一種納米粒子基因組合藥物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及到一種納米粒子基因組合藥物及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤(癌癥)是人類的重大疾病，加強(qiáng)新型抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)具有十分 重要的意義。全球現(xiàn)有惡性腫瘤患者超過2200萬人，每年新診患者達(dá)1010萬人，每年死于腫 瘤超過620萬例。我國現(xiàn)有惡性腫瘤患者至少300至400萬人，每年新診患者超過160萬人，年 死亡人數(shù)超過130萬。隨著我國經(jīng)濟(jì)和社會的快速發(fā)展、平均壽命的延長、飲食結(jié)構(gòu)和環(huán)境 因素的改變，腫瘤發(fā)病率和死亡率呈迅速上升趨勢，疾病譜也發(fā)生了重大變化，目前在農(nóng)村 地區(qū)人口腫瘤居死因第三位（107.1/10萬人），而在城市人口死因中已位居第一（126.0/10 萬人）。手術(shù)、放療和化療是腫瘤的常規(guī)治療手段。手術(shù)、放療只適合于局部發(fā)生的腫瘤;對 已發(fā)生轉(zhuǎn)移的中晚期腫瘤，細(xì)胞毒性化療藥物仍是一線治療方案;然而，長期以來，常規(guī)化 療藥物一直存在毒副作用大，病人耐受性差，長期使用引起賴藥性等等問題;而對一些對化 療藥物不敏感的腫瘤類型，患者還處于無藥可治的狀態(tài)。因此，開發(fā)低毒、高效及腫瘤靶向 性特性的抗癌治療技術(shù)，成為當(dāng)前研究及治療的重點(diǎn)。
[0003] 腫瘤的基因治療是當(dāng)前腫瘤生物治療研究的熱點(diǎn)之一。它是利用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳物 質(zhì)(DNA，RNA)到機(jī)體細(xì)胞，通過表達(dá)治療基因或者調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，特異性的干 涉腫瘤組織的生長、發(fā)育而達(dá)到抑制或者清除腫瘤的目的。除了具有靶點(diǎn)明確，低毒、病人 易耐受的生物藥物的優(yōu)點(diǎn)之外，基因藥物與蛋白藥物相比還擁有以下優(yōu)點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)導(dǎo)基因進(jìn) 入人體細(xì)胞后，完全利用細(xì)胞自身的蛋白轉(zhuǎn)錄及修飾系統(tǒng)產(chǎn)生治療蛋白與生理蛋白功能更 接近;2、可通過對編碼基因開放讀碼框架中轉(zhuǎn)錄元件的分子生物學(xué)改造，實(shí)現(xiàn)持續(xù)、高效及 組織細(xì)胞特異性的治療蛋白表達(dá);3、針對腫瘤患者的個(gè)體化差異，設(shè)計(jì)治療基因，制作工藝 簡單，可以實(shí)現(xiàn)快速有針對性的患者個(gè)體化治療。自1990年第一個(gè)基因治療藥物被美國FDA 批準(zhǔn)進(jìn)行臨床測試以來，在歐美國家已經(jīng)有超過1000個(gè)基因治療方案在進(jìn)行臨床測試，其 中60%是用于治療腫瘤。多個(gè)治療基因在臨床測試中顯示了明確的抗腫瘤功效;或者聯(lián)合 化療、放療使用，減少化其毒副作用，提高病人的可耐受性。已經(jīng)被臨床測試的基因包括:抑 癌基因、腫瘤免疫治療基因、抗血管生成基因、致死基因等等。然而，迄今為止，沒有一個(gè)基 因藥物被歐美國家批準(zhǔn)進(jìn)入市場。缺乏高效、安全的基因藥物傳遞技術(shù)是限制基因治療臨 床應(yīng)用的一個(gè)主要問題。
[0004] 病毒載體是當(dāng)前基因治療使用的主流載體?；谂c生倶來、結(jié)構(gòu)精巧的基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 系統(tǒng)，這些人工重組病毒顯示了高的基因轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)秀的生物相容性。然而，1999年逆錄 病毒基因治療導(dǎo)致兩個(gè)兒童患者產(chǎn)生細(xì)胞惡變的事件，使人們對基因組整合性病毒載體的 生物安全性問題產(chǎn)生了質(zhì)疑!非病毒基因傳遞技術(shù)是近年發(fā)展的新興基因傳遞技術(shù)。它主 要是使用正電子聚合物（polymer)通過靜電相互作用，包裹和濃縮長鏈的基因（DNA或者 RNA)藥物形成粒子，以避免基因藥物的降解及促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。與病毒載體相比較，非病毒 載體具有生物安全性好、制作簡單、成本低、免疫原性小，而且容易進(jìn)行化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)?；?于這些優(yōu)勢，非病毒載體得到基因治療學(xué)家愈來愈多的關(guān)注。近十年來，眾多的化學(xué)生物學(xué) 家合成了大量的非病毒載體，包括:多種脂質(zhì)體及其衍生物;多種多聚亞胺(PEI)、多聚賴氨 酸(PLL)，Dentrimers,殼聚糖(Chitosan)及其衍生物等等。然而，商業(yè)提供的基因轉(zhuǎn)染試劑 還存在毒性大、只適合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、缺乏腫瘤靶向性等等，遠(yuǎn)不能適應(yīng)臨床基因治療應(yīng)用需 求。
[0005] 腫瘤靶向性納米基因藥物傳遞技術(shù)主要是通過納米載體材料及工程技術(shù)，將治療 基因制作成納米級（1-100納米)的藥物粒子，通過對納米顆粒大小及形態(tài)的控制，表面的修 飾及腫瘤靶向性配體的嫁接，而實(shí)現(xiàn)基因藥物腫瘤靶向性傳遞的技術(shù)方法。納米粒子腫瘤 靶向性的生理基礎(chǔ)是腫瘤血管的結(jié)構(gòu)特征。腫瘤是高度異質(zhì)性的組織，其血管內(nèi)皮細(xì)胞之 間的間隙常大于100納米，且基底膜不健全、缺少血管外周組織，有利于100納米左右的納米 粒子通過和滲透;而正常的組織血管內(nèi)皮間隙為5-10nm，可阻止粒徑較大的粒子滲透和通 過，減少正常細(xì)胞對抗癌藥物的吸收，降低其毒副反應(yīng);其次，腫瘤組織淋巴回流系統(tǒng)發(fā)育 不完善，有的甚至缺乏淋巴組織，導(dǎo)致滲透到腫瘤組織的納米粒子不容易被排泄，這被稱為 腫瘤的延長稽留效應(yīng)(ER)。要順利到達(dá)腫瘤組織，納米粒子還需克服機(jī)體的幾個(gè)生理限制， 包括：網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬、清除，脾竇、肝竇的血液過濾作用等。納米粒徑大小及表面修 飾是克服這些生理障礙的關(guān)鍵因素。常規(guī)來說，粒徑小于5nm容易從腎臟排出，微米級粒子 會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，大于200nm粒子常常不能透過肝竇或者脾竇。除了粒徑以外，納米 粒子表面親水性修飾及電荷特性也影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對納米粒子的識別和清除。常規(guī)來 說，經(jīng)親水性阻滯劑修飾，或者表面電荷低的納米粒子，能避開體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識別及 清除，延長藥物粒子體內(nèi)的血液循環(huán)半衰期，增加腫瘤組織的靶向聚集。在納米粒子聚集到 腫瘤以后，增加腫瘤細(xì)胞的吸收也是提高藥效的關(guān)鍵。通過連接腫瘤細(xì)胞特異性配體到納 米粒子，使其通過受體配體調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可以增加腫瘤細(xì)胞對藥物 的吸收。
[0006] 抗血管生成是廣泛使用的抗實(shí)體瘤生物治療方案。常規(guī)來說，當(dāng)腫瘤體積較小時(shí)， 腫瘤細(xì)胞可以通過滲透作用獲取其生長所需的營養(yǎng)。當(dāng)腫瘤直徑超過滲透限制時(shí)（l-2mm)， 腫瘤血管生成將會發(fā)生。此后，其將促進(jìn)或加快實(shí)體瘤的生長，并為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供通道。 自上世紀(jì)70年代Folkman等人開啟抗腫瘤血管研究以來，大量的血管生成抑制物已經(jīng)被發(fā) 現(xiàn)和報(bào)道，它們可以被歸納為外源性和內(nèi)源性抗血管生成抑制劑兩類。外源性抗血管生成 抑制劑主要是一些具有蛋白酶抑制功能的小分子化合物，其抗血管生成作用明顯，同時(shí)毒 副作用也很大。而內(nèi)源性抗血管生成因子毒副作用較小，但是，要達(dá)到治療效果，通常需要 持續(xù)反復(fù)的給藥。一些抗血管生成的靶點(diǎn)藥物已經(jīng)被多個(gè)國家批準(zhǔn)開展臨床實(shí)驗(yàn)，但是療 效不如預(yù)期。最近的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)一個(gè)血管生成通路被抑制后，腫瘤細(xì)胞可以建立其它的通 路，誘導(dǎo)新的血管生成；抑制腫瘤血管生成導(dǎo)致腫瘤缺氧，可誘發(fā)腫瘤干細(xì)胞的活化，從而 引起腫瘤復(fù)發(fā)。這些可能是抗血管生成抑制劑臨床療效欠佳的主要原因。
[0007] Endostat in是一種膠原XVIII來源的內(nèi)源性抗血管生成因子，它通過干涉FGF2， VEGF，TN調(diào)控的分子信號通路，封閉integrin受體，抑制金屬基質(zhì)蛋白酶的活性等機(jī)制，發(fā) 揮廣譜的抗血管生成作用，抑制腫瘤的生長與侵襲。在我國，以血管內(nèi)皮抑素 Endostatin為 母體的抗血管生成多肽藥物(恩度）已獲批準(zhǔn)臨床應(yīng)用。但是，這種多肽要達(dá)到有效治療濃 度需要多次反復(fù)給藥，導(dǎo)致治療費(fèi)用較高。使用基因療法，轉(zhuǎn)導(dǎo)Endostatin治療基因到組 織，利用患者細(xì)胞自身來表達(dá)和釋放治療基因，可有效克服這一問題。近年來，以病毒為載 體的Endostatin基因療法也在多個(gè)國家開展臨床試驗(yàn)，但至今未有相關(guān)藥物獲批上市。其 主要的原因是，常規(guī)病毒載體具有較高的免疫原性，易被機(jī)體清除，而且也缺乏腫瘤靶向 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種安全、高效、長效的納米粒子基因組合藥 物及其應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的一種納米粒子基因組合藥物，所述納米粒子基因組合藥物為聚合物 載體和表達(dá)治療基因的質(zhì)粒自組裝而成的納米粒子;所述聚合物載體為環(huán)糊精-聚乙烯亞 胺-聚乙二醇-葉酸四元組裝式聚陽離子載體;所述表達(dá)治療基因的質(zhì)粒為包含編碼內(nèi)皮抑 素蛋白DNA序列的真核表達(dá)質(zhì)粒。
[0010] 本發(fā)明所述的一種納米粒子基因組合藥物，所述四元組裝式聚陽離子載體的結(jié)構(gòu) 式選自式1或式2;所述式1的結(jié)構(gòu)式具體為：
[0012]所述式2的結(jié)構(gòu)式具體為：
[0014]式1或式2中，η為環(huán)糊精-聚乙烯亞胺-葉酸-聚乙二醇的單元結(jié)構(gòu)數(shù)目，取值范圍 5-10，ml為聚乙烯亞胺中的仲氨基單元結(jié)構(gòu)數(shù)目，取值為4-8，m2為聚乙烯亞胺中的叔氨基 單元結(jié)構(gòu)數(shù)目，取值為2-5，L為聚乙二醇中氧乙燒單元結(jié)構(gòu)數(shù)目，取值范圍42-105。
[0015] 本發(fā)明所述的一種納米粒子基因組合藥物，所述表達(dá)治療基因的質(zhì)粒為PhEFl-HTLV-Igk-Endostatin_SV40，通過編碼人Endostatin的DNA模板從pBLAST42_hEndo XVIII Sequence中擴(kuò)增后再亞克隆到phEFl-HTLV-Igk-XXX_SV40質(zhì)粒制得。
[0016] 本發(fā)明所述的一種納米粒子基因組合藥物，所述phEFl-HTLV-Igk-XXX-SV40包括： 1)雜交啟動子:人延伸因子-Ia啟動子和人T細(xì)胞白血病病毒的5'非轉(zhuǎn)錄區(qū)序列，見SEQ ID NO 1，其能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)長期啟動調(diào)控基因的表達(dá);2)編碼分泌表達(dá)信號肽Ig K鏈引 導(dǎo)序列的DNA序列，見SEQ ID NO 2; 3)編碼表達(dá)治療基因 DNA序列：內(nèi)皮抑素 DNA序列，見SEQ ID NO 3;4)猴腎病毒polyA序列：見SEQ ID NO 4;SEQ ID NO 1:GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCC CGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTA GAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAAC CGTATATA