一種治療圓錐角膜病的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于眼科疾病治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以Nrf2-ARE信號(hào)通路為靶點(diǎn)的藥物在圓錐角膜病治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]圓錐角膜(Keratoconus，KC)是一種以角膜擴(kuò)張為特征，致角膜中央部向前凸出、變薄呈圓錐形并產(chǎn)生高度不規(guī)則散光的角膜病變。在組織病理學(xué)表現(xiàn)為角膜上皮細(xì)胞層變薄，Bowman’ s膜和Descemet’ s層撕裂，角膜基質(zhì)層變薄、膠原含量下降和癥痕化。該病通常始發(fā)于青少年時(shí)期，患者早期多可以用框架鏡屈光矯正視力；隨病情發(fā)展，可戴硬性接觸鏡或者行角膜表層鏡片術(shù)；晚期視力明顯下降，需要進(jìn)行角膜移植術(shù)得以恢復(fù)部分視力。
[0003]圓錐角膜的病因至今不明，可能與多種原因，譬如眼表機(jī)械摩擦、接觸鏡的長期配戴、眼表過敏性炎癥等有關(guān)，早期臨床干預(yù)治療尚是空白:即使臨床早期診斷圓錐角膜后依然沒有任何治療和干預(yù)的方法，唯有等待疾病的自然發(fā)展，等角膜擴(kuò)張到一定階段，依賴硬性接觸鏡矯形暫時(shí)維持視力，后期嚴(yán)重階段，角膜移植術(shù)是唯一可能得以恢復(fù)部分視力的方法，但是角膜移植術(shù)后可能存在免疫排斥反應(yīng)和角膜植片慢性失功，從而導(dǎo)致植片混濁而需要再次接受角膜移植手術(shù)，并且角膜材料日益緊缺無疑延長了患者等待的時(shí)間和錯(cuò)失最佳的治療時(shí)機(jī)，對(duì)患者的經(jīng)濟(jì)和身心影響都很大。
[0004]本發(fā)明以圓錐角膜Nrf2-ARE信號(hào)通路活化缺陷為靶點(diǎn)，提供一種治療圓錐角膜的藥物，可用于該病的早期干預(yù)治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種以Nrf2-ARE信號(hào)通路為靶點(diǎn)的治療圓錐角膜病的藥物，該藥物能夠激活該信號(hào)通路，提高下游抗氧化基因NQO-1、S0D2表達(dá)量，進(jìn)而降低基質(zhì)降解酶表達(dá)量，抑制圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原降解，可用于圓錐角膜病的治療。
[0006]本發(fā)明提供化合物或組合物的一種新用途，是在制備治療圓錐角膜病的制品中的應(yīng)用，其中所述的物質(zhì)能夠激活Nrf2-ARE信號(hào)通路；
[0007]上述的化合物優(yōu)選為甲基化抑制劑5’aza ;異硫氰酸鹽sulforaphane (SFN);姜黃素 Curcumin ;多酸類黃酮 epigal locatechin gal late (EGCG)；
[0008]作為優(yōu)選，上述的制品為滴眼液；其中包含藥理有效濃度的5’ aza ；SFN ；Curcumin ；EGCG ；
[0009]所述的制品還可以是注射液；
[0010]作為優(yōu)選，甲基化抑制劑5’ aza的濃度為0.5、1 μΜ。
[0011]本發(fā)明采用甲基化抑制劑5’ aza來治療圓錐角膜病，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)5’ aza可提高圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞抗氧化基因的表達(dá)，同時(shí)降低基質(zhì)降解酶的含量，抑制圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原降解，可用于圓錐角膜的治療。
【附圖說明】
[0012]圖1:圓錐角膜樣本核內(nèi)NRF2基因蛋白表達(dá)量高于正常角膜組。
[0013]圖2:圓錐角膜組樣本HO-1，NQO-1, S0D2等抗氧化基因表達(dá)量低于正常角膜組。
[0014]圖3:圓錐角膜組樣本ROS水平高于正常角膜組。
[0015]圖4:圓錐角膜組樣本UPA，UPAR，MMP2等基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)量高于正常角膜組。
[0016]圖5:外源添加甲基化抑制劑5’aza可提高圓錐角膜組樣本NQ0_1，S0D2抗氧化基因表達(dá)，同時(shí)降低UPA等基質(zhì)降解酶表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]申請(qǐng)人在長期的研宄中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路Nrf2_ARE信號(hào)通路在圓錐角膜中活化有缺陷，是圓錐角膜病治療的新靶點(diǎn)。而能夠激活該信號(hào)通路，提高下游抗氧化基因NQ0-1、S0D2表達(dá)量的藥物，具有治療圓錐角膜的作用。本發(fā)明在圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的過程中加入甲基化抑制劑5’ aza，能有效提高樣本NQ0-1等抗氧化基因表達(dá)量，同時(shí)降低UPA等基質(zhì)降解酶的表達(dá)量，抑制圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原降解，可用于治療圓錐角膜病，從而促成了本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1:添加不同濃度5’ aza對(duì)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞抗氧化基因的影響
[0019]角膜組織采用Dispase (50mg/ml)4°C過夜處理，去除角膜上皮和內(nèi)皮，角膜基質(zhì)剪碎后采用膠原酶(1.25mg/ml)37°C消化6-8小時(shí)，吹打離散、離心、棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基37°C 0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA進(jìn)行傳代。在角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程中，取P3代細(xì)胞IXlO6按核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒(Thermo，78833)步驟提取細(xì)胞核蛋白，用wentern blot檢測(cè)正常和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量。圓錐角膜樣本核內(nèi)nrf2基因表達(dá)量高于正常角膜組，見圖1。
[0020]取上述P3代細(xì)胞5X105，常規(guī)wentern blot檢測(cè)正常和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2下游抗氧化基因NQO-1，H0-1，S0D2蛋白表達(dá)量。另外收集上述細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析抗氧化基因表達(dá)情況。圓錐角膜樣本抗氧化基因表達(dá)量低于正常角膜組，見圖2。同時(shí)，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞活性氧水平ROS高于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞(圖3)，圓錐角膜樣本UPA，UPAR, MMP2等基質(zhì)降解酶表達(dá)量高于正常角膜組，見圖4。由此證明Nrf2_ARE信號(hào)通路活化缺陷為圓錐角膜治療新靶點(diǎn)。
[0021]在圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程中，加入不同濃度的甲基化抑制劑5’aza(0、0.5、IuM)，培養(yǎng)48h后，取細(xì)胞5X105，常規(guī)wentern blot檢測(cè)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2下游抗氧化基因NQ0-1、S0D2蛋白表達(dá)量。5’ aza處理后，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的NQ0-1、S0D2蛋白表達(dá)量高于未處理組。如圖5。
[0022]實(shí)施例2:添加不同濃度5’ aza對(duì)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)降解酶表達(dá)的影響
[0023]在圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程中，加入不同濃度的甲基化抑制劑5’aza(0、0.5、1 μπι)，培養(yǎng)48h后，取細(xì)胞5Χ105，常規(guī)wentern blot檢測(cè)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)降解酶UPA的蛋白表達(dá)量。5’aza處理后，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的uPA蛋白表達(dá)量低于未處理組，如圖5。另外，采用膠原降解實(shí)驗(yàn)，在圓錐角膜基質(zhì)三維膠原凝膠表面分別添加含纖溶酶原(100mg/L)及不同濃度(0、0.5、1 ym)5’ aza的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h，測(cè)定培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量做為膠原降解活性，5’aza以劑量依賴關(guān)系減少圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原降解，可用于治療圓錐角膜病。
[0024]實(shí)施例3:添加不同濃度SFN對(duì)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)降解酶表達(dá)的影響
[0025]在圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程中，加入不同濃度的SFN(0、5、10yM)，培養(yǎng)24h后，取IXlO6按核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒(Thermo，78833)步驟提取細(xì)胞核蛋白，用wentern blot檢測(cè)藥物處理后圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量。另外取上述細(xì)胞5X105，常規(guī)wentern blot檢測(cè)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)降解酶UPA的蛋白表達(dá)量。SFN處理后，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量提高；且藥物處理后，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞UPA蛋白表達(dá)量低于未處理組。另外，采用膠原降解實(shí)驗(yàn)，在圓錐角膜基質(zhì)三維膠原凝膠表面分別添加含纖溶酶原(100mg/L)及不同濃度(0、5、10μM)SFN的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量做為膠原降解活性，SFN以劑量依賴關(guān)系減少圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原降解，可用于治療圓錐角膜病。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種化合物或組合物的用途，其特征在于，所述的用途是在制備治療圓錐角膜病的制品中的應(yīng)用，其中所述的物質(zhì)能夠激活Nrf2-ARE信號(hào)通路。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物為甲基化抑制劑5-aza、異硫氰酸鹽、姜黃素；多酚類黃酮中的一種或幾種。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治療圓錐角膜病的制品為滴眼液。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治療圓錐角膜病的制品為注射液。
5.—種滴眼液，其特征在于，所述的滴眼液中包含有藥理有效濃度的甲基化抑制劑5-aza、異硫氰酸鹽、姜黃素；多酚類黃酮中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求5所述的滴眼液，其特征在于，所述的藥理有效濃度為0.5-1 μ Mo
7.—種注射液，其特征在于，所述的滴眼液中包含有藥理有效濃度的甲基化抑制劑5-aza、異硫氰酸鹽、姜黃素；多酚類黃酮中的一種或幾種。
8.如權(quán)利要求7所述的注射液，其特征在于，所述的藥理有效濃度為0.5-1 μ Mo
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種以Nrf2-ARE信號(hào)通路為靶點(diǎn)的治療圓錐角膜病的藥物，該藥物能夠激活該信號(hào)通路，或提高下游抗氧化基因NQO-1、SOD2表達(dá)量，進(jìn)而降低基質(zhì)降解酶表達(dá)量，可用于圓錐角膜病的治療。本發(fā)明采用甲基化抑制劑5-aza來治療圓錐角膜病，可提高圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞抗氧化基因的表達(dá)，同時(shí)降低基質(zhì)降解酶的含量。
【IPC分類】A61K45-00, A61K31-12, A61P27-02, A61K31-26
【公開號(hào)】CN104667281
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510053932
【發(fā)明人】曲明俐, 周慶軍, 邊江, 王瑤, 楊玲玲
【申請(qǐng)人】山東省眼科研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年2月2日