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一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物、其制備方法及其應用

文檔序號:8233399閱讀:730來源:國知局
一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物、其制備方法及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種組合物、其制備方法及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種老年人常見、多發(fā)性、退行性疾病,其典 型病理特征為關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨結(jié)構(gòu)改變以及骨贅發(fā)生等。目前我國60歲以上老人 中,就有55%的人患有骨性關(guān)節(jié)炎,患病率隨年齡的增加逐年上升趨勢。隨著中國逐漸進 入老齡化社會,以及中國人平均壽命的延長,現(xiàn)約有1. 2億人正在經(jīng)受著骨性關(guān)節(jié)炎的折 磨。由于局部血供不良以及自身骨髓干細胞病變,通常骨性關(guān)節(jié)炎患者的自身再生修復能 力有限,如不靠治療干預,無法實現(xiàn)關(guān)節(jié)的修復和功能的恢復。藥物治療和手術(shù)也只能一定 程度緩解病情,不能起到再生修復的功能,大部分患者到晚期都不可避免的要手術(shù)行人工 關(guān)節(jié)置換。近年來,以間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)為基礎的再生醫(yī)學 (Regenerative Medicine)手段成為研宄治療骨性關(guān)節(jié)炎熱點,其應用前景非常廣闊。
[0003] MSCs是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞,體外貼壁呈成纖維樣 細胞,可以分化為骨、軟骨和脂肪細胞,可以分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)、造血支持、促進血管 生成、趨化組織損傷修復等生物活性的細胞因子和生長因子。因此MSCs是組織工程化骨 和軟骨構(gòu)建中重要的種子細胞。然而試驗研宄表明,多數(shù)情況下,由于體內(nèi)情況的改變, MSCs在體內(nèi)的存活和分化能力有限,MSCs注射后一周在體內(nèi)的存活率非常低(Toma et al.,2002,Circulation 105:93 - 98. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Volker et al. , 2010. Nephron Exp Nephrol 2010 ;114:el07-ell6. Poor Cell Survival Limits the Beneficial Impact of Mesenchymal Stem Cell Transplantation on Acute Kidney Injury.),低的存活率可 能有多種原因,但是缺乏血運、無血液中營養(yǎng)因子是其中主要的原因之一。如果植入的細胞 沒有達到預期的存活目的,則其未來的定植和分化就無從談起。
[0004] 文獻中采用的提高間充質(zhì)干細胞體內(nèi)存活率的方法有體外調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)狀態(tài)和 基因工程化細胞兩種。采用基因工程改造的細胞如轉(zhuǎn)入抗凋亡基因 Bcl-2,雖然可以使 得細胞的生存率提高到原來的1. 2倍,但是由于基因改造的風險和滯后性,無法自自體間 充質(zhì)細胞治療中世紀采用。而體外細胞培養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)節(jié)是在細胞體外培養(yǎng)過程中,調(diào)節(jié) 細胞生長環(huán)境,以期在細胞移植后可以有更強的存活能力,比如在培養(yǎng)大鼠 MSCs時增加 Stromal-derived factor lalpha (SDF-lalpha),在培養(yǎng) MSCs 加入 Lipopolysaccharides, 采用無氧24-36小時培養(yǎng)MSCs等均可一定程度上提高骨髓MSCs的存活率。但所有這些方 法都是細胞體在外條件下進行,而且輸入的時候,細胞的懸浮液沒有經(jīng)過脫氧處理,當細胞 注射入體內(nèi)后,由于復雜的炎癥、營養(yǎng)環(huán)境,會改變細胞的生理狀態(tài)而無法完全實現(xiàn)體外獲 得的實驗結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物、其制備方法及其應用。
[0006] 本發(fā)明治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物的有效成分包括間充質(zhì)干細胞和細胞因子,所述 組合物中間充質(zhì)干細胞的濃度為5 X IO5?5 X 10 7個/mL,所述細胞因子由富含F(xiàn)GF2的血 漿和富含VEGF的血漿按體積比1:3?10制成。
[0007] 上述治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物的制備方法,按以下步驟進行:
[0008] 一、富血小板血漿制備:
[0009] 將20?120mL外周血分裝在50mL離心管中,于200?400g、4°C條件下離心10? 30min,去掉下層紅細胞,保留上層血小板血漿,混勻后,于500?IOOOg條件下二次離心 10?30min,去掉部分上層血衆(zhòng),將剩余血衆(zhòng)和下層血小板混合均勾,從而得到富集2?7 倍的富血小板血漿;
[0010] 二、富FGF2因子血漿制備:
[0011] 在步驟一制備的富血小板血漿中無菌添加120?150IU/mL人凝血酶和12? 15mg/mL CaCl2,在20?37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1?6小時,將上述培養(yǎng)物經(jīng)800?1500g、 4°C離心10?30min,其上清液即為FGF2濃度在40?80pg/mL的富FGF2因子血漿;
[0012] 三、富VEGF因子血漿制備:
[0013] 在步驟一制備的富血小板血衆(zhòng)中無菌添加10?30IU/mL人凝血酶和1?3mg/mL CaCl 2,在20?37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中72?144小時,將上述培養(yǎng)物經(jīng)800?1500g、4°C 離心10?30min,其上清液即為VEGF濃度在150?350pg/mL的富VEGF因子血漿;
[0014] 四、將富FGF2因子血漿和富VEGF因子血漿按體積比1:3?10的比例混合,將混 合后的血漿在25?60mmHg氧分壓下,37°C平衡4?8小時,然后向平衡后的混合血漿中加 入間充質(zhì)干細胞,混合血漿中間充質(zhì)干細胞的濃度為5X IO5?5X 10 7個/mL,即得到治療 骨性關(guān)節(jié)炎的組合物。
[0015] 上述組合物用于治療骨性關(guān)節(jié)炎。
[0016] 上述治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎藥物的應用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果:
[0018] 1、本發(fā)明突出的特點就是間充質(zhì)干細胞和細胞生長因子相結(jié)合,間充質(zhì)干細胞在 25-60mmHg氧分壓環(huán)境培養(yǎng),細胞因子也在相同的氧分壓中平衡。本發(fā)明適用于哺乳動物治 療方法,如人,或者寵物馬、狗、貓的骨性關(guān)節(jié)炎治療,適合月運動損傷性關(guān)節(jié)炎,或者退行 性關(guān)節(jié)炎治療,關(guān)節(jié)可以是各種大、小關(guān)節(jié)。
[0019] 2、細胞因子的獲得方法簡單和應用方便
[0020] 本發(fā)明組合物中的細胞因子獲取方法采用的是將血小板α顆粒激活后釋放獲得 的富FGF2和VEGF細胞因子,比起采用人重組FGF2、人重組VEGF配制的方法成本低廉、制作 工藝簡單。此富細胞因子的血漿可以在干細胞培養(yǎng)的同時開始制備,在移植之前與干細胞 進行混合處理,方便使用。
[0021] 3、本組合物中的間充質(zhì)干細胞可以快速適應關(guān)節(jié)環(huán)境并實現(xiàn)表面附著。本發(fā)明不 僅將對間充質(zhì)干細胞進行低氧馴化處理,而且也事先將富細胞因子血漿在低氧狀態(tài)下預先 平衡4-8小時,使得間充質(zhì)干細胞在組合物中維持了其馴化后的狀態(tài),組合物移植后,其中 的間充質(zhì)干細胞更快地適應了骨性關(guān)節(jié)炎的缺氧的關(guān)節(jié)環(huán)境,并且加快了在缺氧環(huán)境中的 貼壁速度。
[0022] 4、本組合物可以促進間充質(zhì)干細胞在骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中存活。本組合物應用 后,達到提高了間充質(zhì)干細胞在骨性關(guān)節(jié)炎環(huán)境中的生存時間。干細胞活性是其起作用的 最基本要求,如果干細胞在關(guān)節(jié)腔內(nèi)存活時間越長,其起到的對骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用越 顯著。
[0023] 5、本組合物可以促進間充質(zhì)干細胞在骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中集落形成數(shù)量,從而實 現(xiàn)干細胞在炎癥環(huán)境下可以順利定植、成活、擴增,確保了骨性關(guān)節(jié)炎的修復。
[0024] 6、本組合物中間充質(zhì)干細胞可以順利分化成軟骨組織,有利于干細胞對骨性關(guān)節(jié) 炎造成的軟骨損傷的修復作用。
【附圖說明】
[0025] 圖1為不同組別組合物中干細胞貼壁率;圖2為第一組和第二組的細胞活率對比; 圖3為細胞培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)圖;圖4為細胞培養(yǎng)第14天Alcian藍染色結(jié)果;圖5為第 一組和第二組克隆形成能力對比圖;圖6為第一組和第二組集落對比圖;圖7為損傷對照 組動物切片;圖8為修復組動物切片。
【具體實施方式】
[0026] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】,還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0027] 一:本實施方式治療骨性關(guān)節(jié)炎的組合物的有效成分包括間充質(zhì)干 細胞和細胞因子,所述組合物中間充質(zhì)干細胞的濃度為5 X IO5?5 X 10 7個/mL,所述細胞 因子由富含F(xiàn)GF2的血漿和富含VEGF的血漿按體積比1:3?10制成。
[0028] 所述間充質(zhì)干細胞可以為骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞,臍帶間充質(zhì)干 細胞、臍帶血間充質(zhì)干細胞,羊膜間充質(zhì)干細胞,胎盤間充質(zhì)干細胞,或?qū)m內(nèi)膜來源的間充 質(zhì)干細胞。
[0029] 富細胞因子血漿可以調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎性微環(huán)境、減少疼痛的同時,還提供了共移植 的間充質(zhì)干細胞的生存的營養(yǎng),促進其在體內(nèi)有效定植和生存,延長干細胞在體內(nèi)的再 生、微環(huán)境調(diào)節(jié)作用。在組合物制備過程中,采用了與人類關(guān)節(jié)內(nèi)氧分壓相似的供氧環(huán)境 25-60mmHg,促進了干細胞的適應能力,從而起到更好的骨性關(guān)節(jié)炎的修復作用。
【具體實施方式】 [0030] 二:本實施方式與一不同的是:所述富含F(xiàn)GF2的血漿 中FGF2濃度為40?80pg/mL。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0031] 三:本實施方式與一或二不同的是:所述富含VEGF的 血漿中VEGF濃度為150?350pg/mL。其它與一或二相同。
【具體實施方式】 [0032] 四:本實施方式與一至三之一不同的是:所述組合物 中間充質(zhì)干細胞的濃度為IX IO7個/
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