一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前兒童腫瘤比較多發(fā)，通常采用手術(shù)或化療治療，比如兒童視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的 治療方式主要是手術(shù)摘除眼球和局部化療，其中摘除眼球的方法雖然可根治腫瘤，但由于 付出代價(jià)高昂，已逐漸被淘汰，化療成為主要的方法，細(xì)胞毒性的藥物是目前各類兒童實(shí)體 腫瘤的主流化療方法；化療方案局限于傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物長(zhǎng)春新堿、卡鉑、環(huán)磷酰胺，長(zhǎng)春 新堿（vincristine，VCR)最為常用，微管抑制劑長(zhǎng)春新堿具有廣譜抗腫瘤作用，但毒副作 用較高；溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine，CQ)是一種弱堿，作用于溶酶體，可抑制溶酶體 酸性環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)各類蛋白和細(xì)胞器的降解，在臨床上用于治療瘧疾，由于發(fā)現(xiàn)氯喹可以 抑制自噬，一種細(xì)胞自我降解的生理機(jī)制和代謝途徑，而自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞存活通常具有促 進(jìn)作用，故氯喹被用于各類惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)性治療和臨床實(shí)驗(yàn)，包括乳腺癌，黑色素瘤，肝 癌，胰腺癌等多種成人高度惡性腫瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明是為了降低化療用藥量和毒性，增加化療效果，提供一種用量少，毒性低， 效果顯著的氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合， 包括氯喹、長(zhǎng)春新堿，二者化學(xué)式分別為：
[0005] 本方案通過(guò)細(xì)胞系體外培養(yǎng)和細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溶酶體抑制劑氯喹（CQ)與化 療藥物微管抑制劑長(zhǎng)春新堿（VCR)可協(xié)同殺傷、抑制多種兒童實(shí)體腫瘤，包括視網(wǎng)膜母細(xì) 胞瘤和腎母細(xì)胞瘤；其中，微管抑制劑長(zhǎng)春新堿造成腫瘤細(xì)胞有絲分裂障礙，而溶酶體抑制 劑氯喹造成腫瘤細(xì)胞細(xì)胞代謝障礙，二者合力致腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0006] 作為優(yōu)選，所述的藥物組合中，氯喹含量為2-40yM，長(zhǎng)春新堿含量為10nM。氯喹 與長(zhǎng)春新堿單用可以抑制HX0-Rb44細(xì)胞，兩種藥物效果強(qiáng)于單用，并可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡； 低劑量的藥物對(duì)細(xì)胞自噬無(wú)抑制作用，但仍可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促凋亡。
[0007] 作為優(yōu)選，所述的藥物組合中，氯喹含量為5-50yM，長(zhǎng)春新堿含量為20nM。單獨(dú) 使用氯喹可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401增殖并誘導(dǎo)凋亡，而5yM以上的氯喹聯(lián)用長(zhǎng)春新堿 可顯著提高抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401增殖并誘導(dǎo)凋亡的效果。
[0008] 因此，本發(fā)明具有如下有益效果：（1)與常規(guī)用藥量相比，本方案用量少，毒性低； (2)殺傷、抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤的效果顯著。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1是本發(fā)明針對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤效果示意圖一。
[0010] 圖2是本發(fā)明針對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤效果示意圖二。
[0011] 圖3是本發(fā)明針對(duì)腎母細(xì)胞瘤效果示意圖。
[0012] 圖4是本發(fā)明針對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤機(jī)制圖片，包括HRP化學(xué)發(fā)光法顯影自噬相關(guān) 蛋白條帶圖片。
[0013] 圖5是本發(fā)明不同含量組合針對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的HRP化學(xué)發(fā)光法顯影蛋白條帶 示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0015] 實(shí)施例1，一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合，包括氯喹、長(zhǎng)春新堿，其中氯喹含量為 2-40yM，長(zhǎng)春新堿含量為10nM。
[0016] 具體實(shí)施過(guò)程是，
[0017] 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HX0-Rb44細(xì)胞培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基（含10 %胎牛血清），生長(zhǎng)狀 態(tài)良好時(shí)接種于96孔板，加入藥物培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)目，計(jì)算細(xì) 藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率；
[0018] 細(xì)胞系和培養(yǎng)方法：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HX0-Rb44,此細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，用含 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C孵箱，含5%二氧化碳和飽和水蒸氣；
[0019]主要試劑：氯喹（CQ)，長(zhǎng)春新堿（VCR) ;40%丙烯酰胺凝膠貯存液，Tris堿，TEMED， SDS，蛋白酶抑制劑，蛋白上樣標(biāo)準(zhǔn)品，CCK8試劑盒，BCA試劑盒和HRP化學(xué)放光檢測(cè)試劑 盒；
[0020] 抗體：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3;抗鼠與抗兔HRP偶聯(lián)二抗；
[0021] 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)：將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞HX0_Rb44以IX10A4個(gè)/孔的密度接 種于96孔板，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入CCK8試劑，用酶標(biāo)儀讀取405nm吸光 度，根據(jù)讀數(shù)做出細(xì)胞抑制曲線；
[0022] 統(tǒng)計(jì)分析：每種藥物劑量重復(fù)5次，每次4個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示， 在2-40yM區(qū)間，氯喹可以協(xié)同長(zhǎng)春新堿（IOnM)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果，藥物聯(lián)用對(duì)腫瘤 細(xì)胞抑制率顯著提高，如圖1、圖2所示，同時(shí)，通過(guò)等輻射分析，證明兩個(gè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞 的抑制確為協(xié)同作用；
[0023] 免疫雜交（Westernblotting)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞用藥物處理后離心、PBS洗滌后，用預(yù)冷 的RIPA緩沖液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制劑）消化，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20yg的蛋白，用適當(dāng)?shù)目贵w進(jìn)行免疫雜交后，HRP化學(xué)發(fā)光 法顯影蛋白條帶，如圖4所不，兩種藥物聯(lián)用（CQ5yM，VCR10_20nM)可顯著提尚調(diào)亡標(biāo)記 蛋白caspase3片段的水平，而對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3與p62的水平影響不大。
[0024] 實(shí)施例2, 一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合，包括氯喹、長(zhǎng)春新堿，其中氯喹含量為 5-50yM，長(zhǎng)春新堿含量為20nM;
[0025] 具體實(shí)施過(guò)程是，
[0026] 腎母細(xì)胞瘤6401細(xì)胞培養(yǎng)于此&^54培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），生長(zhǎng)狀態(tài)良好 時(shí)，接種于96孔板。加入長(zhǎng)春新堿、氯喹共同培養(yǎng)24小時(shí)，然后通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞相 對(duì)數(shù)目，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率；
[0027] 細(xì)胞系和培養(yǎng)方法：腎母細(xì)胞瘤G401，此細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，用含10%胎牛血清的 McCoy5A培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C孵箱，含5%二氧化碳和飽和水蒸氣；
[0028] 主要試劑：氯喹（CQ)，長(zhǎng)春新堿（VCR) ;40%丙烯酰胺凝膠貯存液，Tris堿，TEMED， SDS，蛋白酶抑制劑，蛋白上樣標(biāo)準(zhǔn)品，CCK8試劑盒，BCA試劑盒和HRP化學(xué)放光檢測(cè)試劑 盒；
[0029] 抗體：一抗包括LC3,GAPDH，p62,caspase3 ;抗鼠與抗兔HRP偶聯(lián)二抗；
[0030] 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)：將腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞以IX10八4個(gè)/孔的密度接種于96孔 板，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入CCK8試劑，用酶標(biāo)儀讀取405nm吸光度。根據(jù) 讀數(shù)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)數(shù)目，做出藥物對(duì)細(xì)胞的抑制曲線；
[0031] 統(tǒng)計(jì)分析：每種藥物劑量重復(fù)5次，每次4個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示， 5-50yM氯喹可以抑制腎母細(xì)胞瘤G401，但效果很快達(dá)到飽和，20nM長(zhǎng)春新堿可抑制G401 細(xì)胞，加入5-50yM氯喹后，抑瘤作用產(chǎn)生協(xié)同和疊加，聯(lián)用的抑瘤率顯著高于單用，如圖3 所示，其中X軸為氯喹作用濃度（yM)，Y軸為抑瘤率（％)，曲線一為氯喹單獨(dú)作用效果，曲 線二為氯喹添加長(zhǎng)春新堿組合作用效果；
[0032] 免疫雜交（Westernblotting)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞用藥物處理后離心、PBS洗滌后，用預(yù)冷 的RIPA緩沖液（加入蛋白酶和磷酸化酶抑制劑）消化，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20yg的蛋白，用適當(dāng)?shù)目贵w進(jìn)行免疫雜交后，HRP化學(xué)發(fā)光 法顯影蛋白條帶，如圖5所示；有效抑制G401細(xì)胞的藥物單用與聯(lián)用條件下（VCR20nM，CQ 5yM)，凋亡相關(guān)蛋白caspase3片段均明顯升高，20nMVCR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力強(qiáng)于5yM CQ;而兩種藥物聯(lián)用后，caspase3片段水平比藥物單用組進(jìn)一步顯著上升，提示細(xì)胞凋亡 水平增加；同時(shí)，20nMVCR與5yMCQ對(duì)細(xì)胞自噬也產(chǎn)生一定影響，自噬受到抑制，體現(xiàn)為 自噬底物L(fēng)C3-II和p62水平增加，藥物組合使用組更加明顯；與HX0-Rb44細(xì)胞中觀察到的 現(xiàn)象相比，兩種藥物對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡的作用，而對(duì)自噬調(diào)節(jié)的作用不同，藥物 作用后腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞中自噬水平發(fā)生改變，而視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HX0-Rb44細(xì)胞自噬 水平未發(fā)生改變。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合，其特征在于，包括氯喹、長(zhǎng)春新堿，氯喹化學(xué)式為，長(zhǎng)春新堿化學(xué)式為，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合，其特征是，所述的藥物組 合中，氯喹含量為2-40yM，長(zhǎng)春新堿含量為10-100nM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合，其特征是，所述的藥物組 合中，氯喹含量為5-50yM，長(zhǎng)春新堿含量為10nM。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種氯喹與長(zhǎng)春新堿的藥物組合，包括氯喹、長(zhǎng)春新堿，其中氯喹含量為2-40μM，長(zhǎng)春新堿含量為10nM，或者氯喹含量為5-50μM，長(zhǎng)春新堿含量為20nM；兩種劑量的氯喹與長(zhǎng)春新堿可協(xié)同殺傷、抑制包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤在內(nèi)的多種兒童實(shí)體腫瘤，可作為化療藥物使用。本發(fā)明與常規(guī)用藥量相比，用量少，毒性低；殺傷、抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤的效果顯著。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/475, A61K31/4706
【公開(kāi)號(hào)】CN104906099
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510378133
【發(fā)明人】陳希
【申請(qǐng)人】杭州泛普生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月29日