性肺炎球菌溶血素釋放）和化膿性鏈球菌感染（鏈球菌溶血素〇的急性釋放）過程中，釋 放的毒素而為患者提供額外益處。
[0110] 在這種組合治療中，可以考慮空脂質(zhì)體和脂質(zhì)體混合物作為佐劑和相應(yīng)的治療方 法作為輔助治療。
[0111] 脂質(zhì)體治療的限制是其在免疫力低下個(gè)體中的限制效率，因?yàn)榧?xì)菌的清除不在于 用化療劑，而在于用宿主的自身免疫系統(tǒng)。然而，甚至在免疫缺陷患者中，脂質(zhì)體治療組合 殺細(xì)菌化療將是有益的：減慢全身性疾病的發(fā)展，并因此將提供為生物體提供許多所需時(shí) 間，以允許抗生素展開它們的充分殺細(xì)菌潛力。
[0112] 與使用根據(jù)本發(fā)明的空脂質(zhì)體的治療一起考慮的抗生素治療是，例如，用如上列 出的頭孢菌素類和其他β內(nèi)酰胺類抗生素、糖肽類、林可酰胺類、脂肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、青 霉素類和青霉素組合、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素和氯霉素類似物、四環(huán)素類、克林霉素和葉 酸抑制劑治療。治療中與本發(fā)明的空脂質(zhì)體一起考慮的具體抗生素是碳青霉烯類，諸如亞 胺培南、cilastin和美羅培南，第二代頭孢菌素類諸如頭孢呋辛，第三代頭孢菌素類諸如頭 孢他啶和頭孢曲松，第四代頭孢菌素類諸如頭孢吡肟，糖肽類諸如萬古霉素，大環(huán)內(nèi)酯類諸 如克拉霉素,青霉素類諸如阿莫西林和flucloxacyllin，青霉素組合諸如阿莫西林/克拉 維酸和哌拉西林/他唑巴坦組合，喹諾酮類諸如環(huán)丙沙星和莫西沙星，和氟喹諾酮類諸如 左氧氟沙星和吉米沙星。
[0113] 本發(fā)明的空脂質(zhì)體的所有組分是天然存在于人的物質(zhì)。因此，這些脂質(zhì)體是良好 耐受的，且經(jīng)由生理途徑從體內(nèi)清除。脂質(zhì)體氣溶膠應(yīng)當(dāng)用于在季節(jié)性流感流行過程中預(yù) 防一般群體的肺炎和其他呼吸道疾病。最重要地，基于脂質(zhì)體氣溶膠或其他脂質(zhì)體應(yīng)用的 預(yù)防性措施將有助于醫(yī)院內(nèi)、綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌感染和其他有 利于感染性疾病傳播的環(huán)境下預(yù)防MRSA肺炎或菌血癥。 實(shí)施例
[0114] 毒素 來自化膿性鏈球菌（iOcoccw1S /yOgefles)的鏈球菌溶血素0 (SL0)、來自金 黃色葡萄球菌（SiaMWococcM atfreiAs)的α溶血素、來自破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌的破 傷風(fēng)菌溶血素（TL)和來自產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的磷脂 酶C購自Sigma。肺炎球菌溶血素獲得自Kadioglu教授（Cruse G.等人，J. Immunol. 2012; 184:7108-7115)。其他毒素包括來自金黃色葡萄球菌的Panton-Valentine殺白 細(xì)胞素（PVL)、來自單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)的李斯特菌 溶血素0 (LLO)、來自產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridium perfringens)的產(chǎn)氣莢膜溶 血素（Perfringolysin)O (PFO)、來自豬鏈球菌的豬溶血素（SLY)、來自中間型鏈球菌的 中間型溶血素（intermedilysin) (ILY)、來自錯(cuò)狀芽孢桿菌的錯(cuò)狀溶血素（cereolysin) 0 (CL0)、來自蘇云金芽孢桿菌的蘇云金溶血素（thuringiolysin)O (TL0)、來自肉毒梭 狀芽孢桿菌的肉毒溶血素（botulinolysin) (BLY)、來自索氏梭狀芽孢桿菌的索氏溶血素 (sordellilysin) (SDL)、來自化膿性隱秘桿菌的化膿性溶血素（pyolysin) (PL0)。來自肺炎 鏈球菌、化膿性鏈球菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)上清液獲得自尤MUhlemann教授（Bern) 和 Ε· Gulbins 教授（Essen)。
[0115] 細(xì)朐培養(yǎng) 如 Monastyrskaya K 等人，Cell Calcium. 2007，41:207-219 所述維持人胚胎腎細(xì)胞 系（HEK 293)。將人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（THP-I)維持在含有10% FBS，2 mM L-谷 氨酰胺和100U/ ml青霉素，100 μ g/ ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
[0116] 笠染 將CFP(青色熒光蛋白）在HEK 293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)（Monastyrskaya等人，在上述引 文中）。轉(zhuǎn)染后2天，表達(dá)CFP的HEK 293細(xì)胞用于激光掃描模塊（LSM)成像實(shí)驗(yàn)。
[0117] 脂質(zhì)體 膽固醇（Ch) (C-8667)、來自雞蛋黃的鞘磷脂（Sm) (S0756)、來自大豆的磷脂酰膽堿 (PC) (P7443)、來自牛腦的磷脂酰乙醇胺（PE) (P9137)和來自牛腦的磷脂酰絲氨酸（PS) 鈉鹽（P5660)購自Sigma。將脂質(zhì)以I mg/ml濃度單獨(dú)溶解在氯仿中并儲(chǔ)存在-20°C。為了 制備脂質(zhì)體，將單個(gè)脂質(zhì)的氯仿溶液以文本中給出的組成和比例混合，以產(chǎn)生常規(guī)50-500 μ 1最終溶液。在60°C完全蒸發(fā)氯仿20-50 min。將50 μ 1或100 μ 1含有2. 5 mM CaCl2 的臺氏緩沖液（140 mM NaCl, 5 mM KC1, I mM MgCl2, 10 mM 葡萄糖，10 mM HEPES; ρΗ=7. 4)添加至含有干燥脂質(zhì)的薄膜的管中，并劇烈渦旋。將脂質(zhì)懸浮液在劇烈搖動(dòng)的情 況下在Eppendorf恒溫混合器中在45°C孵育20-30 min。為了產(chǎn)生脂質(zhì)體，將最終脂質(zhì)懸 浮液在Bandelin Sonopuls超聲儀中以70%功率在6°C超聲處理3x5秒。將脂質(zhì)體制劑在 6°C放置至少1小時(shí)，然后將它們用于實(shí)驗(yàn)中。脂質(zhì)體中單個(gè)脂質(zhì)的濃度總是作為重量/重 量（w/w)比率給出。在含有膽固醇和鞘磷脂的脂質(zhì)體中，1:1 (w/w)比率對應(yīng)于50% (w/w) 或66 mol%膽固醇。脂質(zhì)體的量作為用于制備它們的總脂質(zhì)的量給出。
[0118] 在替代方法中，約25 ml各制劑通過乙醇水化和擠壓法制備。將最終制劑無菌過 濾，且填充在高壓滅菌血清玻璃小瓶中（終濃度：40 mg/ml)。脂質(zhì)體顆粒大小在80-150 nm 范圍內(nèi)，且具有良好的roi(多分散性指數(shù)）。還包括重量摩爾滲透壓濃度測量的結(jié)果。它 們都在約400 mmol/kg的范圍內(nèi)，這非常接近期望的生理水平。
[0119] 表1:技術(shù)參數(shù)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體，和包含膽固醇和鞘磷脂、或磷脂酰膽堿和鞘磷脂 的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成的其他空脂質(zhì)體的混合物，其用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體，和 包含膽固醇和鞘磷脂、或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與包含脂質(zhì)或磷脂的其他空脂質(zhì) 體的混合物，所述脂質(zhì)或磷脂選自膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰絲氨酸、二酰基甘油、和含有一個(gè)或兩個(gè)長于4個(gè)碳原子且最多達(dá)28個(gè)碳原子的飽 和或不飽和脂肪酸的磷脂酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多 膽固醇的空脂質(zhì)體，和包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多膽固醇的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成 的其他空脂質(zhì)體的混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含膽固醇和鞘磷脂或 由其組成的空脂質(zhì)體與包含鞘磷脂或由其組成的其他空脂質(zhì)體的脂質(zhì)體混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含磷脂酰膽堿和鞘磷脂或由其 組成的空脂質(zhì)體與包含鞘磷脂或由其組成的其他空脂質(zhì)體的脂質(zhì)體混合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含膽固醇和鞘磷脂或 由其組成的空脂質(zhì)體與包含磷脂酰膽堿和鞘磷脂或由其組成的其他空脂質(zhì)體與由鞘磷脂 組成的空脂質(zhì)體的脂質(zhì)體混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含膽固醇和鞘磷脂或 由其組成的空脂質(zhì)體與包含磷脂酰膽堿和鞘磷脂或由其組成的其他空脂質(zhì)體與由鞘磷脂 組成的空脂質(zhì)體與包含膽固醇和磷脂酰膽堿或由其組成的空脂質(zhì)體的脂質(zhì)體混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的包含膽固醇和鞘磷脂的 空脂質(zhì)體，和包含膽固醇和鞘磷脂、或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成的 其他空脂質(zhì)體的混合物，其中一些或所有脂質(zhì)體用聚乙二醇修飾。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體，和包含膽固醇和鞘 磷脂、或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成的其他空脂質(zhì)體的混合物，其用 于治療和預(yù)防菌血癥，細(xì)菌感染的皮膚病變，腦膜炎和呼吸道感染。
10. 包含膽固醇和鞘磷脂和任選的磷脂酰膽堿且覆蓋非脂質(zhì)表面的脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)單 層，其用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染。
11. 包含膽固醇和鞘磷脂或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成的其他空 脂質(zhì)體的混合物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的混合物，其為包含膽固醇和鞘磷脂或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空 脂質(zhì)體與由鞘磷脂組成的空脂質(zhì)體的混合物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的混合物，其為包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與包含磷脂 酰膽堿和鞘磷脂的其他空脂質(zhì)體與由鞘磷脂組成的空脂質(zhì)體的混合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的混合物，其為包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與 包含磷脂酰膽堿和鞘磷脂的其他空脂質(zhì)體與由鞘磷脂組成的空脂質(zhì)體與包含膽固醇和磷 脂酰膽堿的空脂質(zhì)體的混合物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的混合物，其為其中一些或所有脂質(zhì)體用聚乙二醇 修飾的空脂質(zhì)體的混合物。
16. 治療細(xì)菌感染的方法，其包括向有需要的患者施用治療有效量的包含膽固醇和鞘 磷脂的空脂質(zhì)體，或包含膽固醇和鞘磷脂或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組 成的其他空脂質(zhì)體的混合物。
17. 預(yù)防細(xì)菌感染的方法，其包括向暴露于感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用預(yù)防量的對于預(yù)防 有效的包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體，或包含膽固醇和鞘磷脂或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的 空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成的其他空脂質(zhì)體的混合物。
18. 治療細(xì)菌感染的方法，其包括在針對細(xì)菌感染的標(biāo)準(zhǔn)抗生素治療之前、之后、一起 或平行地向有需要的患者施用治療有效量的包含膽固醇和鞘磷脂的空脂質(zhì)體，或包含膽固 醇和鞘磷脂或磷脂酰膽堿和鞘磷脂的空脂質(zhì)體與定義脂質(zhì)組成的其他空脂質(zhì)體的混合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體或定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體的混合物用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的用途和定義脂質(zhì)組成的其他脂質(zhì)雙層或單層用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，此類脂質(zhì)體，特別是包含膽固醇和鞘磷脂的脂質(zhì)體、由鞘磷脂組成的脂質(zhì)體、包含鞘磷脂和磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體和包含膽固醇和磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體的二和四組分混合物有效隔絕由細(xì)菌分泌的各種毒素，從而防止細(xì)菌毒素結(jié)合至靶細(xì)胞和靶細(xì)胞的毒素誘導(dǎo)的裂解。經(jīng)靜脈內(nèi)注射，脂質(zhì)體混合物防止了用致死劑量的金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌感染的實(shí)驗(yàn)室小鼠的死亡。
【IPC分類】A61K9-127, A61K9-10
【公開號】CN104602672
【申請?zhí)枴緾N201380031384
【發(fā)明人】E.巴比楚克, A.德拉伊格
【申請人】伯爾尼大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2013年6月13日
【公告號】CA2875470A1, EP2861214A1, US20150157570, WO2013186286A1