一種抗口蹄疫病毒的類病毒粒子vlp疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種抗口蹄疫病毒的類病毒粒子 VLP疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動物。 多年來，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防接種是 控制該病毒的主要手段。在各種預(yù)防口蹄疫的疫苗中，用基因工程技術(shù)制備亞單位疫苗是 近幾十年較為成功的方向，已有產(chǎn)品在市場銷售。但是近年來發(fā)現(xiàn)免疫原性最強，效果最好 具有廣闊應(yīng)用前景的基因工程疫苗是類病毒粒子（VLP)疫苗。
[0003]制備抗口蹄疫病毒的類病毒粒子有多條技術(shù)路線，其中一個重要方向是用能在細(xì) 胞中自動裝配為類病毒粒子的病毒蛋白基因為載體，在該載體表面插入抗口蹄疫病毒的抗 原表位基因，置入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)并表達(dá)類病毒顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗口蹄疫病毒的類病毒粒 子VLP疫苗及其制備方法。本發(fā)明首次采用同為常見家畜病毒的豬圓環(huán)病毒（PCV)作為載 體，插入口蹄疫病毒單個表位或不同抗原表位組合從而構(gòu)建類病毒顆粒。這種類病毒粒子 具有很強的免疫原性，能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，可制備成安全、穩(wěn)定、多價，高效的抗口 蹄疫病毒病亞單位疫苗。
[0005] 本發(fā)明以豬圓環(huán)病毒（procine circovirus，PCV)的外殼蛋白CAP基因為載體，以 抗口蹄疫病毒的抗原表位基因作為抗原蛋白基因，通過遺傳工程技術(shù)將上述基因連接并利 用表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒粒子，將重組桿狀病毒粒子轉(zhuǎn)入細(xì)胞，在細(xì)胞中合成類病毒 粒子，提取出的類病毒粒子便是抗口蹄疫病毒的疫苗。
[0006] 抗原表位（epitope)是指抗原分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)， 其能刺激機體產(chǎn)生抗體或促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖并能被其識別，又稱抗原決定簇（antigenic determination)。按表位結(jié)構(gòu)不同，可分為線型表位和構(gòu)象型表位；按結(jié)合的受體細(xì)胞不同 可分為B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位。B細(xì)胞表位既有線型表位，又有構(gòu)象型表位，而 T細(xì)胞表位一般只有線型表位。
[0007] 本發(fā)明具體技術(shù)方案介紹如下。
[0008] 本發(fā)明提供一種抗口蹄疫病毒的類病毒粒子VLP疫苗，以豬圓環(huán)病毒PCV的外殼 蛋白CAP基因作為載體，將抗口蹄疫病毒的抗原表位基因插在CAP基因的C端，二者聯(lián)合組 成抗口蹄疫病毒的類病毒粒子VLP疫苗。
[0009] 本發(fā)明中，所述類病毒粒子VLP疫苗是由含有將抗口蹄疫病毒的抗原表位基因和 作為載體的豬圓環(huán)病毒PCV的外殼蛋白CAP基因的重組桿狀病毒在表達(dá)體系中形成的；所 述表達(dá)體系選自大腸桿菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，植物或者哺乳動物細(xì)胞中任一種。上述每個表 達(dá)體系統(tǒng)均有其特點，例如大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)量高，但糖基化等蛋白修飾程度差；哺乳動物 細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)量低，成本高，但其能進(jìn)行復(fù)雜的蛋白翻譯后修飾；昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)既能進(jìn)行一 定的蛋白修飾，也有較高的表達(dá)量，但其蛋白的純化有一定的難度。本發(fā)明所運用的表達(dá)體 系可以是任一符合條件的常用體系 本發(fā)明中，所述抗口蹄疫病毒的抗原表位基因來自0型、A型或亞洲I型的口蹄疫病毒。
[0010] 本發(fā)明中，所述抗口蹄疫病毒的抗原表位基因為VP1的G-H環(huán)（141~160aa)、 21 ~40aa、200 ~213aa，VP2 的 74~88aa，VP3 的 26~39aa、VP4 的 20~35aa 或者為上述抗原 表位的組合。
[0011] 本發(fā)明中，所述抗原表位選自〇型口蹄疫病毒Mya98毒株的VP1蛋白抗原表位 141~160aa，其氨基酸序列為SEQ No. 1，核苷酸序列為如SEQ No. 2;或者VP1蛋白抗原表 位20~40aa，其氨基酸序列為SEQ No. 3,核苷酸序列為SEQ No. 4 ;或者VP1蛋白抗原表位 200~213aa ;或者上述VP1蛋白抗原表位20~40aa和VP1蛋白抗原表位141~160aa的串聯(lián)組 合，其氨基酸序列為SEQ No. 5,核苷酸序列為SEQ No. 6。
[0012] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述抗口蹄疫病毒的類病毒粒子VLP疫苗的制備方法，其特 征在于：其包括：基因制備、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組桿狀病毒制備、重組蛋白獲取和制苗步驟， 具體步驟如下： (1) 分別克隆出CAP、單表位、串聯(lián)表位基因； (2) 利用重疊PCR獲得重組VLP基因； (3) 將上一步的基因克隆入桿狀病毒載體獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒并鑒定； (4) 將上一步質(zhì)粒轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞內(nèi)，收獲重組桿狀病毒； (5) 擴增重組桿狀病毒，使用擴增后的病毒感染細(xì)胞表達(dá)重組蛋白； (6) 利用SDS-PAGE，Western-Blot和電鏡鑒定重組蛋白； (7) 將重組蛋白按一定濃度與佐劑1 :1混勻后制成疫苗，免疫動物檢測效果。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明是第一次將FMDV的抗原表位以單個表位或串聯(lián) 表位插入豬圓環(huán)病毒（procine circovirus，PCV)的外殼蛋白CAP基因。含有上述二種基 因的質(zhì)?？稍诓煌?xì)胞（昆蟲細(xì)胞）中能合成類病毒粒子，提取出的類病毒粒子具有免疫原 性，該類病毒粒子對抵抗FMDV感染效果已經(jīng)顯現(xiàn)。本發(fā)明的口蹄疫病毒的抗原表位基因序 列來自任何一型的口蹄疫病毒，包括0型、A型、亞洲I型。因此抗口蹄疫病毒的類病毒粒 子（VLP)疫苗可以是單價的也可以是多價的。即一種疫苗可以同時抗0型、A型、亞洲I型 口蹄疫病毒的感染。
【附圖說明】
[0014] 圖1為重組桿粒的PCR鑒定；A. CAP-B和CAP-BTB的M13引物PCR鑒定結(jié)果；1 泳道為CAP-B結(jié)果，2泳道為陰性對照結(jié)果，3泳道為Marker，從上到下分別為7000, 5500， 3000, 2000bp，4泳道為CAP-BTB結(jié)果；B. CAP-B和CAP-BTB的特異性引物PCR鑒定結(jié)果， 1泳道為CAP-B結(jié)果，2泳道為CAP-BTB結(jié)果，3泳道為Marker，從上到下分別為1200,900， 700, 500bp圖上標(biāo)出目的條帶附近的marker的大小。
[0015] 圖2為轉(zhuǎn)染后Sf9細(xì)胞的病變情況（X100); A為正常細(xì)胞對照，B為病變細(xì)胞。
[0016] 圖3為重組蛋白CAP-B電鏡觀察結(jié)果；標(biāo)尺放大倍率為100000X，標(biāo)尺長200nm。
[0017] 圖4為重組蛋白CAP-BTB電鏡觀察結(jié)果；標(biāo)尺放大倍率為100000X，標(biāo)尺長200nm。
[0018] 圖5為組蛋白的SDS-PAGE和Western-Blot結(jié)果；A :泳道1為空細(xì)胞對照，2為桿 狀病毒感染細(xì)胞對照，3,5分別為04?-8,04?-818實驗組，4泳道為1&^1?^出 ：1，3￡9細(xì)胞 對照；2,空桿狀病毒感染對照，3, CAP-B實驗組，5, CAP-BTB實驗組，4泳道為Marker。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明實例中的兩種抗原基因按照FMDV 0型MYA98亞型毒株（0/BY/CHA/2010)的 核苷酸序列（GenBank: JN998085. 1)經(jīng)化學(xué)法合成。VP1上的141~160aa的抗原表位基因 命名為B基因，將141~160aa21~40aa--141~160aa串聯(lián)的基因命名為BTB基因。
[0020] 本發(fā)明所涉及的抗原表位組合方式參考了 0型口蹄疫基因工程多肽疫苗(專利 號：02137011. 7)。組合方式為141~160aa20~40aa(或其他表位)141_160aa串聯(lián)結(jié) 構(gòu)，在肽段連接處加入適當(dāng)氨基酸多肽作為接頭，如實例中采用的141_160aa-Pro-Gly- 21_40aa-Gin-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val--Pro-Ser-Arg- 141_160aa 的抗原多肽結(jié)構(gòu)，前后兩個接頭分別是2個和11個氨基酸。
[0021] 本發(fā)明選用的載體基因為PCV2的CAP基因（GeneBank :ACZ06084. 1)，從含有豬圓 環(huán)病毒（procine circovirus，PCV)0RF2 編碼的 Cap 蛋白基因（GeneBank :ACZ06084. 1)的 重組質(zhì)粒上擴增獲得。
[0022] 本實例米用invitrogen公司的bac to bac體系，其在重組桿狀病毒構(gòu)建時，使 用供體質(zhì)粒pFastBac和宿主菌DHlOBac