長柱重樓抗癌活性部位pfe-pt3的化學(xué)成分分離和鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及長柱重樓抗癌活性部位 PFE-PT3的化學(xué)成分分離和鑒定方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 長柱重樓[Parisforrestii(Takht. )H.Li]為延齡草科重樓屬植物，其根莖入 藥，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，用于治療癰疽瘡瘍、無名腫毒、毒蛇咬傷、咽 喉腫痛、腮腺炎、扁桃體炎和大頭瘟（朱兆云.云南天然藥物圖鑒.第6卷.昆明：云南 科技出版社，2010:127)。專利"一種治療癌癥的植物藥及其制備方法與應(yīng)用"（公布號： CN104706896A)公開了長柱重樓PFE-PT3部位具有顯著抗癌活性，但其化學(xué)成分尚未見報 道。闡明PFE-PT3的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，對建立PFE-PT3的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以及基于PFE-PT3的 新藥研制具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在了上述問題，提供長柱重樓[Parisforrestii(Takht.) H.Li]抗癌活性部位PFE-PT3,以其為活性成分的藥物組合物，以及PFE-PT3中的化學(xué)成分 的提取和鑒定方法。由于PFE-PT3具有顯著的抗癌活性，但其化學(xué)成分不清楚，沒有辦法建 立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。所以，本發(fā)明提供了一種PFE-PT3分離鑒定方法用于解決這個技術(shù)問題。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0005] 藥物組合物，其中含有治療有效量的長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3和藥學(xué)上 可接受的載體，所述的PFE-PT3由下述方法制備而得：長柱重樓干燥根莖，粉碎后用95%乙 醇浸泡7天，過濾，濾渣繼續(xù)提取，總共提取4次，合并濾液，回收溶劑，得浸膏，將浸膏用水 制成混懸液，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位；乙酸乙酯萃取后的母 液，繼續(xù)用正丁醇萃取，回收正丁醇，得正丁醇萃取部位即PFE-PT3。
[0006] 藥物組合物，其中含有治療有效量的長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3和藥 學(xué)上可接受的載體，所述的PFE-PT3中重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷III、重樓皂 苷V、重樓皂苷H、偏諾皂苷元-3-0-a -L-吡喃鼠李糖基-(1 - 4)_[ a -L-吡喃鼠李 糖基-(1 - 2)]-P-D-吡喃葡萄糖苷（PGRR)、甲基原重樓皂苷I、甲基原重樓皂苷V、 Pariposide A和蛻皮激素總含量為10-95% (重量）。
[0007] 藥物組合物，其中含有治療有效量的長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3和藥 學(xué)上可接受的載體，所述的PFE-PT3中重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷III、重樓皂 苷V、重樓皂苷H、偏諾皂苷元-3-0-a -L-吡喃鼠李糖基-(1 - 4)_[ a -L-吡喃鼠李 糖基-(1 - 2)]-P-D-吡喃葡萄糖苷（PGRR)、甲基原重樓皂苷I、甲基原重樓皂苷V、 Pariposide A和蛻皮激素是從長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3分離得到，步驟為：
[0008] (1)PFE-PT3經(jīng)硅膠柱層析用10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫 劃段，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C和Fr.D等4個部分；
[0009] (2)取Fr.B部分經(jīng)C1S反相硅膠柱層析，10:90 - 100:0的甲醇-7jc，得到Fr.Bi、 Fr.B2、Fr.B3、Fr.B4、Fr.B5和Fr.B6等 6 個部分；
[0010] (3)取Fr.B3部分，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫后，再用硅膠柱層析5:1的氯 仿-甲醇洗脫得到0 _蛻皮激素；
[0011] (4)取Fr.B4部分，用半制備高效液相色譜純化得到甲基原重樓皂苷I，和甲基原 重樓皂苷V;
[0012] (5)取Fr.B5部分，用半制備高效液相色譜純化得到PariposideA、重樓皂苷II、 重樓皂苷III、重樓皂苷I和重樓皂苷V;
[0013] (6)取Fr.B6部分，半制備高效液相色譜純化得到化合物PGRR和重樓皂苷H;
[0014] 其中，（4)所述的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Zorbax 38-(：18色譜柱，色譜柱大小9.4\25〇111111，洗脫劑為甲醇-水，比例72 :28，流速211117111111;(5) 所述的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，ZorbaxSB-Cls色譜柱，色譜柱大 小9. 4X250mm，洗脫劑為乙腈-水，比例50:50,流速2mL/min; (6)所述的半制備高效液相 色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，ZorbaxSB-Cls色譜柱，色譜柱大小9. 4X250mm，洗脫劑 為乙腈-水，比例40:60，流速211117111；[11。
[0015] 本發(fā)明還提供了長柱重樓提取物正丁醇萃取部位PFE-PT3中重樓皂苷I、重 樓皂苷II、重樓皂苷III、重樓皂苷V、重樓皂苷H、偏諾皂苷元-3-0-a-L-吡喃鼠李糖 基-(1 - 4)-[a-L_吡喃鼠李糖基-(1 - 2)]-P-D-吡喃葡萄糖苷（PGRR)、甲基原重樓皂 苷I、甲基原重樓皂苷V、PariposideA和蛻皮激素總含量為10-95% (重量），其從長 柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3中分離得到，步驟為：
[0016] (1)PFE-PT3經(jīng)硅膠柱層析用10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫 劃段，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C和Fr.D等4個部分；
[0017] (2)取Fr.B部分經(jīng)C1S反相硅膠柱層析，10:90 - 100:0的甲醇-7K，得到Fr.B!、 Fr.B2、Fr.B3、Fr.B4、Fr.B5和Fr.B6等 6 個部分；
[0018] (3)取Fr.B3部分，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫后，再用硅膠柱層析5:1的氯 仿-甲醇洗脫得到0 _蛻皮激素；
[0019] (4)取Fr.B4部分，用半制備高效液相色譜純化得到甲基原重樓皂苷I，和甲基原 重樓皂苷V;
[0020] (5)取Fr.B5部分，用半制備高效液相色譜純化得到PariposideA、重樓皂苷II、 重樓皂苷III、重樓皂苷I和重樓皂苷V;
[0021 ] (6)取Fr.B6部分，半制備高效液相色譜純化得到化合物PGRR和重樓皂苷H;
[0022] 其中，（4)所述的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Zorbax 38-(：18色譜柱，色譜柱大小9.4\25〇111111，洗脫劑為甲醇-水，比例72 :28，流速211117111111;(5) 所述的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，ZorbaxSB-Cls色譜柱，色譜柱大 小9. 4X250mm，洗脫劑為乙腈-水，比例50:50,流速2mL/min; (6)所述的半制備高效液相 色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，ZorbaxSB-Cls色譜柱，色譜柱大小9. 4X250mm，洗脫劑 為乙腈-水，比例40:60，流速211117111；[11。
[0023] -種長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3的化學(xué)成分分離鑒定方法，從長柱重 樓正丁醇萃取部位PFE-PT3分離得到重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷III、重樓皂 苷V、重樓皂苷H、偏諾皂苷元-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1 - 4)_[a-L-吡喃鼠李 糖基-(1 - 2)]-P-D-吡喃葡萄糖苷（PGRR)、甲基原重樓皂苷I、甲基原重樓皂苷V、 PariposideA和銳皮激素，步驟為：
[0024] (1)PFE-PT3經(jīng)硅膠柱層析用10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫 劃段，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C和Fr.D等4個部分；
[0025] (2)取Fr.B部分經(jīng)C1S反相硅膠柱層析，10:90 - 100:0的甲醇-7K，得到Fr.B!、 Fr.B2、Fr.B3、Fr.B4、Fr.B5和Fr.B6等 6 個部分；
[0026] (3)取Fr.B3部分，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫后，再用硅膠柱層析5:1的氯 仿-甲醇洗脫得到0 _蛻皮激素；
[0027] (4)取Fr.B4部分，用半制備高效液相色譜純化得到甲基原重樓皂苷I，和甲基原 重樓皂苷V;
[0028] (5)取Fr.B5部分，用半制備高效液相色譜純化得到PariposideA、重樓皂苷II、 重樓皂苷III、重樓皂苷I和重樓皂苷V;
[0029] (6)取Fr.B6部分，半制備高效液相色譜純化得到化合物PGRR和重樓皂苷H;
[0030] 其中，（4)所述的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Zorbax 38-(：18色譜柱，色譜柱大小9.4\25〇111111，洗脫劑為甲醇-水，比例72 :28，流速211117111111;(5) 所述的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，ZorbaxSB-Cls色譜柱，色譜柱大 小9. 4X250mm，洗脫劑為乙腈-水，比例50:50,流速2mL/min; (6)所述的半制備高效液相 色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，ZorbaxSB-Cls色譜柱，色譜柱大小9. 4X250mm，洗脫劑 為乙腈-水，比例40:60，流速211117111；[11。
[0031] 根據(jù)所述的一種長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3的化學(xué)成分分離鑒定方法，該 方法從PFE-PT3中分離得到10個化合物，通過質(zhì)譜MS及核磁共振波譜NMR對其進(jìn)行化學(xué) 結(jié)構(gòu)的確定。
[0032] 根據(jù)所述的一種長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3的化學(xué)成分分離鑒定方 法，該方法從PFE-PT3中獲取化學(xué)成分重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷III、重樓皂 苷V、重樓皂苷H、偏諾皂苷元-3-0-a-L-吡喃鼠李糖基-(1 - 4)_[a-L-吡喃鼠李 糖基-(1 - 2)]-P-D-吡喃葡萄糖苷（PGRR)、甲基原重樓皂苷I、甲基原重樓皂苷V、 PariposideA和蛻皮激素，用于建立PFE-PT3的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
[0033] 所述的長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3在制備治療或預(yù)防癌癥疾病的藥物中 的應(yīng)用。
[0034] 根據(jù)所述的長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3在制備治療或預(yù)防癌癥疾病的藥 物中的應(yīng)用，其所述的癌癥為肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌。
[0035] 制備上述治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的方法，按以下的重量百分比進(jìn)行混 合：長柱重樓正丁醇萃取部位PFE-PT3占20-80%，分散劑2-20%，崩解劑3-5%，乳化劑 3-8 %，粘結(jié)劑0. 2-2 %，潤濕劑0. 5-10 %，其余為填料。
[0036]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述的優(yōu)益效果：長柱重樓提取物，特別是正丁醇萃 取部位（PFE-PT3)對肝癌SMMC-7721細(xì)胞、肺癌A-549細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞有極其顯著的抑制活性，其活性強(qiáng)于陽性對照藥物順鉬。本發(fā)明首次闡明了長柱 重樓抗