm的自發(fā)焚光的變化與皮膚損傷成正比關(guān)系；同時(shí)X射線沒(méi)有能力誘導(dǎo)該波長(zhǎng)范圍內(nèi)皮下自發(fā)熒光的增加。因此，本發(fā)明基于這一全新發(fā)現(xiàn)，突破了現(xiàn)有技術(shù)的難題設(shè)計(jì)了一種可以準(zhǔn)確地用于預(yù)測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷并且對(duì)人體無(wú)損傷的新型檢測(cè)方法和相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備。
[0006]—方面，本發(fā)明涉及一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法，包括以下步驟:
[0007](I)在實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚受到包含一定劑量紫外光的光源照射后72小時(shí)之內(nèi)，將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含一定劑量紫外光的光源照射的皮膚置于波長(zhǎng)在440-510nm范圍內(nèi)的激發(fā)光下，以激發(fā)出皮下自發(fā)熒光，其中所述劑量=紫外光功率X照射時(shí)間；
[0008](2)檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚的角質(zhì)層以下真皮層以上部位所發(fā)出的波長(zhǎng)在490-640nm范圍內(nèi)的自發(fā)熒光強(qiáng)度；
[0009](3)按照所述步驟(2)的方法，同樣檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象未受到含紫外光的光源照射的皮膚所發(fā)出的自發(fā)熒光強(qiáng)度；
[0010](4)將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度和未受到含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度相對(duì)比，獲得經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率；
[0011](5)根據(jù)所述經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率，預(yù)測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚健康狀態(tài)。
[0012]前述本發(fā)明的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的是，在實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚受到紫外光照射后的48小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè);更優(yōu)選的是，在24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
[0013]前述本發(fā)明的檢測(cè)方法中，利用激發(fā)光激發(fā)皮下自發(fā)熒光的方式包括使用普通的連續(xù)光輸出進(jìn)行激發(fā)的方式、使用電調(diào)制進(jìn)行調(diào)制激發(fā)的方式或者使用脈沖激光進(jìn)行激發(fā)的方式中的至少一種。
[0014]前述本發(fā)明的檢測(cè)方法中，激發(fā)光的波長(zhǎng)優(yōu)選為460-500nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為485_490nm的范圍內(nèi)。
[0015]前述本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所檢測(cè)的自發(fā)熒光的波長(zhǎng)優(yōu)選為500-550nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為505-530nm的范圍內(nèi)。
[0016]另一方面，本發(fā)明涉及一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備。該檢測(cè)設(shè)備可以是一種小型化的熒光探測(cè)成像設(shè)備，包括激發(fā)光源、光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)和成像系統(tǒng)。
[0017]在前述本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，所述激發(fā)光源包括能夠發(fā)出波長(zhǎng)在440-510nm范圍內(nèi)的光的單頻激光、窄帶光源或?qū)拵Ч庠粗械闹辽僖环N，并且可選擇地包括至少一個(gè)濾波片。該濾波片用于將激發(fā)光源發(fā)出的多色光過(guò)濾為所需波長(zhǎng)的單色光。
[0018]在前述本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)用于將激發(fā)光傳導(dǎo)至實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚，并且將實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚發(fā)出的自發(fā)熒光傳導(dǎo)至成像系統(tǒng)，其中激發(fā)光和自發(fā)熒光在光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分中共同傳播，并且被光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)分離。光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)可以包括用于分離激發(fā)光和自發(fā)熒光的二相色鏡，并且可選擇地包括用于調(diào)整光斑位置的一對(duì)掃描振鏡以及用于調(diào)整激發(fā)光照射深度的一對(duì)共軛透鏡。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，在前述本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備的光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)中，激發(fā)光和自發(fā)焚光在光路主軸上沿相對(duì)的方向傳播，所述二相色鏡、掃描振鏡和共軛透鏡沿主軸排列;激發(fā)光源和成像系統(tǒng)中的一個(gè)位于光路主軸上，另一個(gè)位于與主軸垂直的副軸上;二相色鏡位于主軸與副軸的交叉位置，使激發(fā)光源發(fā)出的激發(fā)光和收集的自發(fā)熒光被二相色鏡分離成直角關(guān)系，從而僅使自發(fā)熒光進(jìn)入成像系統(tǒng)。
[0020]在前述本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，成像系統(tǒng)包括熒光成像檢測(cè)器件，所述熒光成像檢測(cè)器件能夠成像波長(zhǎng)在490-640nm范圍內(nèi)的光，并且能夠計(jì)算所述光的強(qiáng)度。根據(jù)某些具體實(shí)施例，所述熒光成像檢測(cè)器件可以是光電倍增管(PMT)、雪崩二極管、光電二極管、CCD或CMOS光電探測(cè)器等。
[0021]紫外光本發(fā)明利用紫外光誘發(fā)的早期皮下自發(fā)熒光與后期皮膚損傷成正比的關(guān)系，準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)紫外光誘發(fā)的皮膚損傷程度，為預(yù)防和早期治療紫外光誘發(fā)的皮膚損傷建立了基礎(chǔ)，可以極大地減少紫外光誘發(fā)的皮膚病的患病率。同時(shí)，本發(fā)明提供的檢測(cè)設(shè)備，作為一種小型化的熒光探測(cè)成像設(shè)備，既可以在高端精密皮膚損傷與熒光重構(gòu)的醫(yī)學(xué)診斷或研究等情況下得到應(yīng)用、也可以在低端皮膚損傷醫(yī)學(xué)診斷、家庭用簡(jiǎn)易皮膚損傷等情況下得到應(yīng)用，具有性價(jià)比高、結(jié)果精確并且應(yīng)用廣泛等良好效果，非常有利于普及。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1-1為UVC照射皮膚24小時(shí)后皮下自發(fā)熒光的增加圖。
[0023]圖1-2為UVC照射皮膚24小時(shí)后皮下自發(fā)熒光的柱狀圖。
[0024]圖2為UVC損傷5天后，C57小鼠H&E染色代表圖。
[0025]圖3為UVC照射皮膚24小時(shí)后，皮下自發(fā)熒光的增加圖。
[0026]圖4為UVC照射皮膚5天后，C57小鼠H&E染色代表圖。
[0027]圖5為UVC照射皮膚5天后，皮下自發(fā)熒光與皮膚角質(zhì)化柱狀表示圖。
[0028]圖6為UVC照射皮膚5天后，C57小鼠TUNNEL染色和表皮的凋亡信號(hào)量對(duì)比圖。
[0029]圖7為UVB照射皮膚24小時(shí)后，皮下自發(fā)熒光增加圖。
[0030]圖8為UVB損傷24小時(shí)后，C57小鼠耳朵區(qū)域H&E染色代表圖。
[0031 ]圖9為UVB損傷24小時(shí)后，C57小鼠耳朵區(qū)域H&E染色代表柱狀圖。
[0032]圖10為UVB損傷24小時(shí)后，C57小鼠表皮區(qū)域H&E染色代表圖。
[0033]圖11為UVB損傷24小時(shí)后，C57小鼠表皮區(qū)域H&E染色代表柱狀圖。
[0034]圖12為UVB損傷5天后，C57小鼠耳朵區(qū)域H&E染色代表圖。
[0035]圖13為UVB損傷5天后，C57小鼠耳朵區(qū)域H&E染色代表柱狀圖。
[0036]圖14為UVB損傷5天后，C57小鼠表皮區(qū)域H&E染色代表圖。
[0037]圖15為UVB損傷5天后，C57小鼠表皮區(qū)域H&E染色代表柱狀圖。
[0038]圖16-1為同步輻射X-射線照射皮膚8小時(shí)、24小時(shí)后皮下自發(fā)熒光的不變圖。
[0039]圖16-2為同步輻射X-射線照射皮膚8小時(shí)、24小時(shí)后皮下自發(fā)熒光的柱狀圖。
[0040]圖17為UVC照射皮膚24小時(shí)后，裸鼠皮膚皮下自發(fā)熒光顯示圖。
[0041 ]圖18為UVC照射皮膚24小時(shí)后，ICR小鼠皮膚皮下自發(fā)熒光顯示圖。
[0042]圖19為用太陽(yáng)光模擬器照射皮膚6小時(shí)后，皮下自發(fā)熒光顯示圖。
[0043]圖20為UV照射人體食指皮膚，皮下自發(fā)熒光顯示圖。
[0044]圖21為本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面將通過(guò)具體描述，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0046]除非另有限定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。
[0047]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“紫外光”，其含義為波長(zhǎng)在100_400nm范圍內(nèi)的電磁輻射，包括自然產(chǎn)生的光，如太陽(yáng)光中的UVA、UVB、UVC等，以及人工產(chǎn)生的波長(zhǎng)在此范圍內(nèi)的光。本發(fā)明所指紫外光包括連續(xù)電磁輻射、脈沖電磁輻射和調(diào)制的電磁輻射等，并且對(duì)其強(qiáng)度沒(méi)有特別限定。
[0048]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷”，其含義為由紫外光照射引起的皮膚曬黑、曬傷、皮膚光老化、皮膚過(guò)敏反應(yīng)以及皮膚癌等損傷。
[0049]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“自發(fā)熒光”，其含義為生物分子在受到適當(dāng)波長(zhǎng)的激發(fā)光照射時(shí)，吸收激發(fā)光的能量進(jìn)入激發(fā)態(tài)，再退出激發(fā)態(tài)從而發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的現(xiàn)象中，所述波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。
[0050]本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“激發(fā)光”，其含義為能夠激發(fā)生物分子發(fā)生自發(fā)熒光現(xiàn)象的光，其波長(zhǎng)應(yīng)比自發(fā)熒光短。
_1]紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷后的自發(fā)熒光變化程度與皮膚損傷程度的關(guān)系
[0052]發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，確定了紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷后的自發(fā)熒光變化程度與皮膚損傷程度關(guān)系。
[0053]根據(jù)本發(fā)明，使用雄性C57小鼠或裸鼠或ICR小鼠，UVC照射的小鼠重量在15_25g范圍之間，UVB照射的小鼠重量在18-25g范圍之間。麻醉后對(duì)小鼠皮膚涂抹甘油與水的1:1溶劑，隨后進(jìn)行相應(yīng)的紫外光照射。紫外光輻射完成后，小鼠在動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，條件為22-24°C，12小時(shí)的明/暗循環(huán)，并可自由進(jìn)食取水。
[0054]一天后，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)紫外光照射的皮膚進(jìn)行無(wú)創(chuàng)成像。其后一天或五天后犧牲小鼠，取損傷皮膚組織，進(jìn)行H&E(蘇木精&伊紅染色)檢測(cè)以及TUNEL(原位末端標(biāo)記)檢測(cè)。小鼠的皮膚組織用激光共聚焦顯微鏡成像，其中激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為500_550nm。
[0055]皮膚組織的儲(chǔ)存:皮膚取出后，取出適量組織浸泡于4%多聚甲醛，用于制作石蠟切片，剩余組織用鋁箔紙包裹好，使用液氮冷凍，之后轉(zhuǎn)移到-80°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0056]皮膚組織石蠟切片:將皮膚組織浸泡4%多聚甲醛溶液24h，然后依照石蠟切片的制作方法依次浸自來(lái)水、蒸餾水、梯度酒精、二甲苯、石蠟，制作成石蠟切片。
[0057]皮膚石蠟切片的H&E染色:將石蠟切片浸二甲苯脫蠟，然后依次浸于梯度酒精、蒸餾水，蘇木素染色10分鐘，自來(lái)水流水沖洗30min，蒸餾水浸泡30s，95%乙醇1s，伊紅復(fù)染30s,70%酒精洗滌2次，依次浸梯度酒精、二甲苯，中性樹(shù)脂封片。
[0058]對(duì)染色結(jié)果拍照、量化:對(duì)上述兩種染色進(jìn)行拍照。并針對(duì)表皮角質(zhì)化厚度，表皮厚度等指標(biāo)進(jìn)行量化。
[0059]統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)按照平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式給出，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析進(jìn)行評(píng)估，P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0060]小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下所述:
[0061]圖1:UVC照射皮膚一天后，皮下自發(fā)熒光量隨紫外輻射劑量的增加而顯著增加。
[0062]圖1中的圖1-1:C57小鼠耳部經(jīng)UVC照射不同時(shí)間后，24小時(shí)后耳部皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)C3AjXd分別為對(duì)照組，照射劑量為0.3J/cm2，0.6J/cm2和
0.9J/cm2。
[0063]圖1中的圖1-2:為對(duì)耳部自發(fā)熒光的量化。*代表P值小于0.05,***代表P值小于0.001。
[0064]圖2:紫外光照射皮膚一天后，H&E染色，發(fā)現(xiàn)皮膚沒(méi)有明顯損傷。
[0065]圖3: UVC照射皮膚五天后，H&E染色，顯示一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷有相關(guān)關(guān)系，A、B、C分別為對(duì)照組、UVC照射40分鐘以及具有甘油與水1:1溶劑保護(hù)的皮膚自發(fā)熒光圖。
[0066]圖4:D、E、F為相應(yīng)的H&E染色代表圖;方框中為表皮部分。
[0067]圖5:G為熒光強(qiáng)度的量化圖;H為活性表皮厚度的量化圖，I為角質(zhì)厚度的量化圖。
[0068]由圖5可知UVC照射皮膚五天后，H&E染色，通過(guò)分析一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷的標(biāo)志，顯示出一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷有很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系:皮下自發(fā)熒光和皮膚活性表皮除角質(zhì)層以外的表皮層(其減少是皮膚損傷的標(biāo)志之一)成完全負(fù)相關(guān)關(guān)系；而皮下自發(fā)熒光和表皮角質(zhì)化(其增加是皮膚損傷的標(biāo)志之一)成完全成正相關(guān)關(guān)系；因此，本發(fā)明首次公開(kāi)了皮下自發(fā)熒光的增強(qiáng)可以作為預(yù)測(cè)未來(lái)皮膚損傷的指標(biāo)。
[0069]圖6:TUNEL染色，圖中暗色為TUNNEL陽(yáng)性信號(hào)，代表存在凋亡細(xì)胞;紫外光照射皮膚五天后，TUNEL染色顯示皮下自發(fā)熒光和表皮的凋亡信號(hào)量TUNEL信號(hào)(其增加是皮膚損傷的標(biāo)志之一)成完全正相關(guān)關(guān)系。
[0070]圖7:UVB照射皮膚一天后，皮下自發(fā)熒光隨紫外輻射劑量的增加而顯著增加，其熒光增加具體表現(xiàn)形式為出現(xiàn)圓形的熒光信號(hào)，C57小鼠耳部經(jīng)UVB照射不同劑量后，24小時(shí)后耳部皮膚的皮下自發(fā)熒光強(qiáng)度隨照射劑量的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
[0071 ]圖8和圖9: UVB損傷后24小時(shí)，C57小鼠H&E染色代表圖100倍放大，紫外光UVB波段照射皮膚一天后，H&E染色，發(fā)現(xiàn)皮膚厚度沒(méi)有明顯變化，即皮膚沒(méi)有明顯損傷。
[0072]圖10和圖11:UVB損傷后24小時(shí)，C57小鼠H&E染色代表圖20倍放大，紫外光UVB波段照射皮膚一天后，H&E染色，發(fā)現(xiàn)表皮厚度沒(méi)有明顯變化，即皮膚沒(méi)有明顯損傷。
[0073]圖12和圖13:UVB照射皮膚五天后，H&E染色，顯示一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷有相關(guān)關(guān)系;A，B，C，D圖為UVB損傷5天后H&E染色代表圖，分別對(duì)應(yīng)UVB損傷劑量為OJ/cm2，2.5J/cm2，5.0J/cm2，7.5J/cm2; E圖為耳朵厚度的量化圖；UVB照射皮膚五天后，H&E染色，分析一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷的標(biāo)志，顯示出一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷有很強(qiáng)的正比關(guān)系;皮下自發(fā)熒光量和耳朵厚度呈完全正相關(guān)。
[0074]圖14和圖15:UVB照射皮膚五天后，H&E染色，顯示一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷有相關(guān)關(guān)系;A，B，C，D圖為UVB損傷5天后H&E染色代表圖，分別對(duì)應(yīng)UVB損傷劑量為OJ/cm2，2.5J/cm2，5.0J/cm2，7.5J/cm2; E圖為表皮厚度的量化圖；UVB照射皮膚五天后，H&E染色，通過(guò)分析一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷的標(biāo)志，顯示出一天后檢測(cè)出的皮下自發(fā)熒光量和和五天后檢測(cè)出的皮膚損傷有很強(qiáng)的正比關(guān)系；皮下自發(fā)熒光量和表皮厚度呈完全正相關(guān);提示，綠色熒光的增強(qiáng)可以作為預(yù)測(cè)未來(lái)皮膚損傷的指標(biāo)。
[0075]圖16-1和圖16-2:X射線照射皮膚8小時(shí)以及一天后，皮下自發(fā)熒光量隨輻射劑量的改變沒(méi)有而顯著變化。
[0076]圖17:UVC照射裸鼠皮膚，自發(fā)熒光的變化;如圖顯示，經(jīng)過(guò)UVC照射之后，裸鼠皮膚的自發(fā)熒光也會(huì)增加。
[0077]圖18:UVC照射ICR小鼠皮膚，自發(fā)熒光的變化，如圖顯示，經(jīng)過(guò)UVC照射之后，ICR小鼠皮膚的自發(fā)熒光也會(huì)增加。
[0078]圖19:太陽(yáng)光照射人體皮膚，自發(fā)熒光的變化;如圖顯示，用太陽(yáng)光照射之后，C57皮膚的自發(fā)熒光也會(huì)增加。
[0079]圖20:UVC照射人體皮膚，自發(fā)熒光的變化;如圖顯示，經(jīng)過(guò)UVC照射之后，人體的自發(fā)熒光也會(huì)增加。
[0080]由以上實(shí)驗(yàn)可以得出，皮膚經(jīng)過(guò)紫外光(UVB和UVC)照射后，在波長(zhǎng)為440-510nm激發(fā)光的激發(fā)下皮下會(huì)產(chǎn)生波長(zhǎng)為490-640nm的自發(fā)焚光，這種波長(zhǎng)為490_640nm的自發(fā)焚光的變化與皮膚損傷成正比關(guān)系；同時(shí)X射線沒(méi)有能力誘導(dǎo)該波長(zhǎng)范圍內(nèi)皮下自發(fā)熒光的增加。因此，皮下自發(fā)熒光能夠作為預(yù)測(cè)皮膚損傷的標(biāo)志物。
[0081]本發(fā)明基于這一發(fā)現(xiàn)，建立了一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法。該方法包括以下步驟:
[0082](I)在實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚受到包含一定劑量紫外光的光源照射后72小時(shí)之內(nèi)，將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚置于波長(zhǎng)在440-510nm范圍內(nèi)的激發(fā)光下，以激發(fā)出皮下自發(fā)熒光，其中所述劑量=紫外光功率X照射時(shí)間；
[0083](2)檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚的角質(zhì)層以下真皮層以上部位所發(fā)出的波長(zhǎng)在490-640nm范圍內(nèi)的自發(fā)熒光強(qiáng)度；
[0084](3)按照所述步驟(2)的方法，同樣檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象未受到含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度；
[0085](4)將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度和未受到含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度相對(duì)比，獲得經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率；
[0086](5)根據(jù)所述經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率，預(yù)測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚健康狀態(tài)。
[0087]本發(fā)明的利用激發(fā)光激發(fā)皮下自發(fā)熒光的方式包括使用普通的連續(xù)光輸出進(jìn)行激發(fā)的方式、使用電調(diào)制進(jìn)行調(diào)制激發(fā)的方式或者使用脈沖激光進(jìn)行激發(fā)的方式中的至少一種。
[0088]在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，優(yōu)選的是，在實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚受到紫外光照射后的48小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè);更優(yōu)選的是，在24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
[0089]在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，激發(fā)光的波長(zhǎng)優(yōu)選為460-500nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為485-490nm的范圍內(nèi)。
[0090]在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所檢測(cè)的自發(fā)熒光的波長(zhǎng)優(yōu)選為500-550nm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為505-530nm的范圍內(nèi)。
[0091]本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法，根據(jù)皮下自發(fā)熒光的變化程度與皮膚損傷程度呈正比的規(guī)律，預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚損傷程度。
[0092]此外，本發(fā)明還提供了一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備。該檢測(cè)設(shè)備可以是一種小型化的熒光探測(cè)成像設(shè)備，包括激發(fā)光源、光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)和成像系統(tǒng)。
[0093]在本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，所述激發(fā)光源包括能夠發(fā)出波長(zhǎng)在440-510nm范圍內(nèi)的光的單頻激光、窄帶光源或?qū)拵Ч庠粗械闹辽僖环N，并且可選擇地包括至少一個(gè)濾波片。該濾波片用于將激發(fā)光源發(fā)出的多色光過(guò)濾為所需波長(zhǎng)的單色光。
[0094]在本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)用于將激發(fā)光傳導(dǎo)至實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚，并且將實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚發(fā)出的自發(fā)熒光傳導(dǎo)至成像系統(tǒng)，其中激發(fā)光和自發(fā)熒光在光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分中共同傳播，并且被光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)分離。光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)可以包括用于分離激發(fā)光和自發(fā)熒光的二相色鏡，并且可選擇地包括用于調(diào)整光斑位置的一對(duì)掃描振鏡以及用于調(diào)整激發(fā)光照射深度的一對(duì)共軛透鏡。
[0095]在本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備的光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)中，激發(fā)光和自發(fā)熒光在光路主軸上沿相對(duì)的方向傳播，所述二相色鏡、掃描振鏡和共軛透鏡沿主軸排列;激發(fā)光源和成像系統(tǒng)中的一個(gè)位于光路主軸上，另一個(gè)位于與主軸垂直的副軸上；二相色鏡位于主軸與副軸的交叉位置，使激發(fā)光源發(fā)出的激發(fā)光和收集的自發(fā)熒光被二相色鏡分離成直角關(guān)系，從而僅使自發(fā)熒光進(jìn)入成像系統(tǒng)。
[0096]在本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，成像系統(tǒng)包括熒光成像檢測(cè)器件，所述熒光成像檢測(cè)器件能夠成像波長(zhǎng)在490-640nm范圍內(nèi)的光，并且能夠計(jì)算所述光的強(qiáng)度。根據(jù)某些具體實(shí)施例，熒光成像檢測(cè)器件可以是光電倍增管(PMT)、雪崩二極管、光電二極管、CCD或CMOS光電探測(cè)器等。
[0097]本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備的一個(gè)具體實(shí)施例的示意圖如圖21所示。以下將通過(guò)參考圖21，詳細(xì)描述本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備。
[0098]在圖21所示的檢測(cè)設(shè)備中，主要元件沿主軸10排列，包括PMT探測(cè)器1、二相色鏡3、一對(duì)掃描振鏡4、一對(duì)共軛透鏡5和物鏡6。副軸20與主軸10垂直，部分元件沿副軸20排列，包括波長(zhǎng)488nm的小型半導(dǎo)體激光器2和二相色鏡3。明顯可以看出，二相色鏡3位于主軸10和副軸20的交叉位置。
[0099]激光器2發(fā)出的激光作為激發(fā)光，經(jīng)過(guò)小孔后由短焦距透鏡準(zhǔn)直，到達(dá)二相色鏡3并被二相色鏡3反射，進(jìn)入一對(duì)掃描振鏡4，之后經(jīng)過(guò)一對(duì)共軛透鏡5，進(jìn)入物鏡6。其中，一對(duì)掃描振鏡4可以用于調(diào)整光斑在垂直于主軸10的平面上的位置，并且一對(duì)共軛透鏡5可以用于調(diào)整激發(fā)光在主軸10上的聚焦位置，即激發(fā)光的照射深度。
[0100]經(jīng)激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的自發(fā)熒光信號(hào)由同一個(gè)物鏡6收集，經(jīng)過(guò)一對(duì)共軛透鏡5后，返回掃描振鏡4，然后直接穿過(guò)二相色鏡3，經(jīng)過(guò)濾波片濾波，而后由透鏡聚焦，和一個(gè)小孔空間濾波，最后進(jìn)入PMT探測(cè)器I進(jìn)行信號(hào)探測(cè)。
[0101]需要注意的是，根據(jù)所使用的二相色鏡3的波長(zhǎng)投射/反射性質(zhì)，探測(cè)器I和激光器2的位置也可以相互替換。位置互換后的檢測(cè)設(shè)備，也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0102]作為小型化的熒光探測(cè)成像設(shè)備，掃描振鏡3、PMT探測(cè)器I和激光器2的電路控制部分集成安裝于相應(yīng)的空間。整個(gè)系統(tǒng)的大小可以控制在30cmX 1cmX 1cm的范圍內(nèi)。
[0103]除上述元件之外，本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中還可以包含其他光學(xué)元件，例如其它波長(zhǎng)的藍(lán)紫光波段的光源，如473nm激光器，窄帶的藍(lán)光LED，具有濾色塊的汞燈等等；以及銀鏡，凸透鏡，非球面鏡，濾波片，小孔光闌，CXD，CMOS等等。
[0104]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，基于本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備的原理，可以采用其他方法和元件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備。例如，也可以通過(guò)同時(shí)使用半透半反鏡和濾波片代替二相色鏡，實(shí)現(xiàn)激發(fā)光和自發(fā)熒光的分離;對(duì)于激發(fā)光源中使用的濾波片，也可以用光柵等其它元件實(shí)現(xiàn)濾波效果;光路設(shè)計(jì)也可以不同于上述實(shí)施例，只要能夠?qū)崿F(xiàn)激發(fā)光和自發(fā)熒光的分離、并且把自發(fā)熒光傳導(dǎo)至成像系統(tǒng)即可。另外，在本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備中，出于成本的考慮和成像精度的要求，可以在光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)中省略逐點(diǎn)掃描成像所需的掃描振鏡，以及光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)中調(diào)整成像深度位置所需的共軛透鏡，從而設(shè)計(jì)具有最基本的檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的功能的檢測(cè)設(shè)備。這些修改和/或簡(jiǎn)化的檢測(cè)設(shè)備，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0105]在使用本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法時(shí)，使用激發(fā)光源發(fā)出激發(fā)光，傳導(dǎo)到實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚，采用物鏡收集皮下自發(fā)熒光，然后由二相色鏡分光，所分得的光束進(jìn)入光電倍增管或圖像傳感器中進(jìn)行檢測(cè)，得出皮下自發(fā)熒光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度。
[0106]應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法的實(shí)施并不依賴于本發(fā)明的檢測(cè)設(shè)備?？梢允褂萌魏文軌虬l(fā)出激發(fā)光并且能夠?qū)ψ园l(fā)熒光進(jìn)行檢測(cè)的設(shè)備來(lái)實(shí)施本發(fā)明的活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法。
[0107]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說(shuō)明的目的，本文描述了本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的方法，包括以下步驟: (1)在實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚受到包含一定劑量紫外光的光源照射后72小時(shí)之內(nèi)，將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚置于波長(zhǎng)在440-510nm范圍內(nèi)的激發(fā)光下，以激發(fā)出皮下自發(fā)焚光； (2)檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚的角質(zhì)層以下真皮層以上部位所發(fā)出的波長(zhǎng)在490-640nm范圍內(nèi)的自發(fā)熒光強(qiáng)度； (3)按照所述步驟(2)的方法，同樣檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象未受到含紫外光的光源照射的皮膚所發(fā)出的自發(fā)熒光強(qiáng)度； (4)將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)過(guò)含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度和未受到含紫外光的光源照射的皮膚的自發(fā)熒光強(qiáng)度相對(duì)比，獲得經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率； (5)根據(jù)所述經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率，預(yù)測(cè)所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚健康狀態(tài)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述利用激發(fā)光激發(fā)皮下自發(fā)熒光的方式包括使用普通的連續(xù)光輸出進(jìn)行激發(fā)的方式、使用電調(diào)制進(jìn)行調(diào)制激發(fā)的方式或者使用脈沖激光進(jìn)行激發(fā)的方式中的至少一種。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 在所述光源照射后的48小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 在所述光源照射后的24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述激發(fā)光的波長(zhǎng)在460-500nm范圍內(nèi)。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于: 所述激發(fā)光的波長(zhǎng)在485-490nm范圍內(nèi)。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述自發(fā)熒光的波長(zhǎng)在500-550nm范圍內(nèi)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 所述自發(fā)熒光的波長(zhǎng)在505-530nm范圍內(nèi)。9.一種活體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備，該檢測(cè)設(shè)備包括激發(fā)光源、光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)和成像系統(tǒng)，其特征在于: 所述激發(fā)光源包括能夠發(fā)出波長(zhǎng)在440-510nm范圍內(nèi)的光的單頻激光、窄帶光源或?qū)拵Ч庠粗械闹辽僖环N； 所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)用于將所述激發(fā)光傳導(dǎo)至實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚，并且將所述實(shí)驗(yàn)對(duì)象的皮膚發(fā)出的自發(fā)熒光傳導(dǎo)至所述成像系統(tǒng)，其中所述激發(fā)光和所述自發(fā)熒光在所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分中共同傳播，并且被所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)分離； 所述成像系統(tǒng)包括熒光成像檢測(cè)器件，所述熒光成像檢測(cè)器件能夠成像波長(zhǎng)在490-640nm范圍內(nèi)的光，并且能夠計(jì)算所述光的強(qiáng)度。10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于: 所述激發(fā)光源還包括至少一個(gè)濾波片； 所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)包括用于分離所述激發(fā)光和所述自發(fā)熒光的二相色鏡，用于調(diào)整光斑位置的一對(duì)掃描振鏡以及用于調(diào)整所述激發(fā)光照射深度的一對(duì)共軛透鏡。11.如權(quán)利要求10所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于: 所述激發(fā)光和所述自發(fā)熒光在所述光學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)的光路主軸上沿相對(duì)的方向傳播，所述二相色鏡、所述掃描振鏡和所述共軛透鏡沿所述主軸排列； 所述激發(fā)光源和所述成像系統(tǒng)中的一個(gè)位于所述主軸上，另一個(gè)位于與所述主軸垂直的副軸上； 所述二相色鏡位于所述主軸與所述副軸的交叉位置，使所述激發(fā)光和所述自發(fā)熒光被所述二相色鏡分離成直角關(guān)系，從而僅使所述自發(fā)熒光進(jìn)入所述成像系統(tǒng)。12.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)設(shè)備，其特征在于: 所述成像系統(tǒng)包括光電倍增管、雪崩二極管、光電二極管、CCD或CMOS光電探測(cè)器中的至少一種。
【文檔編號(hào)】A61B5/00GK105852808SQ201610178703
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月25日
【發(fā)明人】殷衛(wèi)海, 賀號(hào), 張銘超, 張潔
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)