一種超順磁性氧化鐵納米mri探針和制備方法及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種超順磁性氧化鐵納米MRI探針和制備方法及其應用，屬于醫(yī)藥技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI)能夠準確的對肝癌進行顯示， 能夠發(fā)現(xiàn)一些其他檢查手段例如CT不能發(fā)現(xiàn)的病變，但是對于發(fā)現(xiàn)比較小的病灶，特別是 小于Icm的肝癌和同時伴有肝硬化病人的肝癌尚有一定的困難。近些年來，對分子影像學 (Molecular Imaging)研究的不斷深入，為肝細胞癌的早期檢測和早期診斷提供了一種全 新的思維方法。分子影像學是一門新興的邊緣科學，與傳統(tǒng)影像學的不同點在于其能夠?qū)?分子水平的改變在活體狀態(tài)下顯示出來，從而定性及定量的對分子改變所導致的生物學行 為通過影像的方法進行分析，在組織、細胞及亞細胞等不同層面對疾病進行早期判斷。
[0003] 臨床上常用的磁共振對比劑是含IL磁共振對比劑（簡稱IL劑，Gadolinium based contrast agent，GBCA)，在磁共振影像診斷方面有一定的價值，能夠提高診斷的準確率，但 其在體內(nèi)組織中呈非特異性分布，對早期腫瘤和較小的轉(zhuǎn)移瘤診斷的敏感性不高，對腫瘤 組織和正常組織的分界往往不能準確地區(qū)分，并且有一定程度的腎毒性。為了更加清晰的 顯示微小病灶，需要研制出能夠增強圖像對比度的對比劑，提高磁共振對軟組織的分辨率。 釓劑在腦組織、腎臟及血液系統(tǒng)的成像方面作用比較明顯，但是在肝膽系統(tǒng)的成像效果欠 佳，這種情況下，對肝臟特異性磁共振對比劑的研究是極其有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，提供一種新的MRI探針，可以用于癌細胞的早期檢測， 特別適合肝細胞癌的早期檢測。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，提供一種超順磁性氧化鐵納米MRI探針，其化學結(jié)構(gòu)式如 下：
[0007] 所述SPIO為超順磁性氧化鐵；所述CTX為氯離子通道蝎毒素；所述η為聚合度，為 4-200的任意整數(shù)。
[0008] 進一步地，超順磁納米MRI探針的制備方法為：向
中加入鹽酸羥胺和乙 二胺四乙酸，室溫下反應脫去
中的乙?；?jīng)截留分子量為3500的半透膜純化 后與端碘乙酸酯化的超順磁性氧化鐵納米粒子混合反應，冰浴條件下反應，攪拌過夜，反應 完成后離心即得所述MRI探針；所述端碘乙酸酯化的SPIO的化學結(jié)構(gòu)式為：
[0010] 進一步地，所述
的制備方法為：在無水條件下將巰基乙酸和乙酰氯反應 得到乙?；瘞€基乙酸，再與N-羥基琥珀酰亞胺反應得到羧基活化的乙?；瘞€基乙酸，再與 氯離子通道蝎毒素反應得到
[0011] 進一步地，所述端碘乙酸酯化的SPIO的制備方法為：將SPIO納米粒子分散到環(huán) 己烷中，加入PEG-硅烷，40-55°C下超聲，待環(huán)己烷揮發(fā)完全得到PEG-硅烷修飾的SPIO ;再 在PEG-硅烷修飾的SPIO中加入過量乙二胺，反應得到表面氨基化的SPIO ;表面氨基化的 SPI0再與碘乙酸反應得到所述端碘乙酸酯化的SPI0 ;其合成路線為：
[0013] 本發(fā)明進一步地提供所述MRI探針作為磁共振成像的造影劑的應用。
[0014] 超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPI0)具有很多優(yōu)點，例如生 物相容性較好，毒性較低，磁場敏感性較強，可以使質(zhì)子弛豫率增強，使橫向弛豫（T2)時間 縮短，從而使病變與周圍組織的對比度增大，使圖像的分辨率提高。肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中 含有Kupffer細胞，Kupffer細胞可以攝取超順磁氧化鐵，從而降低正常肝組織的磁共振信 號，由于Kupffer細胞在肝臟大部分惡性腫瘤中非常少或者缺乏，所以肝臟惡性腫瘤的磁 共振信號無明顯變化，這種情況下病變與正常肝組織的T2序列磁共振信號差別加大，產(chǎn)生 磁共振負性強化。
[0015] 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (Matrixmetalloproteinases-2，ΜΜΡ-2)的在肝硬變和慢性 肝炎的肝組織內(nèi)表達較弱，在肝細胞癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-2能夠較高的表達，并且這種表 達與腫瘤的侵襲、分化程度、轉(zhuǎn)移和復發(fā)趨勢有一定的相關(guān)性。因此，基質(zhì)金屬蛋白酶-2 有希望成為超順磁性氧化鐵新型肝癌分子探針的特異結(jié)合靶點之一。氯離子通道蝎毒素 (Chlorotoxin，CTX)是一種從以色列金蝎的毒液中提取的、包含有36個氨基酸（其中包 含1個酪氨酸殘基、8個半胱氨酸殘基）和4個雙硫鍵的多肽，分子重量為3950Da，其中酪 氨酸殘基可以進行放射性碘標記，其結(jié)構(gòu)可參見文獻{Mamelak AN, Jacoby DB. Targeted delivery of antitumoral therapy to glioma and other malignancies with synthetic chlorotoxin(TM-601)[J]. Expert Opin Drug Deliv 2007,4(2):175-186}〇 CTX可選擇性地和特異性地與MMP-2結(jié)合，從而間接與肝癌建立靶向聯(lián)系。聚乙烯乙二醇 (poly-ethylene glycol，PEG)是一種常用的表面修飾材料，具有很好的親水性，同時沒有 免疫原性，PEG便宜易得，中性無毒，有良好的生物相容性，溶于水和多種有機溶劑，能夠通 過端基反應性以嵌段或接枝的方法連接到納米顆粒上，使其具有親水性，增強其穩(wěn)定性，延 長在血液內(nèi)的循環(huán)時間，減少納米顆粒被巨噬細胞的吞噬。因此可以選擇PEG作為連接CTX 與SPIO的橋梁，將CTX與SPIO通過某種物質(zhì)連接起來，則可以使SPIO作為磁共振對比劑 與肝癌靶向結(jié)合，達到SPIO與肝癌的靶向聯(lián)系的目的。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是，成功地制備出了一種新型的超順磁納米MRI探針，該MRI探 針納米顆粒溶液的磁共振成像規(guī)律與SPIO溶液相同，均為隨著溶液中鐵濃度增高，TlWI序 列的信號強度增高，T2WI序列的信號強度降低，對人肝細胞癌細胞株H印G2無明顯的細胞 毒性，可以用于肝細胞癌的早期檢測。
【附圖說明】
[0017] 圖1表示超順磁性氧化鐵納米MRI探針的化學結(jié)構(gòu)。
[0018] 圖2表示端羧基聚乙二醇的紅外圖譜。
[0019] 圖3表示PEG-硅烷的核磁共振-氫譜。
[0020] 圖4表示終產(chǎn)物SPI0-PEG-CTX的紅外光譜表征及其對照圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0022] 實施例1
[0023] 本實施例提供一種超順磁性氧化鐵納米MRI探針的合成步驟和表征，該MRI探針 的結(jié)構(gòu)為：
α
[0024] 上述MRI探針的結(jié)構(gòu)中主要包含SPIO (超順磁性氧化鐵）、PEG (聚乙二醇）和 CTX (氯離子通道蝎毒素）三部分，因此該MRI探針可以簡寫為SPIO-PEG-CTX，其合成步驟 具體為：
[0025] I. 1疏水性SPIO納米顆粒制備
[0026] 超順磁氧化鐵納米粒子制備的基本方法是，將摩爾比為2:1的三價鐵（Fe3+) 和二價鐵（Fe 2+)混合溶液滴加到堿性溶液（0H )中，通過化學共沉淀法（Chemical coprecipitation)合成。共沉淀法制備四氧化三鐵納米顆粒的化學反應式如下：
[0027] Fe2++Fe3++80H - Fe (OH) 2/Fe (OH) 3
[0028] Fe (OH) 2/Fe (OH) 3+2Fe (OH) 3一 Fe 304+Fe00H+5H20
[0029] 2Fe00H+Fe (OH) 2- Fe 304+H20。
[0030] 稱取三氯化鐵六水合物（Iron trichloride hexahydrate，分子式為 FeCl3 ·6Η20， I. 081g，4mmol)和二氯化亞鐵（ferrous chloride tetrahydrate，分子式為 FeCl2,0. 397g， 2mm〇l)置于一 250毫升的三頸瓶中，加入120毫升去離子水溶解，然后將三頸瓶密封，并抽 去其中的氧氣，然后再充入氮氣，此抽氧氣及充氮氣的過程重復三次即三充三放，保持三頸 瓶內(nèi)的無氧環(huán)境。隨后在對整個混合鐵溶液體系進行劇烈攪拌過程中（機械攪拌，轉(zhuǎn)速大 于1500rpm)，并逐滴加入0. 2mL的油酸（Oleic acid)。之后吸取15mL質(zhì)量分數(shù)為28%的 氨水（Ammonium hydroxide) 15mL緩慢地加入到三頸瓶中，體系中保持80攝氏度的恒定溫 度，并且始終處于超聲環(huán)境。隨著氨水的加入，整個體系逐漸變成棕黑色。反應半小時之后， 得到一定粒徑范圍的超順磁氧化鐵納米粒子沉淀。該沉淀通過離心分離，無水乙醇（ethyl alcohol absolute)清洗，室溫條件下真空干燥，得到干燥的超順磁性氧化鐵納米粒子。
[0031] L 2親水性納米顆粒SPI0-PEG-CTX制備
[0032] 疏水性納米顆粒SPIO親水性表面修飾的基本原理：使用配體交換方法對上步 制備的疏水性超順磁性氧化鐵納米粒子進行親水性修飾，使其與PEG及CTX結(jié)合，得到 SPI0-PEG-CTX納米顆粒，具備一定的親水性能。配體交換是指配位化合物中的配體被其他 配體所取代。
[0033] I. 2. 1 稱取一定量的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG6000)置于兩口 燒瓶內(nèi)，一 口接分水器，分水器上接冷凝管，另一口接溫度計。然后向燒瓶中加入甲苯 (Methylbenzene)溶解聚乙二醇PEG6000,110至130攝氏度條件下共沸（Azeotrope)除去 其中的甲苯/水混合物，之后冷卻至室溫待用。
[0034] L 2. 2稱取一定量的丁二酸酐（Succinic anhydride)，干燥處理聚乙二醇 PEG6000,用做催化劑的二甲氨基吡啶（Dimethylaminopyridine，DMAP)，用做溶劑的二氯甲 燒（dichloromethane)，室溫下攪拌24小時。用乙醚（Ether)做后處理，沉淀出白色固體， 之后用異丙醇（Isopropanol)對此白色固體進行溶解，會產(chǎn)生少許不溶物，棄去不溶物，僅 收取溶劑部分，經(jīng)濃縮過柱得端羧基化的聚乙二醇（carboxyl terminated PEG)。該實驗步 驟的化學反應式如下。
[0036] 1. 2. 3稱取步驟1. 2. 2制備的端羧基化的PEG，加入一定量氯化亞砜（sulfoxide chloride，SOCl2)，氮氣條件下回流I. 5小時，經(jīng)后處理得酰氯化的PEG(acidchloride PEG)。該實驗步驟的化學反應式如下。
[0038] 1. 2. 4向上步所得的酰氯化PEG中加入一定量的三氟乙醇（trifIuoroethanol)， 氮氣條件下攪拌2小時，后經(jīng)加熱回流反應3小時，過柱純化得到功能化修飾的 PEG(functionalizational PEG)。該實驗步驟的化學反應式如下：
[0040] 1. 2. 5稱取3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS)和功能化修飾的PEG，APS與PEG的 比例為1:2,將二者加入到用少量二氯甲燒（dichloromethane)溶解的聚乙二醇體系中，該 體系用氮氣保護，避光條件下攪拌過夜。之后經(jīng)過真空干燥得到PEG修飾的硅烷（