用于治療細(xì)菌感染的定制脂質(zhì)體的制作方法
【專利說明】用于治療細(xì)菌感染的定制脂質(zhì)體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及空脂質(zhì)體或脂質(zhì)體混合物用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的用途和定義脂 質(zhì)組成的其他脂質(zhì)雙層或單層用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染的用途。同樣，本發(fā)明涉及此類細(xì) 菌感染的治療方法，其包括單獨或組合標(biāo)準(zhǔn)抗生素治療施用空脂質(zhì)體或脂質(zhì)體混合物。此 夕卜，本發(fā)明同樣涉及新脂質(zhì)體混合物。
[0002] 發(fā)明背景 細(xì)菌感染仍然是人生命的主要威脅之一。由于對甚至最有效的抗生素的細(xì)菌耐藥性增 力口，所以也必須努力鑒定新型抗菌策略。在其他致病因素中，許多致病細(xì)菌分泌毒素，所述 毒素通過干擾真核細(xì)胞的質(zhì)膜殺死真核細(xì)胞。細(xì)菌成孔毒素在細(xì)胞表面上是有活性的，弓丨 起孔形成和質(zhì)膜破壞，隨后宿主靶細(xì)胞的裂解或凋亡，然而細(xì)菌磷脂酶通過質(zhì)膜磷脂的酶 促降解而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡。
[0003] 細(xì)菌膜去穩(wěn)定毒素，諸如膽固醇依賴的溶細(xì)胞素（CDCs:肺炎球菌溶血素0、鏈球 菌溶血素〇、破傷風(fēng)菌溶血素），α溶血素或細(xì)菌磷脂酶（磷脂酶C、鞘磷脂酶）在感染性疾 病的確立和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此類疾病是肺炎，所有年齡組中死亡的主要原因和低收 入國家中兒童死亡的主要原因；菌血癥，感染或外科手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，其特征在于由于膿 毒癥和膿毒性休克導(dǎo)致的高死亡率；和腦膜炎，危及生命的疾病，其也導(dǎo)致了嚴(yán)重的長期后 果，諸如耳聾、癲癇、腦積水和認(rèn)知缺陷。
[0004] 為了靶向宿主細(xì)胞，細(xì)菌膜去穩(wěn)定毒素或結(jié)合至單個膜脂質(zhì)（脂質(zhì)頭部基團）或 利用真核細(xì)胞的質(zhì)膜的脂質(zhì)雙層的不均勻性質(zhì)，與某些脂質(zhì)種類中富集的微結(jié)構(gòu)域相互作 用（Gonzales M.R.等人，Cell. Mol. LifeSci. 2008，65:493-507)。體內(nèi)條件不利于雙 層內(nèi)脂質(zhì)的非均勻分布，因為跨膜蛋白和眾多具有可變長度的單個脂質(zhì)種類的存在以及它 們的?；湹娘柡蜖顩r反對脂質(zhì)去混合，和從而穩(wěn)定的脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域的形成（Simons K.和 Gerl E J·，Nat. Rev. Moh CellBioh 2010，11:688-99)。然而，在從有限數(shù)量的仔細(xì) 選擇的脂質(zhì)種類制備的人工無蛋白脂質(zhì)體（其中可以生成延長的穩(wěn)定的脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域）中 可以盡其極采用脂質(zhì)去混合（Klose C.等人，J. Biol. Chem. 2010，285:30224-32)。此 夕卜，人工脂質(zhì)體允許比體內(nèi)以往可能存在的脂質(zhì)高得多的相對濃度的特定脂質(zhì)。因此，可以 產(chǎn)生展示定義生物化學(xué)特性的穩(wěn)定脂質(zhì)微結(jié)構(gòu)域且具有高相對濃度的特定脂質(zhì)的脂質(zhì)體。 脂質(zhì)體目前在化妝品和制藥工業(yè)中用作用于局部和全身藥物遞送的載體，且被認(rèn)為是無毒 的。
[0005] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體或定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體的混合物用于治療 和預(yù)防細(xì)菌感染，特別是皮膚病變、菌血癥、腦膜炎、呼吸道感染諸如肺炎和腹腔感染諸如 腹膜炎的用途。
[0006] 本發(fā)明還涉及覆蓋非脂質(zhì)表面的定義脂質(zhì)組成的脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)單層，其用于治 療和預(yù)防細(xì)菌感染。
[0007] 同樣，本發(fā)明涉及此類細(xì)菌感染的治療方法，其包括向有需要的患者施用治療有 效量的定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體或定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體的混合物，和預(yù)防有風(fēng)險的受 試者中的此類細(xì)菌感染的方法。此外，本發(fā)明涉及細(xì)菌感染的治療方法，其包括在細(xì)菌感染 的標(biāo)準(zhǔn)抗生素治療之前、之后、一起或平行地向有需要的患者施用治療有效量的定義脂質(zhì) 組成的空脂質(zhì)體或定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體的混合物。
[0008] 此外，本發(fā)明涉及定義脂質(zhì)組成的空脂質(zhì)體的新混合物。
[0009] 附圖簡述 圖L由膽固醇和鞘磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體保護單核細(xì)胞免受膽固醇依賴的溶細(xì)胞素 、a 溶血素和磷脂酶C的影響。
[0010] A-D)含有膽固醇組合PC (3)、Sm (4)或PS (5)，但不組合PE (6)的脂質(zhì)體（1:1 w/w混合物）保護THP-I細(xì)胞免受膽固醇依賴的溶細(xì)胞素：肺炎球菌溶血素0 (A)、鏈球菌 溶血素0 (B)、破傷風(fēng)菌溶血素（C)以及磷脂酶C(D)的影響。
[0011] E)含有膽固醇組合Sm (4)，但不組合PC (3)、PS (5)或PE (6)的脂質(zhì)體（1:1 w/w)保護THP-I細(xì)胞免受α溶血素的影響。
[0012] F)無膽固醇的脂質(zhì)體（7-9)是無效的。
[0013] c (r. U.)=相對于在毒素（2)不存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)的在毒素（1，3-9) 存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)以相對單位（r. u.)給出。PLY=肺炎球菌溶血素0 ;SL0=鏈球菌 溶血素 OJL=破傷風(fēng)菌溶血素；PLC=磷脂酶C ; HML=Ci溶血素。1=對照（無脂質(zhì)體）； 2 =對照（無毒素），3= Ch: PC (I: I w/w)脂質(zhì)體；4= Ch: Sm (I: I w/w)脂質(zhì)體；5= Ch: PS (1:1 w/w)脂質(zhì)體；6= Ch:PE (1:1 w/w)脂質(zhì)體；7= PC:Sm (1:1 w/w)脂質(zhì)體；8= Sm脂質(zhì) 體；9= PC脂質(zhì)體。Ch =膽固醇；PC=磷脂酰膽堿；PS=磷脂酰絲氨酸；Sm =鞘磷脂；PE=磷 脂酰乙醇胺。
[0014] 圖2.由膽固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)構(gòu)成的脂質(zhì)體在微克量保護單核細(xì)胞免受膽 固醇依賴的溶細(xì)胞素的影響，而對于針對金黃色葡萄球菌a溶血素和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢 桿菌磷脂酶C的保護則需要25-100微克的脂質(zhì)體。
[0015] A)針對0.2微克PLY的保護。B)針對0.4微克SLO的保護。C)針對0.2微克 TL的保護。D)針對1.2微克HML的保護。E)針對4. 5微克PLC的保護。
[0016] c (r.u.)=相對于在毒素不存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)的在毒素存在的情況下 維持的細(xì)胞數(shù)，以相對單位給出。X軸：LP (mkg)=脂質(zhì)體的量（微克）。PLY=肺炎球菌溶 血素0 ;SL0=鏈球菌溶血素0 ;TL=破傷風(fēng)菌溶血素；HML= α溶血素；PLC=磷脂酶C。
[0017] 圖3.對于由膽固醇和鞘磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體需要高于30% (w/w)的濃度的膽固醇 來保護單核細(xì)胞免受肺炎球菌溶血素、破傷風(fēng)菌溶血素或α溶血素的影響。
[0018] A)針對0.2微克PLY的保護。B)針對0.2微克TL的保護。C)針對1.2微克 HML的保護。c (r.u.)=相對于在毒素不存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)的在毒素存在的情況 下維持的細(xì)胞數(shù)，以相對單位給出。Ch (%)=由膽固醇和鞘磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體中膽固醇的 百分比（w/w)。PLY=肺炎球菌溶血素；TL=破傷風(fēng)菌溶血素；HML= α溶血素。
[0019] 圖4.由膽固醇和鞘磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體保護單核細(xì)胞免受膽固醇依賴的溶細(xì)胞素 和金黃色葡萄球菌α溶血素的組合的影響。
[0020] A) Ch:Sm (1:1 w/w)脂質(zhì)體（6)針對α溶血素（HML; 1.2微克）、鏈球菌溶血素 0 (SL0; 0.4微克）和破傷風(fēng)菌溶血素（TL; 0.2微克）的聯(lián)合作用發(fā)揮完全保護作用，而 Ch:PC (1:1 w/w)脂質(zhì)體是無效的（7)。C (r.u.)=相對于在毒素⑴不存在的情況下維 持的對照細(xì)胞數(shù)的在毒素（2-7)存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)，以相對單位計。1 =對照（無 毒素）；2 = SLO,無脂質(zhì)體；3 = TL，無脂質(zhì)體；4 = HML，無脂質(zhì)體；5 = SLO+TL+HML，無脂 質(zhì)體；6 = SLO+TL+HML，Ch:Sm 脂質(zhì)體；7 = SLO+TL+HML，Ch:PC 脂質(zhì)體。Ch =膽固醇；PC = 磷脂酰膽堿；Sm =鞘磷脂。
[0021] B)在25微克由Ch: Sm (1:1 w/w)構(gòu)成的脂質(zhì)體觀察到針對HML (1. 2微克）、SL0 (0.4微克）和TL (0.2微克）的聯(lián)合作用的完全保護作用。LP (mkg)=脂質(zhì)體的量（微 克）。
[0022] C)離心實驗證實，所有三種毒素直接結(jié)合Ch:Sm (1:1 w/w)脂質(zhì)體。將毒素與（6) 或不與（2-5) Ch:Sm脂質(zhì)體預(yù)孵育。離心后，將上清液添加至細(xì)胞。1 =對照（無毒素）； 2 = SL0,無脂質(zhì)體；3 = TL，無脂質(zhì)體；4 = HML，無脂質(zhì)體；5 = SL0+TL+HML，無脂質(zhì)體；6 = SLO+TL+HML，Ch: Sm 脂質(zhì)體。
[0023] 圖5.由膽固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)構(gòu)成的脂質(zhì)體保護單核細(xì)胞免受化膿性鏈球 菌毒素的影響。
[0024] A，B) THP-I細(xì)胞在BHI液體培養(yǎng)基存在的情況下增殖（正方形；㈧中虛線）。5 種化膿性鏈球菌菌株（GAS 1-5 =臨床分離株；所有都生長在BHI液體培養(yǎng)基中）的培養(yǎng)上 清液有效地殺死THP-I細(xì)胞（三角形），然而，由膽固醇和鞘磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體保護細(xì)胞免 受鏈球菌毒素的影響（圓形）。l〇 5c =細(xì)胞數(shù)X 105。t (d)=治療后時間（天）。
[0025] C)由膽固醇和鞘磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體保護單核細(xì)胞免受微克量的化膿性鏈球菌的 培養(yǎng)上清液的影響。c (%)=相對于在細(xì)菌上清液不存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)（100%)的 在細(xì)菌上清液存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)的百分比。LP (mkg)=脂質(zhì)體的量（微克）。
[0026] 圖6.由膽固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)構(gòu)成的脂質(zhì)體組合僅鞘磷脂的脂質(zhì)體完全保 護單核細(xì)胞免受肺炎鏈球菌毒素的影響。
[0027] A，B) THP-I細(xì)胞在BHI液體培養(yǎng)基存在的情況下增殖（正方形）。2種肺炎鏈球 菌菌株（肺炎鏈球菌1 =臨床分離株且肺炎鏈球菌2 = D39菌株；兩者都生長在BHI液體 培養(yǎng)基中）的培養(yǎng)上清液有效地殺死THP-I細(xì)胞（三角形），然而，由膽固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)構(gòu)成的脂質(zhì)體部分保護細(xì)胞免受肺炎鏈球菌毒素的影響（圓形）。IO5C =細(xì)胞數(shù)X 105。t (d)=治療后時間（天）。
[0028] C)含有膽固醇的脂質(zhì)體和不含膽固醇、僅鞘磷脂的脂質(zhì)體的混合物針對肺炎鏈 球菌毒素是完全保護的。該圖顯示由恒定（400 μ g)量的膽固醇：鞘磷脂（1:1 w/w)脂質(zhì) 體和不同量（〇 - 400 Pg)的僅鞘磷脂的脂質(zhì)體構(gòu)成的脂質(zhì)體混合物的保護作用。
[0029] c (r.u.)=相對于在上清液不存在的情況下維持的細(xì)胞數(shù)的在細(xì)菌上清液存在 的情況下維持的細(xì)胞數(shù)以相對單位（r.u.)給出。Sm LP (mkg)=僅鞘磷脂的脂質(zhì)體的量 (微克）。
[0030] 圖7.膽固醇：磷脂酰膽堿脂質(zhì)體（1:1 w/w)和膽固醇：磷脂酰膽堿（1:1 w/w) 和鞘磷脂脂質(zhì)體的混合物保護單核細(xì)胞免受金黃色葡萄球菌菌株MRSA 2040分泌的毒素 的影響。
[0031] THP-I細(xì)胞在BHI液體培養(yǎng)基存在的情況下增殖（正方形）。金黃色葡萄球菌（在 BHI液體培養(yǎng)基中生長）的培養(yǎng)上清液在脂質(zhì)體不存在的情況下有效殺滅THP-I細(xì)胞（三 角形）。（A) 900微克（菱形）膽固醇：磷脂酰膽堿（1:1 w/w)脂質(zhì)體提供針對細(xì)菌毒素 的顯著保護，而在600微克僅觀察到有限的保護（圓形）。（B)對于600微克膽固醇：磷 脂酰膽堿（I: I w/w)脂質(zhì)體與75微克Sm脂質(zhì)體的混合物觀察到完全保護（菱形）。單獨 使用的900微克Sm脂質(zhì)體是無效的（圓形）。IO 5c =細(xì)胞數(shù)X 105。t (d)=治療后時間 (天）