攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及載水溶性小肽的用于鼻腔給藥的麥胚凝集素 (wheat germ agglutinin,WGA)修飾的聚合物納米粒及其制備方法和應(yīng)用，所述的水溶性 小肽是NR2B9c，相對分子量為977Da。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦卒中是危害人類健康的常見病和多發(fā)病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和 復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。腦卒中主要分為缺血性和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中為最 常見的類型，占全部腦卒中的80%左右。然而，臨床上除早期使用溶栓藥對缺血性腦卒中有 效外，迄今仍缺乏療效明確的治療藥物。因此，進(jìn)行缺血性腦卒中治療藥物的研究具有十分 重要的意義。
[0003] N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate ,NMDA)受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)非常重 要的一類興奮性氨基酸受體，其所介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性在缺血性腦損傷中起到非常關(guān)鍵 的作用。腦卒中后，NMDA受體過度激活，引發(fā)大量的Ca 2+內(nèi)流，從而觸發(fā)了興奮性毒性，通過 與NMDA受體偶聯(lián)的突觸后密集區(qū)蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)將信號傳遞 給神經(jīng)元型一氧化氮合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nN0S)，形成匪DA受體-PSD-95-nN0S三元復(fù)合物，進(jìn)而引起nNOS的超?；罨呋a(chǎn)生過量的一氧化氮（nitric oxide，NO )，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。因此，在缺血性腦卒中的治療中，NMDA受體拮抗劑、突觸 后鈣離子阻斷劑和nNOS拮抗劑都曾被寄予希望，但由于三者分別阻斷了 NMDA受體和nNOS的 正常生理功能而未能在臨床上取得成功，在抑制興奮性通路中的上下游分子均無效的情況 下，如何能既阻斷NMDA受體所介導(dǎo)的興奮性毒性，又不干擾匪DA受體的正常生理功能呢？ NMDA受體與PSD-95的解偶聯(lián)成為缺血性腦卒中治療藥物研究的新靶點(diǎn)。
[0004] 2002年Aarts M等人在Science上發(fā)表的文章中提出了一個針對匪DA受體亞型 NR2B羧基端的9個氨基酸殘基的多肽NR2B9c(KLSSIESDV)，NR2B9c可與PSD-95特異性地結(jié) 合，從而解除NMDA受體與PSD-95的偶聯(lián)，阻斷引起神經(jīng)興奮性毒性的下游信號傳導(dǎo)，但不影 響NMDA受體的正常生理功能。嚙齒類動物和類似于人類的靈長類動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明在腦 卒中發(fā)生后一個合理的時(shí)間窗內(nèi)給予NR2B9C，可產(chǎn)生長期的神經(jīng)保護(hù)作用，而且副作用小， 因此NR2B9C多肽極有可能成為一種經(jīng)臨床驗(yàn)證有效的腦卒中治療藥物。
[0005] 由于在血液和腦組織之間存在一種被稱為血腦屏障的機(jī)體天然生理防御結(jié)構(gòu)，這 使得大多數(shù)外源性物質(zhì)不能有效進(jìn)入腦部發(fā)揮生物效應(yīng)，基本上超過98%的小分子藥物不 能通過血腦屏障，而100%的大分子藥物，包括多肽、重組蛋白、基因治療相關(guān)藥物等都無法 有效穿過血腦屏障。NR2B9c作為一種水溶性多肽自然也無例外。目前有關(guān)NR2B9c的研究中， 采用的均為靜脈注射融合蛋白Tat-NR2B9c，即將NR2B9c與來自于HIV的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽Tat進(jìn)行偶 聯(lián)。Tat能將與之相連的肽段或蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入各種組織和細(xì)胞，由Tat攜帶NR2B9C雖 然可以有效的透過血腦屏障，但仍存在如下缺點(diǎn)：① Tat攜帶NR2B9C可進(jìn)入人體各種組織和 細(xì)胞，體內(nèi)分布無選擇性。②融合蛋白應(yīng)用于人類疾病的治療還有許多需要考慮的問題，尤 其是安全性方面尚不明確。源自HIV的細(xì)胞穿膜肽Tat雖然已不具感染性，但此蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 為病毒相關(guān)蛋白的核定位序列。Tat用于攜載藥物對人進(jìn)行治療時(shí)，其對人類基因表達(dá)的潛 在影響以及可能帶來的毒副作用目前還知之甚少，有待進(jìn)一步研究。例如有文獻(xiàn)報(bào)道稱細(xì) 胞穿膜肽Tat(48-60)單獨(dú)使用即可明顯降低促分裂素原活化蛋白激酶mRNA表達(dá)水平。③卒 中治療的時(shí)間窗非常關(guān)鍵，越早接受治療效果越好，而Tat-NR2B9c設(shè)計(jì)為靜脈注射給藥，必 須由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員操作，使用不便。因此，在NR2B9c治療缺血性腦卒中的研究中，如何安全 高效遞送NR2B9c入腦是亟需解決的一個關(guān)鍵問題。
[0006] 鼻腔給藥是一種實(shí)用的無創(chuàng)性腦部遞藥方式，其安全、有效、便捷，經(jīng)鼻給藥后，藥 物和載體可繞過血腦屏障通過嗅區(qū)粘膜上的嗅神經(jīng)途徑和三叉神經(jīng)途徑直達(dá)中樞神經(jīng)系 統(tǒng)，入腦迅速，全身吸收相對減少，副作用較小。鼻腦通路的存在雖然為NR2B9C等多肽蛋白 類藥物避開血腦屏障經(jīng)鼻腔直接入腦提供了可能，但像NR2B9C這類水溶性多肽，由于受到 鼻腔內(nèi)的代謝酶降解和鼻纖毛清除等因素限制，致使進(jìn)入腦部的藥量很低，無法達(dá)到臨床 上的有效劑量。具有良好生物降解性和生物安全性的聚合物聚乙二醇（polyethylene glycol ,PEG)-聚乳酸羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co_glycolic acid)，PLGA)所制備的 聚合物納米粒穩(wěn)定性好，能有效防止藥物在體內(nèi)的降解，提高藥物穩(wěn)定性。但在鼻腔停留時(shí) 間短、且缺乏對主要吸收部位嗅區(qū)粘膜的選擇性，進(jìn)入腦部能力依然有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚 合物納米粒及其制備方法，為水溶性小肽NR2B9C治療缺血性腦卒中提供一種安全有效的腦 部遞藥方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒，所述的水溶性小肽是 NR2B9c，所述的聚合物是馬來酰亞胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(Mal-PEG-PLGA)和 單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)的混合物，所述的聚合物納米粒采 用復(fù)乳法制備；該納米粒的平均粒徑為140nm，分布均勻，呈淡藍(lán)色乳光，Zeta電位約為-23mV，包封率在50 %左右，載藥量在11 %左右。
[0010]攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒的制備方法，步驟如下：
[0011] (1)、內(nèi)水相的制備：將NR2B9c溶解于水中，獲得濃度為0-35mg/ml且大于0的 NR2B9c水溶液，備用；內(nèi)水相體積為50-200yL;
[0012] (2)、油相的制備：將馬來酰亞胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物（Mal-PEG- PLGA)(便于在納米粒上接枝WGA和控制接枝比例，馬來酰亞胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共 聚物與相應(yīng)的單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物中PLGA端PLA: PGA的比例相等， PLGA端的分子量也相等，聚合物合成過程中單甲氧基聚乙二醇分子量為2000,馬來酰亞胺 聚乙二醇分子量為3500)和單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)(質(zhì)量 比1:9)溶于油相二氯甲烷中，所得聚合物濃度為15-20mg/ml，備用;Mal-PEG-PLGA和mPEG-PLGA的PLGA端中 PLA: PGA的比例以及PLGA端的分子量(Mff)為：50: 50，28000、50:50，38000、 75:25,38000;較佳型號是PLA:PGA 50:50MW 38000,較佳濃度是20mg/ml;
[0013] (3)、W/0初乳的制備：按照1: 5的體積比將內(nèi)水相加入到油相中，超聲得到W/0初 乳；
[0014] (4)、W/0/W復(fù)乳的制備：按照3: 5的體積比，將W/0初乳加入含有乳化劑的外水相 中，超聲得到W/0/W復(fù)乳；
[0015] 外水相為l%-1.5w/v%的膽酸鈉溶液，膽酸鈉發(fā)揮乳化劑作用；
[0016] (5)聚合物納米粒的制備：按照1: 5的體積比，將W/0/W復(fù)乳分散到擴(kuò)散相溶液 (0.5w/v%的膽酸鈉）中，攪拌均勻，擴(kuò)散相溶液中加入巰基化WGA，低速攪拌孵育4小時(shí)，減 壓旋蒸除有機(jī)溶劑，置超濾離心管中冷凍離心(4500rpmX30min，4°C)，即得WGA修飾的聚合 物納米粒。
[0017]攜載水溶性小肽的麥胚凝集素修飾的聚合物納米粒經(jīng)鼻腔給藥提高腦部藥物濃 度，治療腦卒中的用途。
[0018]發(fā)明人構(gòu)建了攜載水溶性多肽類藥物NR2B9c的鼻用麥胚凝集素 （wheat germ agglutinin，WGA)修飾的聚合物納米粒，制得的納米粒(nanoparticles，NPs)為類球形粒 子，外觀圓整，粒徑小，包封率約為50%，載藥量約為11 %。采用WGA修飾納米粒是利用WGA可 與鼻腔嗅區(qū)粘膜上選擇性高表達(dá)的糖基N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)特異性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞對納米粒的內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)WGA還能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的通 透性，抑制蛋白分解酶活性，且其毒性和免疫原性都很小，從而延長聚合物納米粒在嗅區(qū)粘 膜上的滯留時(shí)間，提高嗅區(qū)粘膜對聚合物納米粒的攝取率，選擇性地遞送更多的NR2B9C入 腦，增強(qiáng)其對缺血性腦卒中的預(yù)防和治療效果，降低全身性的毒副作用。
【附圖說明】
[0019]圖 1 是所得納米粒的電鏡圖；其中，（A)NR2B9c-NPs (B)NR2B9c-WGA-NPs。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0021] -、本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)材料如下：SD大鼠，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心； NR2B9c原料藥(純度2 95%，上海吉爾生化有限公司）;Mal-PEG(MW3500，北京鍵凱技術(shù)有限 公司）；mPEG(MW2000，Sigma-Aldrich ,American); WGA(MW36000，Medicago，Sweden); 2-iminothiolane hydrochloride(2-1T，Sigma-Aldrich，美國）；5，5 二硫代雙（2-硝基苯甲 酸）（DTNB，Sigma-Aldrich，美國）。
[0022] 二、聚合物納米粒的制備過程
[0023] 1、疏基化WGA的制備[Chen J，Zhang C，Liu Q，Shao X，F(xiàn)eng C，Shen Y，Zhang Q， Jiang X.Solanum tuberosum lectin-conjugated PLGA nanoparticles for nose to brain delivery.Journal ofDrug Targeting.J Drug Target 2012,20(2):174-184.]:精 密稱取WGA，溶解于0.15mol/l的硼酸鈉溶液(pH8.0)中，按WGA與2-IT摩爾比為l :60加入2-IT溶液，室溫低速攪拌l小時(shí)，過葡聚糖凝膠G25層析柱，洗脫除去小分子雜質(zhì)，收集蛋白組 分。
[0024] 2、復(fù)乳(W/0/W)法制備WGA修飾的納米粒
[0025] 將內(nèi)水相加入到含有聚合材料Mal-PEG-PLGA和mPEG-PLGA(質(zhì)量比1:9)的二氯甲 烷中，超聲得到w/ο初乳；
[0026] 將得到的初乳加入含有乳化劑的外水相中，超聲得到W/0/W復(fù)乳；
[0027] 將復(fù)乳分散到擴(kuò)散相溶液中，攪拌均勻，擴(kuò)散相溶液中加入巰基化WGA(馬來酰亞 胺聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物和巰基化WGA的質(zhì)量比為5 :1 )，低速攪拌孵育，減壓旋 蒸除有機(jī)溶劑，置超濾離心管中冷凍離心(4500rpmX 30min，4°C)，即得WGA修飾的聚合物納 米粒。
[0028]當(dāng)內(nèi)水相是含有NR2B9c的水溶液時(shí)，獲得WGA修飾載NR2B9c納米粒，當(dāng)內(nèi)水相是水 時(shí)，制得空白納米粒。
[0029] 三、性能檢測：
[0030] 1、包封率和載藥量的測定
[0031] 載藥納米粒的包封率(entrapment efficiency，EE%)和載藥量(drug loading, DL%)，見公式（1)，（2):
[0032] (I