超分子磁性納米粒子的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請要求2013年02月15日提交的臨時美國申請?zhí)?1/765, 350的優(yōu)先權(quán)，所 述申請W整體引用的方式并入本文。
[0003] 政府資助的聲明
[0004] 本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研究院（NIH)、衛(wèi)生和人類服務(wù)部值巧artmentof化alth andHumanServices)頒發(fā)的授權(quán)號R21GM098982的政府資助下完成。政府享有本發(fā)明的 某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域 陽0化]本發(fā)明設(shè)及超分子磁性納米粒子、超分子磁性納米粒子用于按需藥物釋放的用途W(wǎng)及制造和使用超分子磁性納米粒子的方法。
[0006] 背景
[0007] 納米粒子治療劑是通常包含治療劑實(shí)體（如小分子藥物、膚、蛋白質(zhì)和核酸）和與 治療劑實(shí)體組裝在一起的組分（如脂質(zhì)和聚合物）的粒子。與納米粒子包含的治療劑實(shí)體 相比，此類納米粒子可具有增強(qiáng)的抗癌效果。運(yùn)歸因于通過改進(jìn)的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)W 及活性細(xì)胞內(nèi)遞送對腫瘤組織更特異地祀向。運(yùn)些特性取決于納米粒子的尺寸和表面特性 (包括祀向配體的存在）。
[0008] 概述
[0009] 在一方面，超分子磁性納米粒子（SMN巧包括多個結(jié)構(gòu)部件，每個結(jié)構(gòu)部件包括多 個結(jié)合元件；至少一個磁性納米粒子，每個磁性納米粒子包括多個結(jié)合元件；多個結(jié)合部 件，每個結(jié)合部件包括多個結(jié)合區(qū)域，其中每個結(jié)合區(qū)域適合于結(jié)合到結(jié)合元件；多個終止 部件，每個終止部件包括終止元件，其中終止元件適合于占據(jù)結(jié)合區(qū)域；
[0010] W及運(yùn)載物；其中多個終止部件相對于多個結(jié)合部件的多個結(jié)合區(qū)域W足夠量存 在W終止進(jìn)一步的結(jié)合。
[0011] 在另一方面，遞送藥物的方法包括向受試者施用如上文所述的超分子磁性納米粒 子（SMNP)，并且向受試者中的SMNP應(yīng)用交變磁場（AMF)。
[0012] 在另一方面，制造超分子磁性納米粒子（SMNP)的方法包括組合：多個結(jié)構(gòu)部件， 每個結(jié)構(gòu)部件包括多個結(jié)合元件；至少一個磁性納米粒子，每個磁性納米粒子包括多個結(jié) 合元件；多個結(jié)合部件，每個結(jié)合部件包括多個結(jié)合區(qū)域，其中每個結(jié)合區(qū)域適合于結(jié)合到 結(jié)合元件；多個終止部件，每個終止部件包括終止元件，其中終止元件適合于占據(jù)結(jié)合區(qū) 域；W及運(yùn)載物；其中，根據(jù)所述SMNP的預(yù)定尺寸來選擇結(jié)構(gòu)部件與磁性納米粒子與結(jié)合 部件與終止部件的量的比率，并且其中結(jié)構(gòu)部件、磁性納米粒子、結(jié)合部件W及終止部件自 組裝成基本上具有預(yù)定尺寸的SMNP。
[0013] 從說明書、權(quán)利要求和附圖顯而易見其它特點(diǎn)、目標(biāo)和實(shí)施方案。
[0014] 附圖簡述
[0015] 圖1是匯總磁熱響應(yīng)阿霉素值OX)包封的超分子磁性納米粒子(DoxcSMNP) 的分子設(shè)計、自組裝和功能的示意性圖示。i)DoxcSMNP的制備采用自組裝合成策 略，即是由巧光抗癌藥物（Dox)和W下四個分子結(jié)構(gòu)單元制成：Ad-PAMAM、6-nmAd接枝的 Zn〇.4Fe2.6〇4超順磁納米粒子（Ad-MNP)、CD-PEIW及Ad-PEG。ii)嵌入式Ad-MNP充當(dāng)內(nèi)置 熱變換器，其在遠(yuǎn)程應(yīng)用時變磁場（也稱作交變磁場（AMF))時，觸發(fā)Dox分子從磁熱響應(yīng) SMNP載體的突發(fā)釋放，從而實(shí)現(xiàn)按需藥物釋放。
[0016] 圖2a-2i示出DoxcSMNP的表征和生物分布。a-d)是a)6-nmAd-MNP和具有 6)70±9、。)96±7和(1)16讓8皿的各種尺寸的〇〇5；亡8]\1饑*的透射電子顯微鏡0^)圖 像。插圖：每種打傭仁織C例P的更高放大倍數(shù)TEM圖像。e)通過微PET測量的在NU/NU 小鼠的腫瘤對全身中的S種DoxcSMNP的時間依賴性積累。f-h)在70-nm、100-nm和 160-nm64Cu標(biāo)記的DoxcSMNP注射后36h，帶有DLD-I腫瘤的小鼠的靜電過濾反投影微 PET圖像的二維截面。在S項(xiàng)研究中，70-nmDoxcSMNP展示出最高的腫瘤特異性吸收。 i)在研究結(jié)束時（靜脈內(nèi)注射后48h)，從用70-nm、100-nm和160-nm的DoxcSMNP處 理的小鼠的離體生物分布數(shù)據(jù)量化的腫瘤與器官信號比。
[0017]圖3示出70-nmD粧CSMNP的體外藥物釋放和治療功效。a)W多脈沖（黑線； 脈沖持續(xù)2min伴非脈沖間歇8min)或單脈沖（紅線，脈沖持續(xù)2min)應(yīng)用AMF時的Dox釋 放曲線。在第一AMF脈沖中約50%的包封Dox分子釋放并且在隨后AMF脈沖中剩余的Dox 逐步釋放。b)在應(yīng)用（左）和不應(yīng)用（右）IOmin連續(xù)AMF巧00曲Z，37. 4kA/m)的情況下，用 DoxcSMNP處理的DLD-I結(jié)腸癌細(xì)胞的巧光顯微鏡圖像。圖像從頂部到底部為：展示細(xì) 胞形態(tài)的微分干設(shè)相襯值IC)圖像；展示細(xì)胞核的DAPI染色圖像；表明存在Dox的Dox巧 光；DAPI和Dox的合并圖像。Dox分子在應(yīng)用AMF時從DoxcSMNP突發(fā)釋放并且然后進(jìn) 入細(xì)胞核，運(yùn)導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。C)在應(yīng)用AMF持續(xù)IOmin之前和之后，用DoxcSMNP處理或 未處理的DLD-I細(xì)胞的通過CCK-8測定得到的細(xì)胞活力結(jié)果。在應(yīng)用AMF后，DoxcSMNP 處理的細(xì)胞的活力降至約30%。
[001引圖4示出體內(nèi)治療功效的評估。a)在小鼠中D(紹C繳M胃的治療方案，和在用DoxcSMNP(應(yīng)用和不應(yīng)用AMF)和其它對照物（僅AMF和僅PB。處理的DLD-I異種移 植小鼠（n= 3)中隨著治療進(jìn)程（15天）的腫瘤體積變化的結(jié)果。所有注射在第0天（和 第7天，對于雙重注射組）當(dāng)腫瘤體積達(dá)到IOOmm3時進(jìn)行；在注射后3化應(yīng)用AMF。在應(yīng) 用AMF、用DoxcSMNP雙重注射處理的組中觀察到最好的腫瘤抑制結(jié)果。在應(yīng)用AMF、用 !)?您CSMHP單次注射處理的組，W及其它對照組（即僅用BoxcSMNP、僅AMF和PBS 處理）展示出更低程度的腫瘤抑制效果或沒有腫瘤抑制效果。b)在治療前（左圖）和在結(jié) 束點(diǎn)（右圖），在應(yīng)用和不應(yīng)用AMF情況下的DoxcSMNP和其它對照物處理的組的腫瘤 圖像。實(shí)驗(yàn)的結(jié)束點(diǎn)發(fā)生在第15天或當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1500皿3時。
[0019] 詳述
[0020] 本發(fā)明的實(shí)施方案將在下面詳細(xì)討論。在描述實(shí)施方案時，出于清晰的目的，使用 特定的術(shù)語。然而，本發(fā)明并不意圖限制于如此選擇的特定術(shù)語。雖然討論了特定的示例 性實(shí)施方案，但應(yīng)理解運(yùn)僅僅是為了說明目的。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到可在不背離 本發(fā)明的精神和范圍的情況下使用其它部件和配置。本文引用的所有參考文獻(xiàn)W引用的方 式并入本文，就像每篇文獻(xiàn)單獨(dú)并入一樣。
[0021] 小分子化學(xué)治療劑的內(nèi)在性質(zhì)包括i)有限的水溶性，ii)由于非特異性全身分 布的全身毒性，W及iii)初始施用后藥物抗性的潛在發(fā)展，內(nèi)在性質(zhì)影響了它們的治療功 效。W基于納米粒子（NP)的藥物遞送系統(tǒng)提供了有希望的解決方案來克服運(yùn)些固有限制 并且開始變革臨床腫瘤學(xué)中的疾病管理。?例如，可用NP載體的粒子內(nèi)空間來包裹藥物載 荷而不存在與它們?nèi)芙舛认嚓P(guān)的限制。此外，NP載體表現(xiàn)出高滲透和滯留（EPR)效應(yīng)? 從而促進(jìn)差別攝入，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)的優(yōu)先的空間分布。W然而，常規(guī)NP藥物遞送系統(tǒng)趨向于 根據(jù)腫瘤微環(huán)境被動地釋放藥物載荷，運(yùn)限制在所需的時間點(diǎn)釋放有效藥物濃度的能力。 因此，重要的是將刺激響應(yīng)性藥物釋放機(jī)制設(shè)計進(jìn)基于NP的遞送系統(tǒng)，W便實(shí)現(xiàn)時空控制 的目標(biāo)，通過時空控制，能夠在NP載體達(dá)到最大腫瘤積累的時間點(diǎn)遞送急性水平的藥物濃 度。W由此，期望顯著地改進(jìn)在腫瘤中的治療效果并且通過使用少量的藥物有效地減少全 身毒性。W
[0022] 本發(fā)明的一些方面包括超分子磁性納米粒子，也稱作超分子納米粒子（SMNP)，其 具有多個結(jié)構(gòu)部件，每個結(jié)構(gòu)部件包括多個結(jié)合元件；至少一個磁性納米粒子，每個磁性納 米粒子包括多個結(jié)合元件；多個結(jié)合部件，每個結(jié)合部件包括多個結(jié)合區(qū)域，其中每個結(jié)合 區(qū)域適合于結(jié)合到結(jié)合元件；多個終止部件，每個終止部件包括終止元件，其中終止元件適 合于占據(jù)結(jié)合區(qū)域；W及運(yùn)載物。
[002引超分子納米粒子描述于WO2010/099466中，其W整體引用的方式并入。
[0024] 在使結(jié)構(gòu)部件、磁性納米粒子和結(jié)合部件接觸時發(fā)生自組裝，形成超分子磁性納 米粒子（SMNP)。當(dāng)終止部件相對于結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域W足夠量存在時，終止部件的終止 元件占據(jù)結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域W終止進(jìn)一步的結(jié)合。存在相對于結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域足夠 量的終止部件，允許離散部件在接觸時形成自組裝，形成具有預(yù)定粒度的超分子而不是具 有不確定尺寸的延伸網(wǎng)狀物。在自組裝期間，運(yùn)載物可并入SMNP中。
[0025] 結(jié)構(gòu)部件的結(jié)合元件結(jié)合到結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域。由于結(jié)構(gòu)部件包括多個結(jié)合元 件，結(jié)構(gòu)部件可結(jié)合到單個結(jié)合部件的多個結(jié)合區(qū)域，可結(jié)合到多個結(jié)合部件或二者。一般 來說，結(jié)構(gòu)部件的結(jié)合元件結(jié)合到多個結(jié)合部件上的多個結(jié)合區(qū)域，經(jīng)歷自發(fā)的自組裝，在 結(jié)構(gòu)部件與結(jié)合部件之間形成交聯(lián)的網(wǎng)狀物或水凝膠。終止部件的終止元件還結(jié)合到結(jié)合 部件的結(jié)合區(qū)域。通常，單個結(jié)合區(qū)域一次僅結(jié)合到一個結(jié)合元件或一個終止元件。由此， 當(dāng)終止部件相對于結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域W足夠濃度存在時，終止部件競爭結(jié)合部件上的結(jié) 合區(qū)域，從而限制交聯(lián)網(wǎng)狀物的連續(xù)擴(kuò)展。由此，終止部件終止交聯(lián)網(wǎng)狀物的增長并且形成 離散的粒子。
[00%] 結(jié)構(gòu)部件、結(jié)合部件、磁性納米粒子W及終止部件通過一種或多種分子間作用力 彼此結(jié)合。分子間作用力的實(shí)例包括疏水相互作用、生物分子相互作用、氨鍵相互作用、 JI-JI相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用或范德華力。生物分子相互作用的實(shí) 例包括DNA雜交、蛋白質(zhì)-小分子相互作用（例如蛋白質(zhì)-底物相互作用（例如鏈霉親和 素-生物素相互作用）或蛋白質(zhì)-抑制劑相互作用）、抗體-抗原相互作用或蛋白質(zhì)-蛋白 質(zhì)相互作用。其它相互作用的實(shí)例包括包合復(fù)合物或包合化合物，例如金剛燒-0-環(huán)糊精 復(fù)合物或重氮苯-a-環(huán)糊精復(fù)合物。通常，結(jié)合SMNP結(jié)構(gòu)的部件的分子間作用力不是共 價鍵。 陽〇八]結(jié)構(gòu)部件
[0028] 在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)部件具有結(jié)合到結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域的多個結(jié)合元件。 結(jié)合元件是通過一種或多種分子間作用力結(jié)合到結(jié)合部件的結(jié)合區(qū)域的化學(xué)部分。結(jié)構(gòu)部 件的結(jié)合元件和結(jié)合元件的結(jié)合區(qū)域被特定地選定W彼此結(jié)合，并且可使用分子識別特性 來鑒別結(jié)合區(qū)域。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)部件是無機(jī)或有機(jī)核中的至少一種。 陽030]在一些實(shí)施方案中，無機(jī)核包括無機(jī)納米粒子如金屬納米粒子（例如，金納米粒 子、銀納米粒子、娃納米粒子或其它金屬）。其它無機(jī)納米粒子包括金屬氧化物納米粒子 (例如，二氧化娃納米粒子或氧化鐵納米粒子，包括滲雜的氧化鐵納米粒子），和其它無機(jī) 化合物的納米粒子?？墒褂霉δ苄约{米粒子，如磁性納米粒子、量子點(diǎn)（例如，CdS或CdSe 納米粒子）或半導(dǎo)體氧化物粒子。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，SMNP包括有機(jī)核和無機(jī)核（例如，磁性納米粒子）。有機(jī)核可 充當(dāng)結(jié)構(gòu)部件并且無機(jī)核可充當(dāng)磁性納米粒子。在一些實(shí)施方案中，無機(jī)核充當(dāng)結(jié)構(gòu)部件 和磁性納米粒子。
[0032] 在例如美國專利申請公布號2013/0046274中描述了一類磁性納米粒子，申請W 其整體引用的方式并入。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，無機(jī)核是球形。在其它實(shí)施方案中，無機(jī)核的形態(tài)可W是=角 形、立方形、星形、棒狀、殼、金剛石狀、板狀、金字塔形、不規(guī)則或籠形結(jié)構(gòu)。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，無機(jī)核具有小于約IOOnm的最大尺寸。無機(jī)核的最大尺寸可 為小于約70nm、小于約50nm、小于約25nm、小于約IOnm或小于約5nm。無機(jī)核的尺寸可基 于超分子結(jié)構(gòu)的功能而變化。
[0035] 在本申請?zhí)峁┮欢ǚ秶闹档那闆r下，應(yīng)理解除非上下文另外清楚地規(guī)定，否則 本發(fā)明內(nèi)涵蓋范圍的上限與下限之間的各居間值（至下限單位的十分之一