新型免疫刺激方法
【專利說(shuō)明】
[0001 ] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01180051461.6,申請(qǐng)日為2011年9月22日，發(fā)明名稱為"新型 免疫刺激方法"的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及一種用于在受試者引起固有免疫應(yīng)答的新方法，所述方法設(shè)及包含 TLR2激動(dòng)劑的TLR2部分(moiety)的使用。
【背景技術(shù)】
[0003] 甲型流感病毒（IAV)感染每年誘發(fā)高達(dá)十億例感染和300，000-500，000人死亡，并 且2009年全球爆發(fā)的豬HlNl已經(jīng)凸顯了可W用來(lái)應(yīng)對(duì)大流行性流感（pandemic influenza)的有限的抗病毒方案。雖然疫苗可W用來(lái)對(duì)抗季節(jié)性IAV流行，但是運(yùn)些疫苗誘 導(dǎo)了對(duì)抗IAV總是演化的神經(jīng)氨酸酶和血凝素表面蛋白的抗體，因而需要每年的重新配制 (re-formulation)和施用。此外，運(yùn)些疫苗通常無(wú)法有效地對(duì)抗由新近出現(xiàn)的病毒引起的 大流行性爆發(fā)?？晒┻x擇的方法旨在祀向IAV的保守的（conserved)內(nèi)部區(qū)域。然而，最近的 豬甲型流感病毒HlNl的大流行性爆發(fā)已經(jīng)引導(dǎo)探尋去發(fā)現(xiàn)對(duì)抗大流行性流感的廣譜疫苗 和抗病毒方案。
[0004] 本發(fā)明設(shè)及治療流感W及其他感染性疾病和癌癥的新方法的開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種通過(guò)在受試者中引起固有免疫應(yīng)答來(lái)治療或預(yù) 防疾病的方法，所述方法包含為受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含溶液中的 化R2部分，其特征在于所述化R2部分包含化R2激動(dòng)劑并且其特征在于所述疾病不是通過(guò)針 對(duì)所述TLR2部分的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答治療或預(yù)防的。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種用于治療或預(yù)防由感染原（infectious agent) 引發(fā)的疾病的方法，所述方法包含為有其需要的受試者施用有效量的組合物，所述組合物 包含溶液中的化R2部分，其特征在于所述化R2部分包含化R2激動(dòng)劑并且其特征在于所述 TLR2部分不誘導(dǎo)針對(duì)所述感染原的特異的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答。
[0007] 本發(fā)明的第=個(gè)方面提供了一種通過(guò)在受試者中引起固有免疫應(yīng)答來(lái)治療或預(yù) 防癌癥的方法，所述方法包含為受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含溶液中 的化R2部分，其特征在于所述化R2部分包含化R2激動(dòng)劑并且其特征在于所述化R2部分不誘 導(dǎo)針對(duì)所述癌癥的特異的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了一種藥物組合物，其包含有效量的溶液中的化R2部分 和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，所述藥物組合物通過(guò)在受試者中引起固有免疫應(yīng)答來(lái)治 療或預(yù)防疾病，其特征在于所述化R2部分包含化R2激動(dòng)劑并且其特征在于所述疾病不是通 過(guò)針對(duì)所述TLR2部分的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答治療或預(yù)防的。
[0009] 本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了有效量的溶液中的化R2部分在制備用于治療或預(yù)防 受試者中疾病的藥物中的用途，其特征在于所述化R2部分包含化R2激動(dòng)劑，其特征在于所 述化R2激動(dòng)劑在受試者中引起固有免疫應(yīng)答并且其特征在于所述疾病不是通過(guò)針對(duì)所述 TLR2部分的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答治療或預(yù)防的。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1A-1B顯示了脂膚疫苗候選物的示意圖。Pam2切S-基構(gòu)建體(construct)的示意 圖。圖1A:聚乙二醇化化1112切3(化1]12〔73斗6611)由通過(guò)兩個(gè)絲氨酸偶聯(lián)至^--聚乙二醇 (undecaethyleneglycol)(聚乙二醇，PEG)的單一的Pam2切s分子組成。圖1B:基于Pam2切s 的脂膚疫苗候選物由通過(guò)單一的賴氨酸化)殘基連接的祀標(biāo)CD8+T細(xì)胞表位和輔助性T表位 (T helper epitope)組成。Pam2切S脂質(zhì)部分通過(guò)兩個(gè)絲氨酸殘基（Ser)附加 W形成支鏈的 膚結(jié)構(gòu)。
[00川圖2A-^顯示了脂膚的鼻內(nèi)施用拓展了肺細(xì)胞種群。采用25nmol的0T2-P2C-濁498-日0日脂膚或25nmo 1的膚0T2-濁498-加日（不具有Pam2Cy S)對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)接種并在 指定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行肺細(xì)胞種群的表征(n = 3/組/時(shí)間點(diǎn)）。圖2A顯示了肺細(xì)胞的總數(shù)。符號(hào) 代表平均細(xì)胞計(jì)數(shù)并且誤差條表示SEM，# = P<0.01對(duì)比第0天。圖2B顯示了肺細(xì)胞的組成。 每個(gè)條代表平均細(xì)胞計(jì)數(shù)(n = 3)并且誤差條表示SD，* = P<0.05對(duì)比第0天的細(xì)胞種群。使 用單因素 ANOVA分析和事后(post-hoc)Dunnett氏多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)得 到類似結(jié)果。
[001引圖3A-3B顯示了基于Pam2切S的脂膚提高了 IAV的清除。圖3A采用生理鹽水、IAV-LP (含有IAV-衍生的表位)或非IAV-LP對(duì)小鼠進(jìn)行接種并在脂膚接種后的第3天化方圖）或第 7天(下方圖）采用IO4'Spfu的Mem7UH3Nl)流感病毒(n = 3-5/組)挑戰(zhàn)（challenge)。在感染 的第5天評(píng)估肺病毒滴度（lung virus tihe)并且顯示出針對(duì)BALB/c小鼠（?) X57BL/6小 鼠（□)和扭陽(yáng)小鼠（O)的肺病毒滴度。符號(hào)代表從單個(gè)小鼠中獲得的滴度并且線表示該組 的平均病毒滴度。圖3B在脂膚組上顯示了相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組的病毒清除百分比。在LP 接種后第7天，從采用Mem71挑戰(zhàn)的巧7BL/6小鼠中檢測(cè)到IAV-特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在挑 戰(zhàn)的第5天，使用針對(duì)IFN-丫和TNF-a的細(xì)胞內(nèi)染色分析法從脾臟中檢測(cè)到PA224-23廠特異性 CD8 + T細(xì)胞。條形圖表示每組中的平均細(xì)胞因子-特異性應(yīng)答和誤差條表示SD"* = P< 0.05，*沖<0.01對(duì)比生理鹽水(單因素 ANOVA分析和事后Dunnett氏多重比較檢驗(yàn)。
[0013] 圖4A-4D顯示了基于Pam2切S的脂膚降低了高致病性IAY感染的影響。圖4A-4B:顯 示了采用生理鹽水、IAV-LP或非IAV-LP(n = 5/組)鼻內(nèi)接種并在7天后采用化N1PR8病毒挑 戰(zhàn)的C57BL/6小鼠（左手邊)和H皿小鼠（右手邊）的存活的Kaplan-Meier曲線。圖4C-4D:感染 后的體重變化。符號(hào)表示平均值并且誤差條表示SEM。兩種小鼠品系的獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中反 映了運(yùn)些結(jié)果。
[0014] 圖5顯示了 Pam2切S對(duì)肺細(xì)胞因子的環(huán)境。為C57BL/6小鼠施用20nmol的Pam2切S- 陽(yáng)Gii(P2C-PEGii)或50山的生理鹽水（i.n)并且在施用后的第3天(D3)或第7天(D7)使用抓? 流式微球分析法測(cè)定支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的細(xì)胞因子濃度。條形圖表示各組(n = 3) 的平均應(yīng)答并且誤差條表示SD，* = P<0.05;** = P<0.0 l;林* =八0.0 Ol對(duì)比生理鹽水組和 未處理CNaiVe.)姐(單因素 ANOVA分析和事后T址ey氏多重比較檢驗(yàn)）。
[001引圖6顯示了 Pam2切S介導(dǎo)病毒清除。采用生理鹽水或20nmol的Pam2切S-PEGii對(duì)小鼠 進(jìn)行接種并在之后的第1(上方圖）、3(中部圖）或7(下方圖）天采用104'5pfu的Mem7UH3Nl) 病毒(n = 3-5/組)挑戰(zhàn)。在感染的第5天評(píng)估BALB/c小鼠（?) X57BL/6小鼠（□)和H皿小鼠 (O)中的病毒滴度。符號(hào)代表從單個(gè)小鼠中獲得的滴度并且線表示該組的平均病毒滴度，* = P<0.05對(duì)比生理鹽水(未配對(duì)學(xué)生t-檢驗(yàn)）。相對(duì)于生理鹽水組的病毒清除百分比表示為 Pam2Cys 應(yīng)答。
[0016] 圖7顯示了鼻內(nèi)Pam2Cys施用拓展了肺中的細(xì)胞亞種群。為巧7BL/6小鼠施用 20nmol的聚乙二醇化Pam2切s(P2C-PEGii)或SOiil的生理鹽水（i.n)并且在施用后72小時(shí)進(jìn) 行肺細(xì)胞種群的表征。條形圖代表各組的平均應(yīng)答(n = 3)并且誤差條表示SD，* = P<0.05; 對(duì)比對(duì)照組(未配對(duì)學(xué)生t-檢驗(yàn)）。
[0017] 圖8顯示了 Pam2切S預(yù)防了劇毒性IAV感染。采用生理鹽水或20nmol的聚乙二醇化 Pam2切S (P2C-陽(yáng)Gii)對(duì)巧7BL/6小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)接種(n = 5/組)并且在7天后采用20化化化Nl PR8病毒挑戰(zhàn)。一組小鼠接受20nmol的P2C-PEG11并且在72小時(shí)后進(jìn)行挑戰(zhàn)。感染后的體重變 化顯示為原始重量的百分比。符號(hào)表示平均值并且誤差條表示沈M。獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中反映 了運(yùn)些結(jié)果。
[0018]圖9顯示了 Pam2切S預(yù)防法降低了病毒載量（load)和流感的接觸傳播。采用生理鹽 水（白條)或20nmo 1的聚乙二醇化Pam2切S (P2C-PEG11)(灰條)對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行接種并且在 7天、5天、72小時(shí)或24小時(shí)后采用104' 5pfu的Udorn化3N2)病毒進(jìn)行挑戰(zhàn)(n = 2/組）。運(yùn)些小 鼠被指定為傳播者（spreader)小鼠。在挑戰(zhàn)后的二十四小時(shí)，使傳播者小鼠與未處理的 (naive)接受者(recipient)小鼠合居（co-house)。在合居24小時(shí)之后，取出傳播者小鼠并 取出鼻甲、氣管和肺并測(cè)定病毒滴度(上方圖）。暴露于傳播者小鼠之后3.5天收獲來(lái)自于接 受者小鼠的器官并評(píng)估病毒滴度(下方圖）。白色或灰色的箭頭表示從各個(gè)處理組到合居的 接受者的成功的接觸介導(dǎo)的傳播。
[0019] 圖10顯示了陽(yáng)G-Pam2切S在鼻內(nèi)遞送時(shí)W單一齊幢預(yù)防了IAV。經(jīng)鼻內(nèi)（i .n)、皮下 (S.C)或靜脈內(nèi)Q .V)途經(jīng)為小鼠預(yù)防性施用陽(yáng)G-Pam2切s(20nmol)并且在3天后采用致死 劑量的PR8病毒進(jìn)行挑戰(zhàn)。然后在PR8之后對(duì)小鼠的體重和存活進(jìn)行為期8天的監(jiān)測(cè)并在人 道終點(diǎn)化umane end-point)處死。
[0020] 圖11A-11B顯示了幾個(gè)化m2切S變體還賦予了對(duì)抗IAV挑戰(zhàn)的保護(hù)。通過(guò)鼻內(nèi)途經(jīng) 為小鼠預(yù)防性施用20皿〇1的含有構(gòu)建體的各種Pam2切S并且在3天后采用致死劑量的PR8病 毒進(jìn)行挑戰(zhàn)。然后在PR8之后對(duì)小鼠的體重（圖11A)和存活（圖11B)進(jìn)行為期8天的監(jiān)測(cè)。當(dāng) 與每一個(gè)其他的處理組比較時(shí)，生理鹽水組中看到的體重降低是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的（P< 0.01)。
[0021 ] 圖12A-12B顯示了當(dāng)W重復(fù)的劑量給出時(shí)，PEG-Pam2切S是有效的。為Ba化/c小鼠 施用單劑量的PEG-化m2切S，或者施用相隔S周的兩個(gè)劑量的PEG-Pam2切S，然后在第二劑 量的3天后采用PR8進(jìn)行挑戰(zhàn)。然后在挑戰(zhàn)之后對(duì)小鼠的體重和存活進(jìn)行為期8天的監(jiān)測(cè)并 且在PR8之后第7天處死小鼠用于評(píng)估肺病毒載量。當(dāng)與每一個(gè)其他的處理組比較時(shí)，生理 鹽水組中看到的體重降低是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的(P<0.01)(圖12A)。采用陽(yáng)G-Pam2切S處理 的小鼠中的病毒載量基本上低于僅接受生理鹽水的小鼠中的病毒載量(圖12B)。
[0022] 圖13顯示了較低劑量的陽(yáng)G-Pam2切S也是有效的。采用2、5和10nmol(c.f.20nmol) 的較低劑量的PEG-Pam2Cys對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)防性處理并且在3天后采用致死劑量的PR8病毒進(jìn) 行挑戰(zhàn)。在挑戰(zhàn)之后對(duì)小鼠的體重變化和存活進(jìn)行為期18天的監(jiān)測(cè)并在人道終點(diǎn)處死。生 理鹽水組中的小鼠在PR8挑戰(zhàn)之后沒(méi)有存活超過(guò)8天。
[0023] 圖14A-14B顯示了對(duì)抗IAV挑戰(zhàn)的保護(hù)不依賴于IFN-丫或1型干擾素（即IFN-a)。為 缺乏IFN- 丫（B6. IFN- 丫 -/-)(圖14A)或1型干擾素受體(IFNAR-/-)(圖14B)的小鼠預(yù)防性施 用20皿〇1的陽(yáng)G-Pam2Cys(i.n)并且在3天后采用致死劑量的PR8病毒進(jìn)行挑戰(zhàn)。運(yùn)些小鼠預(yù) 防了與PR8感染有關(guān)的重量降低和致死性。在第5天處死B6. IFN-丫-/-群體，此時(shí)生理鹽水 組達(dá)到人道終點(diǎn)時(shí)。
[0024] 圖15顯示了陽(yáng)G-Pam2切S作為治療劑是有效的。采用104'中即的Udorn病毒對(duì)Ba化/ C小鼠進(jìn)行i . n挑戰(zhàn)并在4小時(shí)后施用20nmol的陽(yáng)G-Pam2切S(i . n)。兩天后，處死動(dòng)物并測(cè)定 鼻、口咽、氣管和肺中的病毒載量