一種口蹄疫o、a型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種既可免疫預(yù)防，又能區(qū)分自然感染 和疫苗免疫的口蹄疫〇、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD)是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生 偶蹄動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播速度快，發(fā)病率高，曾多次在 世界范圍內(nèi)發(fā)生流行性暴發(fā)，給發(fā)病地區(qū)的政治、經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。鑒于此，世界動(dòng)物衛(wèi) 生組織（OIE)將其列為必報(bào)疫病，我國(guó)規(guī)定為一類動(dòng)物傳染病。FMD的病原是口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)，屬于小RNA病毒科（Picornaviridae) 口蹄疫病毒 屬(Aphthovirus)。病毒具有七個(gè)血清型(A，0，C，Asial，SAT1，SAT2和SAT3)，型間不交叉保 護(hù)。FMDV的多型性給FMD的預(yù)防和控制帶來了巨大的困難。
[0003] 口蹄疫在我國(guó)長(zhǎng)期流行，對(duì)我國(guó)的政治、經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了嚴(yán)重的危害。據(jù)報(bào)道，我 國(guó)每年僅口蹄疫引起的損失，占所有疾病損失的38%，直接經(jīng)濟(jì)損失150~200億元，間接損 失高達(dá)400億元左右。近幾年來，我國(guó)的口蹄疫疫情發(fā)生更加頻繁，呈現(xiàn)多血清型（特別0型 和A型）和多譜系病毒共存的局面。疫苗免疫和精確區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物是 FMD防控的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但在口蹄疫滅活疫苗的制備過程中，一些游離的，以及與病毒粒 子大小相近的非結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物難以清除，他們或多或少的在疫苗中殘留，多次免疫動(dòng)物 后也能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。因此以檢測(cè)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體為金標(biāo)準(zhǔn)的鑒別診斷 技術(shù)也難以精準(zhǔn)區(qū)別疫苗免疫和自然感染動(dòng)物，這給疫病防控和活畜貿(mào)易造成了極大障 礙。
[0004] 針對(duì)上述不足，利用反向遺傳操作技術(shù)發(fā)展攜帶有特定分子標(biāo)記的鑒別診斷疫苗 成為一個(gè)新的技術(shù)途徑。國(guó)際上防制口蹄疫的成功經(jīng)驗(yàn)也顯示雙價(jià)或多價(jià)滅活疫苗對(duì)易感 動(dòng)物進(jìn)行預(yù)防接種是多血清型口蹄疫綜合防制的最有效措施之一。但是到目前為止，尚未 研制出同時(shí)預(yù)防〇、A兩型口蹄疫的標(biāo)記疫苗。因此，一種既可同時(shí)預(yù)防0、A型口蹄疫流行毒 株的攻擊，又能夠用配套的鑒別診斷方法精確區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物的0、A型雙價(jià) 口蹄疫滅活標(biāo)記疫苗的研制對(duì)于我國(guó)的口蹄疫的有效預(yù)防、控制具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種既可同時(shí)預(yù)防0、A型口蹄疫流行毒株的攻擊，又能夠用 配套的鑒別診斷方法精確區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物的雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] -種口蹄疫0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗，該標(biāo)記疫苗種毒為0型口蹄疫重組病毒rV-0/3Ad和A型口蹄疫重組病毒A/rV-2，其中，所述0型口蹄疫重組病毒rV-0/3Ad的基因組序列 為SEQ ID N0:2,該0型口蹄疫重組病毒rV-0/3Ad含3A 91-114位氨基酸的缺失，并且含有緬 甸98VP1氨基酸的編碼序列;所述A型口蹄疫重組病毒A/rV-2的基因組序列為SEQ ID N0:4， 該重組病毒含3A104-115位氨基酸的缺失。
[0008] 本發(fā)明還公開了一種口蹄疫0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗的制備方法，包括下述步驟：
[0009] (1 )0型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株的構(gòu)建：1 )0型口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒 的構(gòu)建；2)置換VPl基因和缺失3A蛋白91-114氨基酸編碼區(qū)的0型口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng) cDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建;3)拯救缺失3A蛋白91-114氨基酸編碼區(qū)的重組病毒rV-0/3Ad，作為0 型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株；
[0010] (2)A型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株的構(gòu)建：1)A型口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒 的構(gòu)建;2)缺失3A蛋白104-115氨基酸編碼區(qū)的A型口蹄疫病毒基因組全長(zhǎng)cDNA重組質(zhì)粒的 構(gòu)建;3)拯救缺失3A蛋白104-115氨基酸編碼區(qū)的重組病毒A/rV-2,作為A型口蹄疫標(biāo)記疫 苗毒株；
[0011] (3) 口蹄疫0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗的制備：1 )0型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株rV-0/3Ad 和A型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株A/rV-2的增殖培養(yǎng);2)0型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株rV-0/3Ad和A型 口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株A/rV-2的病毒含量測(cè)定及特異性檢驗(yàn);3)0型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株rV-0/3Ad和A型口蹄疫標(biāo)記疫苗毒株A/rV-2的滅活及其滅活抗原的檢驗(yàn);4)采用一步乳化法配 制口蹄疫0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗.
[0012] 在上述基礎(chǔ)上，還包括如下步驟:5) 口蹄疫0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗安全性及效力 檢驗(yàn);6)利用0、A型雙價(jià)標(biāo)記疫苗進(jìn)行多次免疫與鑒別診斷。
[0013] 優(yōu)選地，所述口蹄疫0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗的配制步驟具體為:采用一步乳化 法，即先配制佐劑，取疫苗佐劑加入到乳化器中，邊攪拌邊緩慢加入已滅活的抗原，該抗原 包含已滅活的0型口蹄疫抗原rV-0/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2，待抗原和佐劑攪勻后，一 次性通過均質(zhì)機(jī)乳化成油乳劑疫苗，即為〇、A雙價(jià)口蹄疫滅活標(biāo)記疫苗。
[0014] 優(yōu)選地，疫苗佐劑和已滅活抗原按照體積比為1:1，其中，該已滅活抗原由等重量 已滅活的〇型口蹄疫抗原rV-0/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2混合而成。
[0015] 研究結(jié)果表明，本發(fā)明提供的0、A型雙價(jià)滅活標(biāo)記疫苗既可以預(yù)防0、A型口蹄疫流 行毒株的攻擊，又能夠準(zhǔn)確區(qū)分免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物，在口蹄疫免疫預(yù)防與疫情控制、 進(jìn)出口動(dòng)物及其肉制品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域具有重要的市場(chǎng)價(jià)值和指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0016] 圖1.為FMDV 0ZK/93-08株全基因組PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（1.DL5000DNA marker; 2 · ZlPCR片段;3 · Z2PCR片段;4 · Zl和Z2PCR融合片段;5 · Z3PCR片段;6 · Z4PCR片段）。
[0017] 圖2為FMDV 0ZK/93-08株基因組全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建策略示意圖。
[0018] 圖3顯示了重組質(zhì)粒pOMQ-Zl 234D轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞60h后引起的CPE (A:正常BHK細(xì)胞， B:出現(xiàn)CPE的BHK細(xì)胞）。
[0019] 圖4為拯救病毒rV-0/3Ad與0ZK/933A蛋白氨基酸的比對(duì)。
[0020] 圖5為拯救病毒rV-0/3Ad與0ZK/93VP1蛋白氨基酸的比對(duì)。
[0021 ]圖6為間接免疫熒光檢測(cè)拯救病毒在BHK上的復(fù)制。
[0022] 圖7顯示了FMDV A/GDMM/CHA/2013株全基因組PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 (1 · DLl2000DNA marker; 2 ·AlPCR片段；3 ·A2PCR片段;4 ·Al和A2PCR融合片段；5 ·A3PCR片段； 6.八4?0?片段）。
[0023] 圖8顯示了FMDV A/GDMM/CHA/2013株全長(zhǎng)cDNA分子克隆的構(gòu)建策略。
[0024] 圖9顯示了重組質(zhì)粒pQAGD/3A104-115轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞60h后引起的CPE(A:出現(xiàn) CPE的BSR/T7細(xì)胞，B:正常BSR/T7細(xì)胞）。
[0025] 圖10為標(biāo)記病毒A/rV-2和A/⑶MM/CHA/2013病毒3A蛋白氨基酸的比對(duì)圖。圖11為 重組病毒的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 一、0型FMDV標(biāo)記疫苗毒株的構(gòu)建
[0029] 1、FMDV 0ZK/93-08株基因組全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建
[0030] 根據(jù)FMDV 0ZK/93-08全基因組序列設(shè)計(jì)下列寡核苷酸引物，由上海桑尼有限公司 合成。（FMDV 0ZK/93-08毒株在農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保藏，公眾可通過農(nóng)業(yè) 部獸醫(yī)局批示的委托函獲得）。
[0031] 表1構(gòu)建FMDV 0ZK/93-08株全長(zhǎng)cDNA克隆的引物
[0033] 提取FMDV 0ZK/93-08株(購(gòu)買自國(guó)家農(nóng)業(yè)部指定的口蹄疫病毒保藏機(jī)構(gòu)國(guó)家口蹄 疫參考實(shí)驗(yàn)室）的總RNA，用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物分別反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 體系見表2。
[0034]表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
[0036] 反應(yīng)條件:離心混勻后，42°C水浴lh，置_20°C冰箱中備用。
[0037] 以合成的第一鏈cDNA為模板，用4對(duì)引物Ζ1/Ζ1-2、Ζ2/Ζ2-2、Ζ3/Ζ3-2和Z4/Z4-2,分 別擴(kuò)增獲得0ZK/93-08病毒全基因組4個(gè)相互重疊的cDNA片段，分別命名為Z1、Z2、Z3和Z4 (見圖I)，擴(kuò)增體系見表3。
[0038] 表3 PCR擴(kuò)增體系
[0041 ]擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性Imin后，98°C20min，68°Clmin/lkb，30個(gè)循環(huán)后，72°C 8min〇
[0042]純化回收Zl和Z2片段，并以回收的這兩個(gè)片段為模板，用引物Z1/Z2-2進(jìn)行融合 PCR，得Z12片段(見圖1)212片段與pMD20-T載體(大連寶生物生物有限公司）連接，得到重 組質(zhì)粒PMD-Z12DPMD-Z12和pBluescript II SKhdv質(zhì)粒載體（（pBluescriptSKhdv載體在文 獻(xiàn)"《華北農(nóng)學(xué)報(bào)》2010年第25卷第3期，曹偉軍，李平花，白興文等，口蹄疫病毒0/HN/93疫苗 株的拯救及病毒活性鑒定"中