一種山羊痘、綿羊痘二價細胞弱毒疫苗及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品技術領域，具體涉及一種山羊痘、綿羊痘二價細胞弱毒疫苗 及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 羊痘病毒（Capripoxvirus,CPV)是最重要的動物痘病毒，在分類地位上屬 于痘病毒科（Poxviridae)脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxrinae)中的羊痘病毒屬 (Capripoxvirus)成員，包括山羊痘病毒（Goatpoxvirus,GTPV)、綿羊痘病毒（Sheeppox virus,SPPV)和牛結節(jié)疼病毒（Lumpyskindiseasevirus,LSDV)。羊痕是由羊痕病毒引 起的一種急性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（FAO/OIE)列為93種必須報告的動物 疫病之一，我國將其列為一類傳染病。其發(fā)病率可達75%以上，死亡率可達50%以上，羔羊 死亡率可達100%，同時還可導致母羊流產(chǎn)。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次 報道了挪威的山羊痘。后來，陸續(xù)在世界其他地區(qū)報道了該病。廣泛分布于非洲、中東、印 度次大陸、北歐、地中海各國及德國、澳大利亞、美國等，特別是非洲北部、中東和亞洲的部 分國家流行較為嚴重。與我國接壤的周邊國家，如印度、孟加拉、尼伯爾、巴基斯坦、俄羅斯、 蒙古等不少國家均有本病的流行。近幾年我國的江蘇、廣東、貴州、山東、浙江、廣西、甘肅、 黑龍江等地均有本病流行。該病的爆發(fā)和流行使家畜的生產(chǎn)力下降，活畜及畜產(chǎn)品貿(mào)易停 滯，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成極大的經(jīng)濟損失。
[0003] 山羊痘（Goatpox)是山羊的一種高度接觸性傳染?。痪d羊痘病毒（Sheeppox)是 綿羊的一種高度接觸性傳染病。自然狀況下，羊痘病毒具有高度的宿主特異性，山羊痘 只引起山羊發(fā)?。痪d羊痘只引起綿羊發(fā)病。但這種宿主特異性常隨分離株的不同而變化。 Davies及KitehingandTaylor報道，肯尼亞、也門和阿曼的綿羊分離株可同時感染山羊和 綿羊。另外，山羊痘病毒（GTPV)和綿羊痘病毒（SPPV)在血清上呈交叉反應。近年來，國內(nèi) 外山羊痘、綿羊痘頻繁爆發(fā)，而山羊痘、綿羊痘尚無有效的治療方法，免疫接種是預防山羊 痘、綿羊痘唯一行之有效的措施。目前尚無一種能夠一針防兩病的山羊痘、綿羊痘二聯(lián)細胞 弱毒疫苗。目前羊痘、綿羊痘疫苗的研發(fā)和應用主要集中在常規(guī)疫苗，如滅活疫苗和細胞弱 毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亞單位疫苗、核酸疫苗和重組疫苗上。但是目前，羊痘、綿羊 痘新型疫苗的研制還處于試驗階段，且新型疫苗往往制備過程繁瑣、技術要求高，應用于臨 床還有很長一段路要走。羊痘、綿羊痘滅活疫苗雖然國內(nèi)外學者均有研宄，但其免疫效果有 限，從未真正應用于臨床。目前，在臨床上應用較為廣泛的仍然是羊痘弱毒疫苗，因為它具 有用量少，能誘導機體產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫能力，且產(chǎn)生免疫保護力的時間持 久的特點。山羊痘弱毒疫苗在國內(nèi)幾家疫苗廠家均有生產(chǎn)，但該疫苗生產(chǎn)過程需要羊睪丸 原代細胞，凍干保護劑不耐熱等工藝問題，使該疫苗生產(chǎn)、運輸及保存成本過高。山羊痘、綿 羊痘病毒二價細胞弱毒疫苗研宄，尚屬空白。因此，研制一種抗原譜廣、免疫原性好、制苗工 藝簡單的山羊痘、綿羊痘病毒二價細胞弱毒疫苗，對預防國內(nèi)山羊痘、綿羊痘爆發(fā)和流行具 有一加一大于二的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有羊痘、綿羊痘弱毒疫苗的不足，提供一種山羊痘、綿羊痘二價細胞 弱毒疫苗及其制備方法，以實現(xiàn)用簡單實用的制備方法生產(chǎn)出產(chǎn)量高、抗原譜廣、穩(wěn)定性 好、成本低、安全可靠的疫苗。
[0005] 本發(fā)明選用自行分離獲得的山羊痘病毒（GTPV)河南信陽市分離毒株（Goatpox virusHN2010株）和綿羊痕病毒（SPPV)甘肅武威株（SheeppoxVirusGS-Wff2010)株作 為疫苗研制的候選毒株，利用羊睪丸支持細胞系和雞胚成纖維原代細胞傳代致弱，培育出 符合"獸用新生物制品質(zhì)量標準"的GTPV和SPPV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐熱凍干保 護劑制備凍干弱毒疫苗。攻毒保護試驗結果顯示所制備的山羊痘、綿羊痘二價細胞弱毒疫 苗能夠產(chǎn)生有效的免疫保護力。因此，本發(fā)明利用GTPV、SPPV流行毒株研制安全、高效的弱 毒疫苗對于山羊痘、綿羊痘的防治具有重要的現(xiàn)實意義。
[0006] 本發(fā)明用羊睪丸原代細胞對河南株山羊痘病料進行適應分離的Goatpoxvirus HN2010株病毒傳代至16代，GTPV毒價IgTCID5c^ 3. 5時，將該細胞毒接種雞胚成纖維原代 細胞進行傳代致弱，傳代至36代時進行本動物安全試驗發(fā)現(xiàn)，該細胞毒在傳代至28代時已 致弱。然后繼續(xù)在羊睪丸原代細胞傳代至56代（弱毒適應羊睪丸原代細胞從零代次記）， 分別取傳代致弱毒21代、25代、30代、35代、40代、45代、50代7代次細胞毒（各代次細 胞病毒TCID5tl不小于10 3 5/0.ImL)進行本動物安全試驗，證實接種各代次Goatpoxvirus HN-XY2010株致弱毒株的羊只組在觀察期內(nèi)，各試驗組羊只在口腔粘膜均出現(xiàn)紅點，在接種 后3天自行消失。對照羊正常。證明致弱毒株GoatpoxvirusHN_XY2010株對綿羊、山羊均 安全、無致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。選擇GoatpoxvirusHN-XY2010株第43代致 弱毒株作為羊痘病毒弱毒疫苗株，命名為山羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株Goatpoxvirus HN-XY2010F43株，分類命名為山羊痘病毒細胞傳代致弱毒，并于2015年1月14日送交中 國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCCNO!V201503,保藏地址在武漢大學。
[0007] 用羊睪丸原代細胞對甘肅武威株綿羊痘病陽性病料進行適應分離的She印pox VirusGS-Wff2010株病毒傳代至17代，GTPV毒價IgTCID5tl彡3. 5時，將該細胞毒接種雞胚 成纖維原代細胞進行傳代致弱，傳代至37代時進行本動物安全試驗發(fā)現(xiàn)，該細胞毒在傳代 至26代時已致弱。然后繼續(xù)在羊睪丸原代細胞傳代至58代（弱毒適應羊睪丸原代細胞從 零代次記），分別取傳代致弱毒25代、30代、35代、40代、45代、50代、55代7代次細胞毒（各 代次細胞病毒TCID5tl不小于10 3 5/0.ImL)進行本動物安全試驗，證實接種各代次She印pox VirusGS-Wff2010株致弱毒株的羊只組在觀察期內(nèi)，各試驗組羊只，在口腔粘膜均出現(xiàn)紅 點，在接種后3天自行消失。對照羊正常。證明致弱毒株SheeppoxVirusGS-WW2010株對 綿羊、山羊均安全、無致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。選擇SheeppoxVirusGS-Wff2010 株第44代致弱毒株作為綿羊痘病毒弱毒疫苗株，命名為綿羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株 SheeppoxVirusGS-Wff2010株，分類命名為綿羊痘病毒細胞傳代致弱毒，并于2015年1 月14日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCCNO!V201504,保藏地址在武漢大 學。
[0008] 本發(fā)明提供一種山羊痘、綿羊痘二價細胞弱毒疫苗，所述弱毒疫苗的有效成分包 括山羊痘病毒細胞傳代致弱毒以及綿羊痘病毒細胞傳代致弱毒；其中，所述山羊痘病毒細 胞傳代致弱毒為山羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株CCTCC V201503,所述綿羊痘病毒細胞傳代致弱毒為綿羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株She印pox VirusGS-Wff2010F44 株CCTCCV201504。
[0009] 所述山羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株CCTCC V201503與綿羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株She印poxVirusGS-Wff2010F44株CCTCC V201504的體積比為1:1。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述山羊痘、綿羊痘二價細胞弱毒疫苗的制備方法， 包括以下步驟：
[0011] ⑴病毒抗原的制備
[0012] 選生長良好布滿單層的新生羊睪丸原代細胞，傾去營養(yǎng)液，按原營養(yǎng)液體積的 1-10%分別接種山羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株CCTCC V201503和綿羊痘病毒細胞傳代致弱疫苗株She印poxVirusGS-Wff2010F44株CCTCC V201504,吸附5-15分鐘后加DMEM維持液，調(diào)pH至7. 0~7. 2,加青霉素、鏈霉素各100單 位/ml，于37°C、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)40~72h，細胞病變達到75%以上時 收獲病毒，置_20°C冰箱反復凍融兩次，檢驗合格且病毒滴度不低于KT3 5TCID5tlA).lml，得 到山羊痘、綿羊痘病毒細胞傳代致弱毒抗原；
[0013] (2)疫苗的配制
[0014] 將步驟（1)制備的山羊痘、綿羊痘病毒細胞傳代致弱毒抗原以體積比1 :1混合，再 與耐熱凍干保護劑以體積比I: 1的比例混勻后，低溫冷凍凍干，得到疫苗。
[0015] 優(yōu)選地，所述耐熱凍干保護劑的配方為：海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/ L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L，明膠5~15g/L，精氨酸0. 5~4g/L，維生素C1~5g/L， 剩余成分為超純水。
[0016] 該凍干保護劑具有耐熱性好、可有效保護抗原成分的降解，配方成分及制備方法 簡單，可在任何生物制品廠實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。
[0017] 最優(yōu)選地，所述耐熱凍干保護劑的配方為：海藻糖50g/L，脫脂奶粉20g/L，聚乙烯 吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸I. 5g/L，維生素C2. 5g/L，剩余成分為超純水。
[0018] 其中，所述耐熱凍干保護劑的制備方法為：
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