含有奎尼酸類及糖苷類化合物的檵木提取物及其醫(yī)藥用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥、化學藥物領域，具體地，本發(fā)明涉及富含奎尼酸衍生物和糖苷類 成分的白花檻木提取物、其制備方法及其在治療出血性疾病和制備止血藥物方面的應用。
【背景技術】
[0002] 出血是許多疾病的臨床表現(xiàn)，也是導致患者死亡的重要原因之一。臨床上的出血 性疾病是由于先天性或獲得性止血機制（包括血管、血小板數(shù)量和質量、凝血因子）異常引 起的自發(fā)性或創(chuàng)傷造成的出血不止的一類疾病，該類疾病嚴重威脅著患者的生命和健康。 止血藥可通過收縮小動脈及毛細血管、增強血小板功能、加速血液凝固過程、抑制血塊溶解 過程而產(chǎn)生止血作用。目前國內臨床常用的止血藥約有20多種，根據(jù)其凝血作用機制可分 為四大類：促凝血因子活性藥如血凝酶、去氨加壓素、維生素 K類止血藥等；降低毛細血管 通透性藥如卡巴克洛、卡絡磺鈉；抗纖維蛋白溶解藥如氨基己酸、氨甲苯酸、止血環(huán)酸、抑肽 酶等；外用止血藥如纖維蛋白膠、膠原蛋白、殼聚糖、可吸收性明膠海綿、氧化纖維素、微纖 維膠原等?，F(xiàn)有的止血藥物在應用中都存在一定的局限性，如容易導致血栓、不適用于創(chuàng)面 及大手術出血、止血速度慢等。由于上述局限性的存在，新止血藥的研發(fā)一直受到較多關 注。
[0003] 繼木（Loropetalum chinense)也稱為白花繼木，為金縷梅科（Hamamelidaceae) 檻木屬（Loropetalum)植物，其味苦、潘，以花、葉和根入藥，具有清熱解毒、收斂止血的作 用，廣泛用于治療各種出血、燒燙傷、皮膚感染、痢疾腹瀉等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)白花檻木具 有止血、抑菌、抗炎、促愈合和抗氧化等作用。白花檻木中主要含有揮發(fā)油、鞣質、黃酮、木脂 素等成分。迄今為止，國內外學者從白花檻木中分離得到了約50余個化合物，主要為鞣質 和黃酮類化合物。
[0004] 在現(xiàn)有的有關檻木的專利中，公開號為CN101153303A的專利為檻木總黃酮 的提取工藝專利，不涉及用途，該專利中的總黃酮定量方法存在較大誤差；公開號為 CN101485701A和CN102579524A的專利所涉及的醫(yī)藥用途分別為檻木治療燒燙傷和促進傷 口愈合，其有效成分并不明確。公開號為CN102134187B的專利公開了一種由檻木中分離得 到的化合物及其抗炎、抗菌的醫(yī)藥用途。公開號為CN102716157A的專利公布了一種檻木總 酚的制備方法及其止血作用，采用乙醇回流提取和大孔樹脂分離得到總酚類化合物，但總 酚中的主要成分沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚等化合物的止血作用未經(jīng)過實驗 確證，因而上述化合物不能代表檻木止血作用的有效成分。
[0005] 本發(fā)明采用丙酮室溫浸泡的方法對檻木進行提取，采用與中國專利CN102716157A 中所用的型號不同的大孔樹脂分離得到具有明確止血活性的部位，通過對活性部位中的 各類化學成分進行系統(tǒng)分離和活性篩選研究，首次公開了此前并未在檻木中發(fā)現(xiàn)的綠原 酸甲酯、綠原酸乙酯、5-0-p-香豆酰奎尼酸甲酯等奎尼酸衍生物和紅景天苷、（Z)-3-己 烯基-Ο-α-L-吡喃鼠李糖-(1 - 6)-i3_D-批喃葡萄糖苷、芐基-Ο-α-L-吡喃鼠李 糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡萄糖苷、槲皮素-3-0- (6 " -0-沒食子?；?β -葡萄糖苷等糖 苷類化合物，并且通過動物實驗證實了這些化合物的止血作用。國內外相關研究中未見有 從白花檻木中獲得止血活性良好的奎尼酸衍生物和糖苷類成分復合物的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的一個方面涉及一種白花檻木提取物，其富含有奎尼酸衍生物類成分 和糖苷類成分。其中，奎尼酸衍生物類成分為綠原酸甲酯、綠原酸乙酯、5-0-p-香豆酰 奎尼酸甲酯的一種或多種；糖苷類成分為紅景天苷、（Z)-3_己烯基-Ο-α-L-吡喃鼠李 糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡萄糖苷、芐基-0- a -L-吡喃鼠李糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡萄糖 苷、楊梅苷、槲皮素-3-0-(6 " -0-沒食子?；?β -葡萄糖苷的一種或多種。
[0007] 在本發(fā)明的一個實施方案中，以提取物的總重量計算，上述奎尼酸衍生物和糖苷 類成分以重量比合計為30% -90%，30-90%，優(yōu)選為60% -80%。
[0008] 在本發(fā)明的一個實施方案中，以提取物的總重量計算，綠原酸甲酯、綠原酸乙酯、 紅景天苷、楊梅苷四種成分的含量以重量百分比記分別為：1-5%、0. 6-3%、0. 3-1. 5%、 5-20% ;優(yōu)選為 1-3. 5%、1-2%、0· 5-1%、5-15%。
[0009] 本發(fā)明的另一方面涉及上述的白花檻木提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0010] 1)將白花檻木藥材以丙酮室溫浸泡提取，濃縮后得到粗提物；
[0011] 2)將藥材粗提物在水中分散均勻，用低級性溶劑萃取除去低級性成分，得到水溶 性部分；
[0012] 3)水溶性部分濃縮后，過大孔樹脂柱，以10%、20%、30%、40%、50%、70%、95% 乙醇-水梯度洗脫，將20%、30%、40%洗脫液減壓蒸干，得到不同極性部位。
[0013] 4)將3)所得30%乙醇洗脫物加水溶解，用反相C1S硅膠柱層析，以不同濃度的甲 醇水溶液（1〇%，20%，30%，40%，50%，70%，95% )梯度洗脫，劃分成 F1-F46 段。
[0014] F19-20段合并記為組分B，再用反相C1S硅膠柱層析，以不同濃度的甲醇水溶 液（5%，10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%，100% )梯度洗脫，劃分成 B1-B58。其 中B8-B10合并，用LH-20柱層析，甲醇洗脫，劃分成B-8-1至B-8-58,其中組分B-8-16至 B-8-26合并，用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇：水=9 : 1 : 0.1-8 : 2 : 0.2洗脫，得 到單體化合物紅景天苷；組分B-8-27用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇：水=8 : 2 : 0.2 洗脫，得到單體化合物5-0-p-香豆?？崴峒柞ィ唤M分B-8-29至B-8-33合并，用硅膠柱層 析，以二氯甲烷：甲醇：水=8 : 2 : 0.2洗脫，得到單體化合物綠原酸甲酯；組分B48-B51 合并，用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇=95 : 5洗脫，得到單體化合物綠原酸乙酯。
[0015] F39-41段合并記為組分I，用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇：水= 9 : 1 : 0.1-8 : 2 : 0.2洗脫，劃分成11-152。其中120-121合并，用LH-20柱層析，甲 醇：水=2 : 1洗脫，得到單體化合物芐基-0- a -L-吡喃鼠李糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡 萄糖苷；124-125合并，用LH-20柱層析，甲醇：水=2 : 1洗脫，得到單體化合物（Ζ)-3-己 烯基-0- a -L-吡喃鼠李糖-(1 - 6) - β -D-吡喃葡萄糖苷；129-132合并，用LH-20柱層析， 甲醇洗脫，得到單體化合物槲皮素-3-0-(6 " -0-沒食子?；?β -葡萄糖苷。
[0016] F42-44段合并記為組分J，用聚酰胺柱層析，以甲醇：水=1 : 1-9 : 1梯度洗 脫，劃分成J1-J71，其中組分J14-J40合并，用LH-20柱層析，甲醇：水=2 : 1洗脫，得到 單體化合物楊梅苷。
[0017] 采用室溫冷浸提取時，包括以下步驟：取適量白花檻木藥材切為2-3cm小段，加入 固液比為1 : 8-1 : 10的丙酮，室溫浸泡提取，然后合并提取液，減壓濃縮至干。
[0018] 采用溶劑萃取法除去低級性成分時，包括以下步驟：取藥材的粗提物在水中分散， 然后加入體積比為1 : 1-1 : 4的低級性的酯類、烷烴類或醚類溶劑萃取3-5次，以除去其 中的色素等。其中優(yōu)選的溶劑為石油醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯。萃取后水層揮干有機溶劑得到 水溶性成分。
[0019] 采用大孔吸附樹脂法時，包括以下步驟：將萃取除雜后的水溶性成分減壓濃縮至 濃度為200-300g/L的提取液，上大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為1 : 6-1 : 10,上樣后用2-4 倍BV的10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%乙醇-水梯度洗脫，洗脫流速為3-98￥/11， 收集20%、30%、40%洗脫液減壓濃縮至干，得到富含有奎尼酸衍生物類成分和糖苷類成分 的白花檻木提取物。
[0020] 大孔樹脂包括非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性等任意一種類型的樹 月旨，如 HP20、D4020、S-8、HZ-806、D4006、X-5、NKA-II、NKA-9 等，其中優(yōu)選的為弱極性或中 等極性的樹脂HP20、I-IHMOO、D4006、X-5等，更優(yōu)選為HP20型樹脂。
[0021] 本發(fā)明的又一方面涉及該提取物制備的藥物組合物，該提取