專利名稱：冬蟲夏草活性部分的分離方法和醫(yī)療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)一種藥物組分的分離方法和醫(yī)療用途，尤其是一種冬蟲夏草的活性部份及活性化合物的分離方法和醫(yī)療用途。
近年來，藥理學研究證實，一種寄生于鱗翅目昆蟲的幼蟲，而長出子座的麥角菌科冬蟲夏草真菌，其活性與藥理作用是多方面的，包括1．呼吸系統(tǒng)冬蟲夏草抽提物能明顯擴張離體天竺鼠支氣管平滑肌而有平喘作用，有提高小鼠常壓下耐缺氧的能力，能直接作用松弛支氣管壁，對氯化鎘霧化吸入引起的肺氣腫有防治效果；呈類似雄性激素作用，與保護氣管上皮及增強呼吸道抗損傷能力有關(guān)。
2．肝臟冬蟲夏草提取物能提高巨噬細胞吞噬能力及肝臟血流量和提高肝組織膠原酶活性，在治療肝炎后的肝硬化，有抗肝纖維化的作用。
3．免疫系統(tǒng)冬蟲夏草抽提液可提高正常人及白血病自然殺手細胞活性，促進淋巴球細胞表面CD16抗原的表現(xiàn)(提高與K562細胞的結(jié)合率)，促進細胞性免疫，提高Th/Ts比值，減少因使用類固醇及環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制作用。
4．心血管系統(tǒng)冬蟲夏草抽提液可提高天竺鼠心臟對哇巴因中毒的耐受量及使麻醉的大鼠和天竺鼠心率減慢。且冬蟲夏草也有抗缺氧、抑制腦單胺氧化酶的作用，松弛血管平滑肌及擴張血管的活性作用。
然而上述藥理作用都未采用完全純化的冬蟲夏草活性成份進行，且有關(guān)改善肺功能及臨床癥狀的研究，也未曾采用氣喘癥的動物模式進行。
氣喘癥臨床上是以陣發(fā)性呼氣性喘嗚表現(xiàn)的慢性呼吸道阻塞疾病，患本癥，不予以適當治療會因其并發(fā)癥而增加死亡率及發(fā)病率，世界各國氣喘病的死亡率均有逐漸增加的趨勢。迄今除了氣管擴張劑及副腎皮質(zhì)素可暫時改善支氣管收縮外，尚無證實有任何結(jié)構(gòu)的藥劑可改善支氣管及肺部慢性炎癥變化及肺功能。
氣喘癥是多因子參與的一種疾病，患者本身具有過敏體質(zhì)，當患者因吸入過敏原等因素被過敏原敏感化后，其體內(nèi)的B細胞就被活化產(chǎn)生專一性免疫球蛋白E抗體，在呼吸道內(nèi)的上皮細胞層及粘膜下層含有大量的肥胖細胞，肥胖細胞的細胞表面具有高親和力的免疫球蛋白E受體，當與專一性免疫球蛋白E抗體結(jié)合即處于被敏感化狀態(tài)；一旦過敏原再次侵入與兩個連結(jié)于肥胖細胞表面所含免疫球蛋白E受體的免疫球蛋白E抗體交叉連結(jié)地結(jié)合后，信息即傳入肥胖細胞，一方面細胞膜制造并釋出血小板活化因子，白烯三素等，二方面釋出細胞質(zhì)內(nèi)包括組織胺、蛋白酶及趨化因子的顆粒，因此一方面產(chǎn)生立即性的支氣管收縮，二方面吸引來大量炎癥細胞，前者可用支氣管擴張劑對抗，但后者則造成大量的單核細胞，嗜酸性和嗜中性白血球浸潤，并放出大量細胞激素、生長因子、蛋白酶等，使平滑肌收縮、血管滲透性增加、微血管血漿液滲出、呼吸道分泌物產(chǎn)生及表皮和基底膜細胞的損傷剝落，而造成支氣管無法恢復的破壞，使肺功能逐漸降低。故后者的炎癥反應是造成氣喘癥并發(fā)癥及死亡的主要原因。而在后者中具有最強且最持久的嗜酸性及嗜中性白血球浸潤的作用的是血小板活化因子，其作用時間可長達四周，且有自體增幅作用，即經(jīng)由血小板活化因子吸引來的嗜酸性及嗜中性白血球，又再釋出血小板活化因子而吸收更多的嗜酸性及嗜中性白血球來造成支氣管的破壞，致使肺損傷。
過去已建立離體抑制血小板活化因子引起兔子血小板凝集的離體定模式，篩選可以抑制血小板活化因子活性的成份，并建立以血小板活化因子及卵白蛋白誘發(fā)氣喘的棕色挪威鼠動物模式。利用抑制離體的抑制血小板活化因子引起兔子血小板凝集的離體測定模式，急性毒性試驗及氣喘癥狀的棕色挪威鼠動物模式，從冬蟲夏草找出可改善誘發(fā)氣喘棕色挪威鼠動物模式的肺功能，強化Th1細胞反應，抑制氧化氮合成酶基因表現(xiàn)，以應用于治療氣喘的活性部分及一活性化合物。
綜合所述，本發(fā)明的目的提供一種可抑制血小板活化因子誘發(fā)血小板凝集，改善肺功能及組織學和免疫學的變化的冬蟲夏草的活性部分和活性化合物的分離方法和醫(yī)療用途。本發(fā)明的第一目的是提出一種從冬蟲夏草分離出具有改善肺功能活性的活性部分的方法。
本發(fā)明的第二目的是提供一種從冬蟲夏草分離出具有改善肺功能活性的活性化合物的方法。
本發(fā)明的第三目的是提出一種經(jīng)由上述方法從冬蟲夏草分離出的具有改善肺功能的活性部份。
本發(fā)明的第四目的是提出一種經(jīng)由上述方法從冬蟲夏草分離出的具有改善肺功能的活性化合物。
本發(fā)明的第五目的是提供上述活性部份和活性化合物的醫(yī)療用途。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的冬蟲夏草活性部分和活性化合物的分離方法，主要包括烘干、研碎、抽提、濃縮、層析處理、鑒定等部分。其中包括將冬蟲夏草的子實體部分烘干、研碎，以有機溶劑抽提，將抽提液濃縮，以及進行氧化硅凝膠管柱層析處理配合離體控制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集活性鑒定而鑒定出該活性部分；其中抽提溶劑為甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷；其中氧化硅凝膠管柱層析是用正乙烷，乙酸乙酯、甲醇三種溶劑以不同比例混合成不同極性的沖提溶劑或者用二氯甲烷-甲醇(100∶1至1∶1的體積比)作為沖提溶劑進行；該種分離方法分離出的活性化合物是(24R)--麥角甾--7,22--二烯--3β,5α,6β--三醇；該種分離方法分離出的活性部分和活性化合物的醫(yī)療用途是，可抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝結(jié)，并可預防性及治療性改善氣喘后期反應的阻塞性肺功能惡化，強化THL細胞激素表現(xiàn)，降低iNOS基因表現(xiàn)，改善肺組織學變化。
本說明的上述及其它目的，特征與優(yōu)點可由下面的詳細說明參照附圖而明白，其中

圖1是根據(jù)本發(fā)明自冬蟲夏草子座抽取活性部分及活性化合物的方法流程圖；圖2是本發(fā)明活性化合物F8的氫核磁共振(1H-NMR)光譜圖；圖3是本發(fā)明活性化合物F8的乙酰化產(chǎn)物的1H-NMR光譜圖；圖4是圖3中所示1H-NMR光譜內(nèi)δ0.4PPM至δ2.2PPM范圍的擴大圖；圖5是本發(fā)明活性化合物F8的13C-NMR光譜；圖6是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織丙種干擾素基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖7是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織Th2基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖8是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織丙種干擾素基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖9是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織Th2基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖10是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織丙種干擾素基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F8在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F8(每組各6只)；圖11是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織Th2基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F8在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F8(每組各6只)；圖12是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織丙種干擾素基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F8在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并預防性F8(每組各6只)；圖13是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織Th2基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F8在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F8(每組各6只)；圖14是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織氧化氮合成酶基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖15是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織氧化氮合成酶基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖16是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織氧化氮合成酶基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖17是本發(fā)明棕色挪威鼠肺組織氧化氮合成酶基因表現(xiàn)的圖示；N正常未處理的對照組；OA以卵白蛋白誘發(fā)氣喘；OA+F4在卵白蛋白誘發(fā)氣喘時并用預防性F4(每組各6只)；圖18是本發(fā)明預防性吸入投予活性部份對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善50％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖19是本發(fā)明預防性吸入投予活性部份對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善25％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖20是本發(fā)明預防性吸入投予活性化合物對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善50％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖21是本發(fā)明預防性吸入投予活性化合物對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善25％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖22是本發(fā)明治療性吸入投予活性部分對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善50％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖23是本發(fā)明治療性吸入投予活性部分對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善25％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖24是本發(fā)明治療性吸入投予活性部分對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善25％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖25是本發(fā)明治療性吸入投予活性部分對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能明顯改善50％全肺容積時用力吐氣流速的圖示(*P值＜0.05)；圖26是本發(fā)明活性化合物對肺功能改善的劑量曲線的圖示。
表1是預防性投予F4對以不同劑量乙酰膽堿激發(fā)試驗后，最高峰呼氣流速各呼吸分段流速百分比的變化；表2是支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)及分類；表3是預防性投予F8對以不同劑量乙酰膽堿激發(fā)試驗后，最高峰呼氣流速各呼吸分段流速百分比的變化；表4是支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)及分類；表5是治療性投予F4對以不同劑量乙酰膽堿激發(fā)試驗后，最高峰呼氣流速各呼吸分段流速百分比的變化；表6是支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)及分類；表7是ICR小白鼠喂食含2％F4喂料的急毒性試驗；表8是冬蟲夏草中F4及F8對于血小板活化因子誘導的血小板凝集的抑制活性。
參照附圖和表，結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
如上所述，氣喘癥臨床上的是以陣發(fā)性呼氣性喘鳴表現(xiàn)的慢性呼吸道阻塞疾病，患本癥，如果不予以適當治療，會因其并發(fā)癥及肺傷害而增加發(fā)病率及死亡率，甚至突發(fā)死亡。世界各國氣喘癥病人均有逐年增加的趨勢，因氣喘癥而需要住院治療或死亡的病人，也有逐年增加的趨勢。迄今除了氣管擴張劑及副腎皮質(zhì)素外，尚無任何結(jié)構(gòu)的療劑可改善氣喘病的肺功能及組織病理學變化。為何氣喘癥會導致無法恢復的肺傷害？簡單地講患者本身具有過敏體質(zhì)，當他因吸入過敏原等因素被過敏源敏感化后，其體內(nèi)的B細胞就被活化產(chǎn)生專一性免疫球蛋白E抗體；在呼吸道內(nèi)的上皮細胞層及粘膜下層含有大量的肥胖細胞，肥胖細胞的細胞表面具有高親和力的免疫球蛋白E受體，當免疫球蛋白E受體與專一性免疫球蛋白E抗體結(jié)合即處于被敏感狀態(tài)；一旦過敏源再次侵入與兩個連結(jié)于肥胖細胞表面上免疫球蛋白E受體的免疫球蛋白E抗體交叉連結(jié)結(jié)合后，信息即傳入肥胖細胞，一方面細胞膜制造并釋出血小板活化因子、白烯三素等，而產(chǎn)生立即性的支氣管收縮；二方面釋出細胞質(zhì)內(nèi)的顆粒，包括組織胺、蛋白酶及趨化因子，而吸引來大量炎癥細胞；前者為可逆性的變化，可用氣管擴張劑對抗，將收縮的支氣管放松；但后者則造成大量的單核細胞，嗜酸性及嗜中性白血球浸潤，并放出大量細胞激素、生長因子、蛋白酶等，使支氣管平滑肌收縮、血管滲透性增加、微血管血漿液滲出、呼吸道分泌物產(chǎn)生及表皮及基底膜細胞的損傷剝落，而造成支氣管無法恢復的破壞，使肺功能逐漸降低。而故后者的炎癥反應是造成氣喘癥并發(fā)癥及死亡的主要原因。而在后者中具有最強且最持久的嗜酸性及嗜中性白血球浸潤的作用者為血小板活化因子，其作用時間可長達四周，且有自體增幅作用，經(jīng)由血小板活化因子吸引來的嗜酸性及嗜中性白血球，又再釋出血小板活化因子而吸引更多的嗜酸性及嗜中性白血球來造成支氣管的破壞，至使肺損傷。
由以上所述可知，治療上希望阻止氣喘癥的肺傷害則可由阻止血小板活化因子的作用，即可減少嗜酸性及嗜中性白血球?qū)τ诜蔚慕櫍昂罄m(xù)它們所引起的肺傷害。于實驗室中，可將兔子血小板加入血小板活化因子而造成兔子血小板凝集，以作為血小板活化因子作用的指標，并可測定血小板活化因子與血小板上血小板活化因子受體的結(jié)合比例，可作為與其受體結(jié)合的指標。故以上述方法，加入冬蟲夏草的“活性成份”，降低血小板活化因子造成兔子血小板凝集比例，作為離體篩選抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集，作為離體的第一步篩選方法。當找到有效的[活性成份]，再以加入冬蟲夏草的[活性成份]降低血小板活化因子與血小板上血小板活化因子受體的結(jié)合比例，作為離體的第二步篩選方法。
(a)抽取方法到此請參看圖1，是本發(fā)明自冬蟲夏草子座抽取活性部份及活性化合物的方法的流程圖；其是先將冬蟲夏草成品用烘箱烘干(35～60度)或風干均可，由于冬蟲夏草成品含水量甚高，干燥處理可避免后續(xù)抽取時帶出較多的極性物質(zhì)，因而影響硅膠層析純化的表現(xiàn)，且干品需用研磨機或粉碎機研碎，以提供抽取的效率。
由于冬蟲夏草所含活性成份(指對本發(fā)明說明書所述的可抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集與預防及改善肺功能而言)，屬較低極性的范圍，用甲醇(或其他低碳數(shù)的醇類)、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷抽取均可完全抽取。若將高活性成份盡量回收，及抽取到的非極性雜質(zhì)較少等因素一并考慮，則以使用甲醇或乙酸乙酯最為適當，實施例中則使用甲醇，而其抽取的程序則如圖中流程所述。
(b)層析法綜述取冬蟲夏草的子實體部份，放入45～50度烘箱二日，將水份烘干，干燥子實體經(jīng)研磨粉碎后，以10倍體積甲醇浸泡48小時，甲醇浸泡原液經(jīng)過濾后，以旋轉(zhuǎn)式真空濃縮機減壓濃縮，將溶劑抽移，再將甲醇浸泡濃縮液用適當量的氧化硅凝膠將其吸附，然后進行第一氧化硅凝膠管柱層析處理，使用正乙烷、乙酸乙酯、甲醇三種溶劑以各種不同比例混合成不同極性的沖提液，經(jīng)氧化硅凝膠管柱層析，分離成6個沖提液份[F1～F6]，分離流程如圖1所示。
分別測定其[抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集]的生物活性，而分離出活性部份。要從活性部份中獲取活性化合物時，可用氧化硅凝膠管柱層析法分離，程序如下所述(參看圖1)將活性部份以少量甲醇--氯仿溶解，以第二氧化硅凝膠(70～230篩目)管柱(5×40公分)層析分離，依序以二氯甲烷--甲醇(100∶1→1∶1)體積內(nèi)，當沖提溶劑，收取比例為10∶1(v/v)的沖提液份，測定各沖提液份所具抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集的功能，將活性沖提液份濃縮后，以甲醇--氯仿進行重結(jié)晶，可得活性化合物。
為了確認上述活性部份的應用潛力，避免其為一明顯有毒或致突變物質(zhì)，于第一層析分離階段曾進行小白鼠急毒性試驗及埃姆斯試驗，以顯示有無毒性及致突變性。
本申請案采用的檢測方式有三種離體一種，活體則有二種檢測方式。
一為利用離體抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集為模式，測定冬蟲夏草活性部份或活性化合物處理下對誘發(fā)氣喘的棕色挪威鼠的臨床癥狀及肺功能改善的程度及強化Th1細胞反應，抑制iNOS基因表現(xiàn)。
二為急毒性測試。以含及不含2％活性部份的飼料喂食ICR鼷鼠各6只5天之后將其處理，其結(jié)果如附表所示，兩組肝功能均在正常范圍內(nèi)(請通用附圖7所示)。
三為活體動物模式，其采用[卵白蛋白誘發(fā)氣喘后期反應棕色挪威鼠模式]。實驗動物分成控制組及實驗組兩組，兩組均經(jīng)兩次敏感化。其法為取2毫升的1％卵蛋白溶液放入霧化器容器內(nèi)，以流速8公升/分的流速使之霧化，以此由動物吸入方式給藥，七日后再進行第二次敏感化，步驟方法同上所述。進行完上述二次敏感化七日后，要進行肺功能檢查。進行肺功能檢查之前兩日給予高劑量的卵白蛋白挑激(以3毫升4％卵白蛋白霧化)。動物進行挑激之前30分要先給予腹腔注射吡利納明(10mg/kg)，避免急性反應而死亡。動物在實驗鼠在進行挑激36小時之后進行乙酰膽堿激發(fā)試驗，進行乙酰膽堿激發(fā)試驗前后(5秒內(nèi))均要測定肺功能。
另，上述本發(fā)明分離自冬蟲夏草的活性部份和活性化合物的醫(yī)療用途，其中包括(A)活性部份或活性化合物的預防處理為了解冬蟲夏草萃取物對氣喘是否有保護預防作用，實驗設(shè)計在以卵白蛋白(Ovalbumin；OA)敏感化及挑激時之前，OA組吸入投予生理食鹽水做對照，而預防組則投入3毫克的活性化合物溶液。
(B)活性部份或活性化合物的治療處理，治療組實驗動物在挑激后，由腹腔注射活性部份或活性化合物；OA組則注射生理食鹽水作為對照，本發(fā)明要用下列諸實施例予以進一步闡明。
實施例1．菌絲體培養(yǎng)及活性指標成份鑒定，將冬蟲夏草接種子含下列成份的液箱培養(yǎng)基中葡萄糖2％(蛋白酶)0.5％麥牙抽出物2％馬玲薯--葡萄糖浸出物24克/各于26±1.0度下靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)期30天)，收集其菌絲體，于45～50度烘干，所獲干重物研碎后以10倍體積的甲醇抽取48小時，粗抽出物減壓濃縮，再采用逆相式高效液相層析分析，證實含有活性化合物的活性指標成份。
實施例2冬蟲夏草成份的分劃與生物活性分析篩選冬蟲夏草子實體的甲醇萃取物經(jīng)由硅膠管柱層析，依不同極性沖提溶液提取各沖提層(參圖1)，由極性低至高細分成6個劃分CS-F1、CS-F2、CS-F3、CS-F4、CS-F5、CS-F6。以此六個部層進行生物活性分析，即抑制5nM活小板活化因子誘發(fā)洗滌避免血小板凝集反應的分析。
以藥物最終濃度為500g/毫升時分析血小板凝集反應，CS-F1、CS-F2、CS-F3、CS-F4、CS-F5、CS-F6的血小板凝集百分比分別為87.5±1.2％、77.4±6.2％、41.8±1.2％、14.4±8.6％、58.6±13.0％、83.0±3.3％。由血小板凝集百分比計算其抑制作用百分比，此六個部份抑制百分比分別為2.1±1.3％、13.4±6.9％、53.2±1.3％、83.9±9.6％、34.4±14.6％、7.1±3.7％。從最終濃度500ug/毫升分析，天然物能抑制血小板活化因子的活性主要出現(xiàn)于CS-F3、CS-F4、CS-F5。因此進一步以62.5、125、250、500ug/毫升分別做其劑量反應曲線；CS-F3、CS-F4、CS-F5萃取物對于由血小板活化因子所誘發(fā)兔子血小板凝集的反應呈現(xiàn)劑量關(guān)系的抑制作用。而CS-F3、CS-F4、CS-F5各劃分在50％抑制時的濃度(IC50)分別各為306.1±36.6ug/毫升、252.9±27.9ug/毫升、667.4±36.2ug/毫升。由IC50可以發(fā)現(xiàn)主要最大活性出現(xiàn)于CS-F4部份，故選擇F4作為其后進一步動物體內(nèi)試驗的材料。
實施例3活性化合物的分離。將活性部份以少量甲醇--氯仿溶解，以第二氧化硅凝膠(70～230篩目)管柱(5×40公分)層析分離，依序以二氯甲烷--甲醇(100∶1→1∶1)當沖提溶劑，收取比例為10∶1(v/v)的沖提液份，測定各沖提液份所具抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集的功能，將活性沖提液份濃縮后，以甲醇--氯仿進行再結(jié)晶，可得活性化合物。
實施例4毒性評估用冬蟲夏草對鼷鼠腹腔注射，其LD50值為21.7±2.6g/kg，靜脈注射的LD50值為24.5±2.2克/公斤體重?？诜畲竽褪芰繛?52.5～300克/公斤體重，說明無論采用靜脈注射、腹腔注射或灌胃其毒性均非常低，而本發(fā)明案所作的急毒性測試，其方法為含2％的活性部份的飼料喂食ICR鼷鼠7天之后處理，以檢視有無急毒性。其結(jié)果如表7所示，無急毒性。故冬蟲夏草是一藥理作用廣泛，且毒性非常小的藥物。
實施例5活性化合物的鑒定本發(fā)明活性化合物經(jīng)物理化學方法和光譜學分析例如質(zhì)諳分析，氫核磁共振光譜分析和碳核磁共振光譜分析于以鑒定的結(jié)果如下所述其分子式為C28H4603，分子量為430克/摩爾；其特理特性如下熔點243-245℃質(zhì)譜(MS)(m/z):430(M+),412,394,379,287,269,251,227,225,197。1H NMR(CDCl3,500MHz)d:5.33(1H,m,H-7),5.14-5.20(2H,m,H-22,and H-23),4.08(1H,m,H-3),3.59(1H,m,H-6),1.06(3H,s,H-19),1.01(3H,d,J=6.5Hz,H-21),0.90(3H,d,J=6.5Hz,H-28),0.82(3H,d,J=7.5Hz,H-26),0.80(3H,d,J=7.0Hz,H-27),0.58(3H,s,H-18)。(圖2)1H NMR(CDCl3,200MHz)d:5.05-5.30(4H,m,H-3,H-7,H-22,和H-23),4.80(1H,m,H-6),2.06(3H,s,O=C-CH3),2.03(3H,s,O=C-CH3)。(圖3和圖4)13C-NMR(CDCl3,500MHz)d:144.0(C-8)135.3(C-22),132.1(C-23),117.5(C-7),76.7(C-5), 75.9(C-6),67.7(C-3),55.9(C-17),54.7(C-14),43.7(C-13),43.4(C-9或C-24),42.8(C-24或C-9),40.4(C-4),39.5(C-20),39.2(C-12),37.1(C-10),33.1(C-2),32.9(C-25),30.8(C-1),27.9(C-16),22.9(C-15),22.0(C-11),21.1(C-21),19.9(C-26或C-27),19.6(C-27或C-26),18.8(C-19),17.5(C-28),12.3(C-18).(圖5)上述圖2為本發(fā)明活性化合物的氫核磁共振光譜圖，圖3和圖4為本發(fā)明活性化合物的乙?；a(chǎn)物的氫核磁共振光譜圖。由上述兩光譜圖的分析，本發(fā)明活性化合物應屬麥角甾醇類化合物。由圖3和圖4可知本發(fā)明活性化合物乙?；a(chǎn)物，含有兩個乙?；?d2.06和2.03)，充分顯示本發(fā)明活性化合物會有兩個或兩個以上的羥基(-OH)。再由碳核磁共振光譜(圖5)知本發(fā)明活性化合物又含有一接于四級碳(d76.7)的羥基，綜上討論，確定本發(fā)明活性化合物為(24R)--麥角甾-7,22--二烯-3b,5a,6b--三醇。
其結(jié)構(gòu)式如下
實施例6活性部份和活性化合物的預防與治療效果的評估(A)活性部份F4或活性化合物F8的預防處理，為了解冬蟲夏草萃取物對氣喘是否有保護預防作用，實驗設(shè)計在以卵白蛋白敏感化及挑激時之前，OA組吸入性投入生理食鹽水做對照，而預防組則投入3毫克的活性化合物F8溶液。
(B)活性部份F4或活性化合物F8的治療處理，治療組實驗動物在挑激后，由腹腔注射F4活性部份或/F8活性化合物；OA組則注射生理食鹽水作為對照。經(jīng)過上述動物模式的處理后，將實驗動物在挑激的兩天后處理，并取其肺臟，置于冰中保持低溫，進行去氧核醣核酸(RNA)及核蛋白質(zhì)的抽取及反轉(zhuǎn)錄聚合連鎖反應。
(C)對輔助型T淋巴球1(Th1)/抑制型T淋巴球2(Th2)細胞激素表現(xiàn)的影響由反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應的結(jié)果加以統(tǒng)計，分析比較每一種細胞激素的基因表現(xiàn)在未處理(N)，以卵白蛋白(OA)誘發(fā)氣喘反應及給予活性部份(OA+活性部份)或活性化合物(OA+活性化合物)的三組實驗動物間的差異每一組實驗重復次數(shù)(n=6)。
其結(jié)果為一、活性部份對Th1/Th2細胞激素的影響(A)活性部份F4的預防效果(參圖6和圖7)丙種干擾素(IFN-r)的表現(xiàn)在OA引起后期反應顯著下降幾乎是完全受到抑制?；钚圆糠莘謩e在致敏感前及刺激前先給予則避免了對IFN-r的抑制效果(參圖6)。在Th2細胞激素表現(xiàn)方面IL-10、IL-4及IL-5在OA組都明顯地增加表現(xiàn)，而活性部份的預防則完成抑制其增加，使這三種細胞激素的表現(xiàn)和未處理組相同。IL-6的表現(xiàn)則與其他Th2細胞激素不一致。未處理(N)組已有明顯IL-6的表現(xiàn)，在OA組則沒有顯著的變化，但在活性部份預防則可以觀察到有降低IL-6表現(xiàn)的情形(P＜0.05)。
在OA引起氣喘的模式中抑制型T淋巴球2(丙種干擾素)Th2(IFN-r)的表現(xiàn)下降，而Th2、IL-4、IL-5、IL-10的表現(xiàn)則增加；活性部份的預防性給予可以有效地使Th1/Th2的表現(xiàn)都近于未處理組時的表現(xiàn)狀態(tài)(參圖7)。
(B)活性部份的治療效果(參圖8與圖9)丙種干擾素(IFN-r)在OA組降低的表現(xiàn)，加入活性部份處理后可以恢復到與正常情形相同的表現(xiàn)(參圖8)；對IL-4及IL-5的增加，活性部份也能降低其作用，在IL-6也有相同模式的變化，且本組中IL-6在OA組的表現(xiàn)比未處理(N)組顯著增加；活性部份的處理對IL-10的表現(xiàn)有抑制的作用，但在本組中處理的老鼠確有IL-10的表現(xiàn)，活性部份的治療也有效地使氣喘的細胞激素表現(xiàn)型態(tài)由Th2轉(zhuǎn)向Th1(參圖9)。
二、活性化合物對Th1/Th2細胞激素的影響(A)活性化合物的預防效果(參圖10與圖11)對IFN-r在氣喘后期反應中下降的表現(xiàn)，活性化合物有明顯的預防作用，給予活性化合物后IFN-r的表現(xiàn)為如OA組一樣降低(參圖10)；對Th2細胞激素的影響，活性化合物降低了OA引起的IL-4、IL-5、IL-6的上升；活性化合物的處理則使IL-10下降至OA組的1/4，故活性化合物的確可預防OA引發(fā)的Th2反應(參圖11)。
(B)活性化合物的治療效果(參圖12與圖13)比起預防處理的結(jié)果，活性化合物在引起氣喘反應性化合物使在OA(卵白蛋白)組中下降回復到略低于未處理組(參圖12)。對II-5、IL-6在OA引起的上升有抑制使其下降的作用，但降低的程度未能降到與未處理組一樣；在IL-4的情形則表現(xiàn)了顯著的效果，抑制其IL-4在生產(chǎn)使其低于未處理組；IL-10在未處理組偏高，OA組略低，而活性化合物有明顯抑制作用，故活性化合物的治療效果會使氣喘的Th2反應回趨向Th1的方向(參圖13)。
實施例7活性部份對氧化氮合成酶(iNOS)表現(xiàn)的影響(參圖14與圖15)使用相同的模式及反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應的方法，在此實驗中，未處理的老鼠肺組織均有微量iNOS的表現(xiàn)，在OA引發(fā)氣喘后期反應下可看到iNOS明顯提高?；钚圆糠菰贠A模式中作預防處理會使iNOS基因表現(xiàn)維持在與未處理組相同的低表現(xiàn)量的情形(參圖14)，而活性部份的治療效果也有降低OA引發(fā)的高iNOS經(jīng)表現(xiàn)(參圖15)，但其量略高于未處理組，故活性部份在預防及治療兩方面都能降低OA處理下iNOS的基因表現(xiàn)，但以預防效果較為完全。
實施例8活性化合物對iNOS基因表現(xiàn)的影響，不論是引發(fā)氣喘前的預防處理，或之后的治療對iNOS的表現(xiàn)均有明顯的抑制，其中治療效果更達到了安全抑制(參圖16及圖17)。
實施例9體內(nèi)的篩選系統(tǒng)，活性部份F4和活性化合物F8對氣喘動物模式肺功能的影響動物模式必須具備專一性，可造成肺功能阻塞性變化與支氣管過度反應，呼吸道炎癥反應，與相對應人類氣喘癥非常相似的特性。
基于上述的考慮，本發(fā)明實驗是采用棕色挪威鼠受卵白蛋白誘發(fā)氣喘后期發(fā)炎反應，為體內(nèi)動物模式，以肺功能及組織病理學變化作為[活性成份]療效的指標。實驗上是將棕色挪威鼠分成控制組和實驗組兩組，兩組均先經(jīng)兩次卵白蛋白(QA)敏感化，敏感化方法是把動物放入密閉的體箱(長寬高=30公分×28公分×15公分)，1％2毫升的卵白蛋白溶液放入霧化器容器內(nèi)，以流速8公升/分的氣流使卵白蛋白霧化后，使動物由吸入方式給藥，待動物完全吸入至體箱內(nèi)無氣霧，取出動物，送回動物房飼養(yǎng)，七日后進行第二次敏感化，步驟方法同上所述。兩組實驗動物，一組實驗組，一組對照組，同時給予高測量4％，3毫升卵白蛋白挑激，以吸入法誘發(fā)氣喘，三十六小時后放氣管插管，連結(jié)儀器測量肺功能。在進行最后一次給高劑量卵白蛋白挑激之前30分，先由腹腔注射吡利納明(10mg/kg)，避免實驗鼠因產(chǎn)生氣喘急性反應而死亡。實驗鼠在進行最后一次給高劑量卵白蛋白挑激之后起之36小時進行乙酰膽堿激發(fā)試驗，以誘發(fā)后期反應。為了探討由離體篩選找出的[活性成份]是否對氣喘的后期反應具有預防或治療效果，預防效果的探討(參圖12)是于實驗組在以卵白蛋白敏感化之前吸入由離體篩選的冬蟲夏草的活性部份或活性化合物；探制組則注射生理食鹽水。治療效果的探討是實驗組在以卵白蛋白誘發(fā)之后24小時再吸入由離體篩選的冬蟲夏草的活性部份或活性化合物，接著測定肺功能以比較療效。在肺功能可以發(fā)現(xiàn)主要最大活性出現(xiàn)于CS-F4活性部份，故選擇該活性部份作為其后進一步動物體內(nèi)試驗的材料。
(a)肺功能檢查呼吸道開口接上戈爾特公司的壓力轉(zhuǎn)換器來測量開口壓。實驗鼠的呼吸流速是以DP-45-14壓差轉(zhuǎn)換器來測量。當自然呼吸時體箱壁是用6層325網(wǎng)沙狀鐵絲間隔板來測壓力差，當用最大用力吐氣時是用6層325網(wǎng)沙狀鐵絲間隔板來測壓力差。
做最大用力吐氣時小動物需先充氣至全肺容積三次。當?shù)谌纬錃庵寥稳莘e時另用電磁閥將吸氣閥關(guān)閉，并立刻自動轉(zhuǎn)換至吐氣閥。吐氣閥與20公升的容器相接，以保持吐氣時間固定在-30公分水柱的氣壓。另外用-30公分水柱的氣壓來產(chǎn)生最大吐氣流速。流速、溶積及動脈氧分壓(PaO2)的變化由轉(zhuǎn)送裝置的7P1,7P10的前置轉(zhuǎn)換器再由轉(zhuǎn)送裝置的多項記錄器記錄下來。最大吐氣的流速--容積圖用肺機械分析儀來檢查并儲存于有記憶功能的陰極射線示波器。
由記錄下的流速容積圖來取尖峰流速值(即由記錄下的流速容積圖的最大流速)，75％全肺容積時用力吐氣流速(MFEF75％)，50％全肺容積時用力吐氣流速(MFEF50％)，25％全肺容積時用力吐氣流速(MFEF25％)及肺活量。
(b)肺容積的測量全肺容積被定義為呼吸道壓力為35公分水柱時肺內(nèi)的氣體體積，殘余容積被定義為呼吸道壓力為-10公分水柱時肺內(nèi)的氣體體積。肺容積(TLC，肺機能儲藏容積FRC)的測量是用氣體稀釋的原理與方法。氖床及一氧化碳的濃度是以氣相分析儀來檢查，肺容積需同時測量三次并取其平均值。
(c)支氣管肺泡灌洗液每雙實驗鼠于肺功能實驗后，以10毫升生理食鹽水經(jīng)由氣管插管予以灌洗兩次(共20毫升)，回抽后再經(jīng)紗布過濾，于轉(zhuǎn)速2500rpm、4攝氏度冷凍離心5分鐘，將上層液取出以備做進一步分析，而下層細胞則做為細胞計數(shù)用。
離心后的下層細胞以漢克平衡鹽水充分洗凈除去紅血球后，加入磷酸鹽平衡溶液調(diào)成細胞懸浮液，以錐蟲藍做細胞總數(shù)計算，離心除去磷酸鹽平衡溶液，加入胎牛血清將調(diào)成細胞濃度為(1×106細胞/毫克)細胞懸浮液以細胞自旋轉(zhuǎn)速1200ipm、5分鐘將細胞打到玻片上(1×105/片)，再作染色，進行細胞分類計數(shù)。
(d)組織病理學檢查將實驗后的實驗鼠進行開胸手術(shù)，取出肺臟，固定取其右下葉做組織病理學檢查。將肺組織固定于10％中性福馬林中，以漸增濃度的酒精脫水后，再以石臘包埋，切成4uM厚切片，以蘇木精及伊紅染色在顯微鏡下觀察。其結(jié)果如下所述(A)預防性吸入投入活性部份對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功影響兩組在未給予乙酰膽堿(Acetyl-choline，簡寫Ach)前呼吸流速曲線的尖峰流速，75％全肺容積時用力吐氣流速，50％全肺容積時用力吐氣流速，25％全肺容積時用力吐氣流速，平均基礎(chǔ)值例于表1。由表1可發(fā)現(xiàn)兩組的尖峰流速，75％全肺容積時用力吐氣流速，全肺容積，呼吸道開口壓及動態(tài)可張性并無統(tǒng)計學上顯著的差別，但第一組的50％全肺容積時用力吐氣流速及25％全肺容積時用力吐氣流速則顯著比第二組低(參圖18、圖19)。給予Ach后使各肺功能檢查參數(shù)由基礎(chǔ)值下降20％所需乙酰膽堿(Ach)的劑量，第一組各肺功能參數(shù)的PD20值；尖峰流速(47ug vs＞100ug)，75％全肺容積時用力吐氣流速(52ug vs＞100g)，50全肺容積時用力吐氣流速(27ug vs 71ug)，25％全肺容積時用力吐氣流速(12ug vs38ug)都顯著比第2組低。
除了肺功能改變外，由支氣管肺泡灌洗液的檢查發(fā)現(xiàn)，投藥組浸闊的炎癥細胞顯著比對照組為低(表2)；組織病理學檢查也發(fā)現(xiàn)投藥組明顯減少炎癥細胞浸潤及支氣管上皮細胞傷害。
(B)預防性吸入投入活性化合物對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能影響兩組在未給予乙酰膽堿(Ach)前呼吸流速曲線的尖峰流速，在75％全肺容積時用力吐氣流速，50％全肺容積時用力吐氣流速，25％全肺容積時用力吐氣流速，平均基礎(chǔ)值列于表3。由表3可發(fā)現(xiàn)兩組的尖峰流速，75％全肺容積時用力吐氣流速，全肺容積，呼吸道開口壓及動態(tài)可張性并無統(tǒng)計學上顯著的差別，但第一組的50％全肺容積時用力吐氣流速及25％全肺容積時用力吐氣流速則顯著比第二組低(參圖20、圖21)。
(C)對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠預防性吸入投予活性化合物，給予Ach后各肺功能檢查，第一組各肺功能參數(shù)的PD20值，尖峰流速(49ug vs＞100ug)，75％全肺容積時用力吐氣流速(54ug vs＞100kug)，50％全肺容積時用力吐氣流速(13ug vs 51ug)，25％全肺容積時用力吐氣流速(12ug vs 30ug)都顯著比第2組低。
除了肺功能改變外，由支氣管肺泡灌洗液的檢查發(fā)現(xiàn)，投藥組浸潤的炎癥細胞顯著比對照組為低(表4)；組織病理學檢查也發(fā)現(xiàn)投藥組明顯減少炎癥細胞浸潤及支氣管上皮細胞傷害。
(C)治療效果吸入投入活性部份對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能影響兩組在未給予乙酰膽堿(Ach)前呼吸流速曲線的尖峰流速，在75％全肺容積時用力吐氣流速，50％全肺容積時用力吐氣流速，25％全肺容積時用力吐氣流速，平均基礎(chǔ)值列于表5。由表5可發(fā)現(xiàn)兩組的尖峰流速，75％全肺容積時用力吐氣流速，全肺容積，呼吸道開口壓及動態(tài)可張性并無統(tǒng)計學上顯著的差別，但第一組的50％全肺容積時用力吐氣流速及25％全肺容積時用力吐氣流速則顯著比第二組低(參圖22、圖23)。除了肺功能改變外，由支氣管肺泡灌洗液的檢查也發(fā)現(xiàn)投藥組浸潤的炎癥細胞顯著比對照組為低(表6)；組織病理學檢查也發(fā)現(xiàn)投藥組明顯減少炎癥細胞浸潤及支氣管上支細胞傷害。對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠治療性吸入活性部份，再給予Ach后各肺功能檢查所需Ach的劑量，第一組肺功能參數(shù)的PD20值，尖峰流速(48ug vs＞100ug)，75％全肺容積時用力吐氣流速(62ug vs＞100ug)，50％全肺容積時用力吐氣流速(24ugvs 46ug)，25％全肺容積時用力吐氣流速(12ug vs 48ug)都顯著比第2組低。
(D)治療效果吸入投入活性化合物對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠氣喘的肺功能影響兩組在未給予乙酰膽堿(Ach)前呼吸流速曲線的尖峰流速，在75％全肺容光煥發(fā)積時用力吐氣流速，50％全肺容積時用力吐氣流速，25％全肺容積時用力吐氣流速，平均基礎(chǔ)值列于圖24及圖25。由圖24及圖25可發(fā)現(xiàn)兩組尖峰流速，50％全肺容積時用力吐氣流速及25％全肺容積時用力吐氣流速有顯著統(tǒng)計差異，對照組比活性化合物治療組低(參圖24、圖25)。
除了肺功能改變外，由支氣管肺泡灌洗液的檢查也發(fā)現(xiàn)投藥組浸潤的炎癥細胞顯著比對照組為低(表6)；組織病理學檢查也發(fā)現(xiàn)投藥組明顯減少炎癥細胞浸潤及支氣管上皮細胞傷害。
對卵白蛋白誘發(fā)棕色挪威鼠治療性吸入投入活性化合物，再給予Ach后各肺功能檢查所需Ach后各肺功能檢查所需Ach的劑量，第一組各肺功能參數(shù)的PD20值，在75％全肺容積時用力吐氣流速，50％全肺容積時用力吐氣流速都是對照組顯著比活性化合物治療組為低。
以上結(jié)果顯示冬蟲夏草活性組份或活性化合物不論以預防性給予(0.5毫克及3毫克)的活性部份或活性化合物溶液分別于第二次卵白蛋白敏感化及挑激時同時吸入給予或治療性給予(在挑激后由腹腔注射活性部份或活性化合物)以測試其改善前述肺功能、病理表現(xiàn)及免疫變化表現(xiàn)的效果，也支持冬蟲夏草有效活性部份及活性化合物確有改進實驗性[氣喘反應]的效果。
有關(guān)附表陳列如下(共8張)
表1預防性投予F4對以不同劑量乙酰膽堿激發(fā)試驗后，最高峰呼氣流速各呼吸分段流速百分比的變化
表2支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)及分類
表3預防性投予F8對以不同劑量乙酰膽堿激發(fā)試驗后，最高峰呼氣流速各呼吸分段流速百分比的變化
表4支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)及分類
表5治療性投予F4對以不同劑量乙酰膽堿激發(fā)試驗后，最高峰呼氣流速各呼吸分段流速百分比的變化
表6支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)及分類
表7ICR小白鼠餵食含2％F4餵料的急毒性試驗
表8冬蟲夏草中F4及F8對于血小板活化因子誘導的血小板凝集的抑制活性
綜上所述，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明從冬蟲夏草中分離出的活性部份及活性化合物在體外可抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集，在體內(nèi)可預防性及治療性改善氣喘后期反應的阻塞性肺功能惡化，強化Th1細胞激素表現(xiàn)，降低iNOS基因表現(xiàn)，改善肺組織學變化，以阻斷往后造成肺傷害。且活性部份并不會產(chǎn)生急毒性，計算活性部份及從活性部份中所純化出來的活性化合物對于血小板活化因子誘導的血小板凝集的抑制活性如表8所示，對肺功能改善值為2毫克/公斤肌肉注射(如圖26所示)，由此推算大約活性化合物3毫克/公斤，可見其在預防或治療人類氣喘癥有療效。
權(quán)利要求
1.一種冬蟲夏草活性部分的分離方法，主要包括烘干、研碎、抽提、濃縮、層析處理、鑒定等部分；其特征在于其中先將冬蟲夏草的子實體部份烘干，研碎，然后以有機溶劑抽提，將抽提液濃縮，再進行氧化硅凝膠管柱層析處理，鑒定其活性部分和分離出活性部分。
2.如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法，其特征在于其中所述的抽提溶劑為甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷其中一種。
3.如權(quán)利要求1或2所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法，其特征在于其中所述的最適當?shù)某樘崛軇榧状蓟蛞宜嵋阴ァ?br> 4.如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法，其特征在于其中所述的氧化硅凝膠管柱層析是用正乙烷、乙酸乙酯、甲醇三種溶液以不同比例混合成不同極性的沖提溶劑進行沖提。
5.如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法，其特征在于其中從活性部分獲取活性化合物時，先將活性部分以甲醇--氯仿溶解，以氧化硅凝膠管柱層析分離，依序用二氯甲烷--甲醇(100∶1→1∶1)體積比當沖提溶劑，收取各沖提液份，測定各沖提液份所具抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝集的功能，將活性沖提液份濃縮后，以甲醇--氯仿進行重結(jié)晶，可得活性化合物。
6.如權(quán)利要求1或5所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法，其特征在于其中收取的沖提液份是二氯甲烷--甲醇(10∶1)體積比的沖提液份。
7.如權(quán)利要求1或5所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法所獲得的活性化合物，其特征在于其中活性化合物是(24R)--麥角甾--7,22--二烯--3b,5a,6b--三醇。
8.如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法所獲得的活性部分的醫(yī)學用途，其特征在于其可抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝結(jié)，并可預防性及治療性改善氣喘后期反應的阻塞性肺功能惡化，強化Th1細胞激素表現(xiàn)，降低iNOS基因表現(xiàn)，改善肺組織學變化。
9.如權(quán)利要求1或7所述的冬蟲夏草活性部分的分離方法所獲得的活性化合物的醫(yī)學用途，其特征在于其可抑制血小板活化因子誘發(fā)兔子血小板凝結(jié)，并可預防性及治療性改善氣喘后期反應的阻塞性肺功能惡化，強化Th1細胞激素表現(xiàn)，降低iNOS基因表現(xiàn)，改善肺組織學變化。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)冬蟲夏草的一種活性部份的分離方法,其經(jīng)由將冬蟲夏草的子實體部份烘干、研碎,萃取,濃縮,氧化硅凝膠管柱層析處理分離出活性部份,其特征為具有明顯的對血小板活化因子誘發(fā)血小板凝集作用的抑制活性。將該活性部份用氧化硅凝膠管柱層析以具有不同溶劑組成的洗提劑分離并經(jīng)重結(jié)晶純化而得一活性化合物。本發(fā)明的醫(yī)療用途,是可抑制血小板活化因子誘發(fā)血小板凝集,改善氣喘癥后期反應的肺功能。
文檔編號A61P11/00GK1306964SQ9912571
公開日2001年8月8日 申請日期1999年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者林清淵 申請人:林清淵