專利名稱：N[n－n－(4－哌啶－4－基)丁酰基)－n－乙基甘氨?；鵠化合物的不吸濕的穩(wěn)定結(jié)晶形式的制作方法
背景技術(shù)：
1. 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及式I的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕的穩(wěn)定結(jié)晶形式。該化合物具有抗血栓形成活性，
包括在哺乳動物中抑制血小板聚集和血栓的形成，可用于預(yù)防和治療與心肌梗塞、中風(fēng)、外周動脈疾病和彌散性血管內(nèi)凝血等疾病有關(guān)的血栓形成。
此外，本發(fā)明還涉及N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺結(jié)晶形式的制備方法，其藥物組合物及其中間體。
此外，本發(fā)明還涉及用于制備四氮雜環(huán)烷基鏈烷?；幕蚣匐幕衔锏闹虚g體。
止血，血液凝集的生物化學(xué)過程，是一種極為復(fù)雜的現(xiàn)象，正常的全血和身體組織通過該過程自發(fā)地使受損的血管停止流血。有效的止血需要血管、血小板和血漿因子的聯(lián)合活性以及控制機(jī)制以防止過度凝固。其中任意一種成分的缺陷、不足或過量均會導(dǎo)致出血或血栓形成的后果。
血小板在細(xì)胞外基質(zhì)上的粘附、擴(kuò)散和凝集是血栓形成的重要事件。這些事件受一族粘著糖蛋白，即纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德(von willebrand)因子的調(diào)節(jié)。纖維蛋白原是血小板凝集的輔助因子，而纖連蛋白支持血小板的粘附和擴(kuò)散反應(yīng)，馮·維勒布蘭德因子對于血小板在內(nèi)皮下基質(zhì)上粘附和擴(kuò)散是非常重要的。纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德因子的結(jié)合位點(diǎn)位于被稱為糖蛋白IIb/IIIa的血小板膜蛋白配合物上。
粘著糖蛋白如纖維蛋白原不與正常的靜息血小板結(jié)合。但是，當(dāng)血小板被激動劑如凝血酶和二磷酸腺苷激活時(shí)，血小板的形狀發(fā)生改變，可能會使GP IIb/IIIa結(jié)合位點(diǎn)適于纖維蛋白原接近。本發(fā)明的化合物可以封閉纖維蛋白原受體，從而具有上述的抗血栓形成活性。
2. 已報(bào)道的進(jìn)展已發(fā)現(xiàn)，Arg-Gly-Asp(RGD)的存在是纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德因子與細(xì)胞表面受體相互作用所必需的(RuoslahtiE.，Pierschbacher，細(xì)胞(Cell)1986，44，517-18)。另外兩種氨基酸序列似乎也參與了纖維蛋白原的血小板粘附功能，即Gly-Pro-Arg序列和十二肽His-His-Leu-Gly-Gly-ALa-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val序列。含有RGD或十二肽的小合成肽表現(xiàn)出可與血小板GPIIb/IIIa受體結(jié)合并競爭性地抑制纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德因子的結(jié)合以及抑制被激活血小板的凝集(Plow等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1985，82，8057-61；Ruggeri等，美國國家科學(xué)院院報(bào)1986，5708-12；Ginsberg等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)1985，260，3931-36；和Gartner等，生物化學(xué)雜志，1987，260，11，891-94)。
Tjoeng等在美國專利5037808和4879313中報(bào)道了含有胍基鏈烷?；?和胍基鏈烯?；?天冬氨酰部分的吲哚基化合物是血小板凝集的抑制劑。
1991年2月12日授權(quán)的美國專利4992463(Tjoeng等)公開了一系列具有血小板凝集抑制活性的芳基和芳烷基胍基烷基肽類似物，并具體公開了一系列單-和二甲氧基苯基肽類似物和二苯基烷基肽類似物。
1989年8月15日授權(quán)的美國專利(Adams等)公開了一系列具有血小板凝集抑制活性的含有末端芳烷基取代基的胍基烷基肽衍生物，并具體公開了一系列含有末端酰胺功能基的O-甲基酪氨酸、聯(lián)苯基和萘基衍生物。
Haverstick，D.M.等，在“血液”(Blood)66(4)，946-952(1985)中公開了多種合成肽，包括arg-gly-asp-ser和gly-arg-gly-asp-ser，可以抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。
Plow.E.F.等，在“美國國家科學(xué)院院報(bào)”79，3711-3715(1982)中公開了四肽甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酸可以抑制纖維蛋白原與人血小板結(jié)合。
1986年12月15日遞交的法國專利申請86/17507公開了含有-arg-gly-asp-序列的四肽、五肽和六肽可用作抗血栓形成劑。
1987年7月28日授權(quán)的美國專利4683291(Zimmerman等)公開了一系列含有-arg-gly-asp-序列的由6-40個(gè)氨基酸組成的肽是血小板結(jié)合抑制劑。
1989年6月7日公開的歐洲專利申請0319506公開了一系列含有-arg-gly-asp-序列的四肽、五肽和六肽是血小板凝集的抑制劑。
美國專利5023233報(bào)道了含有Gly-Asp部分的環(huán)狀肽類似物是纖維蛋白原受體的拮抗劑。
在分別于1991年3月28日、1990年6月7日和1990年1月4日遞交的未決美國專利申請07/677006、07/534385和07/460777，以及美國專利4952562和于1990年9月25日遞交的國際申請PCT/US90/05448中報(bào)道了含有氨基一、胍基-、咪唑基和/或脒基鏈烷酰基和鏈烯?；糠值碾暮图匐氖强寡ㄐ纬蓜陨线@些專利申請均轉(zhuǎn)讓給了本發(fā)明的同一受讓人。
在1990年2月5日遞交的未決美國專利申請07/475043和1991年4月11日遞交的國際申請PCT/US91/02471(1992年10月29日公開，國際申請?zhí)枮閃O 92/13117)中報(bào)道了含有氨基-和胍基-烷基-和鏈烯基-苯甲?；⒈交溚轷；捅交溝；糠值碾暮图匐氖强寡ㄐ纬蓜?，以上這些專利申請均轉(zhuǎn)讓給了本發(fā)明的同一受讓人。
在1989年12月1日遞交的美國專利5053392中報(bào)道了鏈烷?；腿〈逆溚轷；s環(huán)烷基甲?；於彼嵫苌锸茄“迥种苿搶＠D(zhuǎn)讓給了本發(fā)明的同一受讓人并且與本發(fā)明具有相同的發(fā)明人。
在1990年4月5日遞交的美國專利5064814中報(bào)道了N-取代的氮雜環(huán)烷基羰基環(huán)狀氨基酰基天冬氨酸衍生物是抗血栓形成劑，該專利的發(fā)明人和受讓人與本申請相同。與本申請的受讓人相同的、于1989年10月10日遞交的美國專利5051405中報(bào)道了氮雜環(huán)烷基甲?；拾滨Ｌ於彼嵫苌锸强寡ㄐ纬蓜?br>
1992年4月8日公開的歐洲專利申請0479481公開了用作纖維蛋白原受體拮抗劑的氮雜環(huán)烷基鏈烷?；拾滨Ｌ於滨０被犷惢衔铩?br>
1992年4月1日公開的歐洲專利申請0478362公開了用作纖維蛋白原受體拮抗劑的氮雜環(huán)烷基鏈烷?；幕?丙氨酸類化合物。
PCT專利申請公開號WO 95/10295公開了式II的氮雜環(huán)烷基鏈烷?；暮图匐模?
特別是N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺，其可以在哺乳動物中抑制血小板凝集和血栓形成，可用于預(yù)防和治療血栓形成。根據(jù)PCT專利申請公開號WO 95/10295所制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺是無定形的、吸濕的，并且由于吸濕其物理性質(zhì)也不穩(wěn)定。PCT專利申請公開號WO 95/10295并未公開N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕的、穩(wěn)定的結(jié)晶形式。
PCT專利申請公開號WO 95/10295還公開了氮雜環(huán)烷基鏈烷?；暮图匐氖峭ㄟ^常規(guī)的固相或液相肽合成方法，用原料和/或易于從化學(xué)品供應(yīng)商如Aldrich或Sigma處獲得的中間體制得的(H.Paulsen，G.Merz，V.Weichart，“O-糖肽序列的固相合成”，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27(1988)；H.Mergler，R.Tanner，J.Gosteli和P.Grogg，“通過固相和液相方法聯(lián)合進(jìn)行肽合成I一種新的用于固相合成完全保護(hù)的片段的對酸非常不穩(wěn)定的錨基”，四面體通訊(Tetrahedron Letters)29，4005(1988)；Merrifield，R.B.，“25年后的固相肽合成高血糖素拮抗劑的設(shè)計(jì)與合成”，Markromol.Chem.Macromol.Symp.19，31(1988))。此外，PCT專利申請公開號WO 95/10295還公開了N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的無定形和吸濕的形式是通過順序合成從C-末端氨基酸制得的，參見反應(yīng)路線I。反應(yīng)路線I
PCT專利申請公開號WO 95/10295并未公開從中心的二(假肽或肽)形成四-氮雜環(huán)烷基鏈烷?；暮图匐?，或者，具體地講，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺，由此使中心的二(假肽或肽)的N-和C-末端均與假氨基酸和/或氨基酸偶聯(lián)形成四-氮雜環(huán)烷基鏈烷?；暮图匐?。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及式I的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸溫的、穩(wěn)定的結(jié)晶形式。該化合物具有抗血栓形成活性，
包括在哺乳動物中抑制血小板聚集和血栓的形成，從而可用于預(yù)防和治療與心肌梗塞、中風(fēng)、外周動脈疾病和彌散性血管內(nèi)凝血等疾病有關(guān)的血栓形成。本發(fā)明還涉及N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的非吸濕的、穩(wěn)定的結(jié)晶形式的藥物組合物及其中間體。
本發(fā)明還涉及制備式II的四-氮雜環(huán)烷基鏈烷?；幕蚣匐幕衔锏姆椒?，
其中A是H；B是烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；Z是
E1是H；E2是天然α-氨基酸的-碳側(cè)鏈、H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、取代的雜環(huán)基烷基，或E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個(gè)4-、5-、6-或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)；G是OR1或NR1R2；R1和R2彼此獨(dú)立地是H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；R是H、烷基、芳基或芳烷基；m是1-5；n是0-6；p是1-4；特別是N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的非吸濕的、穩(wěn)定的結(jié)晶形式。
附圖概述
圖1表示實(shí)施例13，方法A中制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的非吸濕性結(jié)晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖2表示實(shí)施例13，方法B(a)中制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的非吸濕性結(jié)晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖3表示實(shí)施例13，方法B(b)中制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的非吸溫性結(jié)晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖4表示按照實(shí)施例14制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)已基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖5表示按照實(shí)施例14制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的非吸濕性結(jié)晶形式樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖6表示按照實(shí)驗(yàn)15的描述進(jìn)行的三次不同實(shí)驗(yàn)的輸出功率作為時(shí)間函數(shù)的等溫微量量熱圖。該實(shí)驗(yàn)監(jiān)測N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基}-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不同結(jié)晶形式與各種溶劑蒸氣接觸時(shí)的熱活性。圖6中的(A)線表明，當(dāng)根據(jù)實(shí)施例5或11制得的吸濕性N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺于40℃下暴露在80％RH(飽和氯化鉀溶液)中30小時(shí)以上時(shí)，發(fā)生了強(qiáng)烈的放熱事件，在該暴露過程中，化合物的吸濕形式轉(zhuǎn)變成了化合物的非吸濕形式。圖6中的(B)線表明，當(dāng)根據(jù)實(shí)施例5或11制得的吸濕性N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺于40℃下暴露在甲醇蒸氣(可溶解化合物的除水之外的溶劑)中時(shí)，未發(fā)生放熱轉(zhuǎn)化事件，因此，甲醇不會引起吸濕形式的晶體向非吸濕形式的轉(zhuǎn)變。圖6中的(C)線表明，當(dāng)根據(jù)實(shí)施例13制得的非吸濕形式的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺暴露于40℃/80％RH時(shí)，未發(fā)生了放熱轉(zhuǎn)變事件，因此，該化合物的非吸濕形式在這些條件下不會經(jīng)歷形式轉(zhuǎn)變，也就是說，是一種穩(wěn)定的形式。
圖7表示按照實(shí)驗(yàn)15的描述進(jìn)行的三次不同實(shí)驗(yàn)的輸出功率作為時(shí)間函數(shù)的等溫微量量熱圖。該實(shí)驗(yàn)監(jiān)測當(dāng)于40℃、50℃和60℃暴露在80％RH下時(shí)，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式向其非吸濕性形式轉(zhuǎn)變的熱活性。該圖表明，在40℃時(shí)，轉(zhuǎn)變在約24小時(shí)發(fā)生，在50℃時(shí)，在6.5小時(shí)發(fā)生，在60℃時(shí)，在3小時(shí)發(fā)生。
圖8表示按照實(shí)驗(yàn)15的描述進(jìn)行的四次不同實(shí)驗(yàn)的輸出功率作為時(shí)間函數(shù)的等溫微量量熱圖。該實(shí)驗(yàn)監(jiān)測當(dāng)于60℃暴露在65％、75％、80％和100％RH下時(shí)，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式向其非吸濕性形式轉(zhuǎn)變的熱活性。圖8的顯著特點(diǎn)是，較高的相對濕度引起較快的轉(zhuǎn)變。另一個(gè)顯著特點(diǎn)是，在100％RH下于60℃向化合物的非吸濕形式轉(zhuǎn)變時(shí)，不會發(fā)生吸濕形式在室溫下出現(xiàn)的液化現(xiàn)象。基于這些結(jié)果，預(yù)期在60℃下向非吸濕形式的轉(zhuǎn)變速度遠(yuǎn)高于吸濕形式的液化速度。
圖9表示按照實(shí)驗(yàn)16的描述進(jìn)行的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕(■)和非吸濕(●)形式在25℃下％重量增加對％RH作圖的比較。圖9表明，當(dāng)RH增加時(shí)，吸濕形式比非吸濕形式吸收更多的水分，在相對濕度大于60％時(shí)更為明顯。此外，圖9還表明化合物的吸濕形式不會解吸至其最初的重量％，而化合物的吸濕形式會解吸至其最初的重量％。
發(fā)明詳述若無相反說明，在本申請整個(gè)說明書中所用的如下術(shù)語應(yīng)理解為具有如下含義文中所用的縮寫包括BOC(叔丁氧羰基)、CBZ(芐氧羰基)、Gly(甘氨酸)、Asp(天冬氨酸)、0bzl(芐氧基)、TFA(三氟乙酸)、Cha(β-環(huán)己基丙氨酸)、EtOAc(乙酸乙酯)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)、HOBT(羥基苯并三唑)、，TBTU((2-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽)、DI(去離子水)、PNP(對硝基苯酚)、PFP(五氟苯酚)、DCU(二環(huán)己基脲)、NMM(N-甲基嗎啉)、MTBE(甲基叔丁基醚)、RH(相對濕度)、THF(四氫呋喃)、PipBu(4-哌啶丁酸)，PipBuen(4-(哌啶-4-叉)-丁酸)是下式化合物
“患者”包括人和其它哺乳動物。
“可藥用鹽”是指式I母體化合物的鹽形式，當(dāng)該鹽在治療劑量下使用時(shí)對患者相對無害，從而式I母體化合物有益的藥物特性不會被鹽形式抗衡離子的副作用而受到影響。可藥用鹽也包括式I化合物的兩性離子或內(nèi)鹽。
“烷基”指飽和的脂族烴基，該烴基可以是直鏈或支鏈的并且在鏈中含有約1-20個(gè)碳原子。支鏈?zhǔn)侵赣械图壨榛缂谆?、乙基或丙基連接在直鏈烷基鏈上。優(yōu)選的直鏈或支鏈烷基是含有1-約10個(gè)碳原子的“低級烷基”。首選的低級烷基含有1-約6個(gè)碳原子。
“環(huán)烷基”指含有一個(gè)或多個(gè)環(huán)并且含有約3-約10個(gè)碳原子的飽和碳環(huán)基團(tuán)。優(yōu)選的環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和十氫萘。
“環(huán)烷基烷基”指被環(huán)烷基取代的烷基。優(yōu)選的環(huán)烷基烷基包括環(huán)戊基甲基、環(huán)己基甲基、環(huán)己基乙基、十氫萘-1-基甲基和十氫萘-2-基甲基。
“烷基環(huán)烷基”指被烷基取代的環(huán)烷基。烷基環(huán)烷基的例子包括1-、2-、3-或4-甲基或乙基環(huán)己基。
“烷基環(huán)烷基烷基”指被烷基環(huán)烷基取代的烷基。烷基環(huán)烷基烷基的例子包括1-、2-、3-或4-甲基或乙基環(huán)己基甲基或1-、2-、3-或4-甲基或乙基環(huán)己基乙基。
“氮雜環(huán)烷烴”指含有氮原子的飽和脂族環(huán)。優(yōu)選的氮雜環(huán)烷烴包括吡咯烷和哌啶。
“天然-氨基酸”指甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、組胺酸、精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。
“天然α-氨基酸的α-碳側(cè)鏈”指取代天然-氨基酸的-碳的部分。天然-氨基酸的α-碳側(cè)鏈的例子包括纈氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的異丙基、甲基和羧甲基。
術(shù)語“氨基保護(hù)基”指本領(lǐng)域已知的易于脫除的基團(tuán)，該基團(tuán)用于防止氨基在合成過程中發(fā)生不利的反應(yīng)并且可以被選擇性地脫除。氨基保護(hù)基的用途是本領(lǐng)域已知的，用于防止氨基在合成過程中發(fā)生不利的反應(yīng)，許多所述的保護(hù)基是已知的，參見，例如T.H.Greene和P.G.M.Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，第2版，John Wiley& Sons，New York(1991)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是酰基，包括甲酰基、乙?；?、氯乙?；?、三氯乙?；?、鄰-硝基苯乙?；?、鄰-硝基苯氧乙?；?、三氟乙?；?、乙酰乙酰基、4-氯丁?；惗□；⑧?硝基肉桂?；⑦拎ぜ柞；?、酰基異硫氰酸酯、氨基己?；?、苯甲酰基等；和酰氧基，包括甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、2，2，2-三氟乙氧羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基、乙烯氧羰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基(BOC)、1，1-二甲基丙炔氧羰基、芐氧羰基(CBZ)、對硝基芐氧羰基、2，4-二氯芐氧羰基等。
術(shù)語“對酸不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基”指很容易通過用酸處理除去而對其它試劑相對穩(wěn)定的以上所定義的氨基保護(hù)基。優(yōu)選的對酸不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基是叔丁氧羰基(BOC)。
術(shù)語“對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基”指很容易通過氫化除去而對其它試劑相對穩(wěn)定的以上所定義的氨基保護(hù)基。優(yōu)選的對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基是芐氧羰基(CBZ)。
術(shù)語“酸保護(hù)基”指本領(lǐng)域已知的易于脫除的基團(tuán)，該基團(tuán)用于防止羧酸(-COOH)基團(tuán)在合成過程中發(fā)生不利的反應(yīng)并且可以被選擇性地脫除。羧酸保護(hù)基的用途是本領(lǐng)域熟知的，并且許多所述的保護(hù)基是已知的，參見，例如T.H.Greene和P.G.M.Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基，第2版，John Wiley & Sons，New York(1991)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。羧酸保護(hù)基的例子包括酯，例如甲氧甲基、甲硫基甲基、四氫吡喃基、芐氧基甲基、取代和未取代的苯甲酰甲基、2，2，2-三氯乙基、叔丁基、肉桂基、取代和未取代的芐基、三甲基甲硅烷基等，以及酰胺和酰肼，包括N，N-二甲基、7-硝基吲哚基、酰肼、N-苯基酰肼等。
術(shù)語“對氫化不穩(wěn)定的酸保護(hù)基”指很容易通過氫化除去而對其它試劑相對穩(wěn)定的以上所定義的酸保護(hù)基。優(yōu)選的對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基是芐基。
“芳基”指苯基或萘基。
“取代的芳基”指被一個(gè)或多個(gè)芳基取代基取代的苯基或萘基，所述取代基可以相同或不同，其中的“芳基取代基”包括烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羥烷基、?；?、甲?；?、羧基、鏈烯?；?、芳?；?、鹵素、硝基、三鹵代甲基、氰基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲?；?、烷基氨基甲?；?、二烷基氨基甲?；?、芳基氨基甲?；?、芳烷基氨基甲酰基、烷基磺?；?、烷基亞磺酰基、芳基磺酰基、芳基亞磺?；?、芳烷基磺?；⒎纪榛鶃喕酋；?NRaRb，其中Ra和Rb彼此獨(dú)立地是氫、烷基、芳基或芳烷基。
“芳烷基”指被芳基取代的烷基。優(yōu)選的芳烷基包括芐基、萘-1-基甲基、萘-2-基甲基和苯乙基。
“取代的芳烷基”指在芳基部分被一個(gè)或多個(gè)芳基取代基取代的芳烷基。
“雜環(huán)”指約4-至約15-元的單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)，其中，環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)原子是除碳以外的其它元素，例如氮、氧或硫。優(yōu)選的雜環(huán)包括吡啶基、嘧啶基和吡咯烷基。
“取代的雜環(huán)”指被一個(gè)或多個(gè)芳基取代基取代的雜環(huán)基團(tuán)。
“雜環(huán)基烷基”和“取代的雜環(huán)基烷基”分別指被雜環(huán)基團(tuán)和取代的雜環(huán)基團(tuán)取代的烷基。
“吸濕性”指吸著作用，是指足以影響物質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)的水的獲得量或狀態(tài)(Eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，制藥技術(shù)百科全書(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)，Vol.10，33頁)。優(yōu)選的實(shí)施方案根據(jù)本發(fā)明制備的優(yōu)選的化合物是式II所述的化合物，其中E2是氫、烷基、羥甲基、1-羥基乙基、巰基甲基、2-甲硫基乙基、羧甲基、2-羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、取代的雜環(huán)基烷基，或者，E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個(gè)4-、5-、6-或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)，條件是雜環(huán)基烷基不是吲哚-3-基甲基。
根據(jù)本發(fā)明制備的更優(yōu)選的化合物是式II所述的化合物，其中E2是氫、烷基、羥甲基、1-羥基乙基、巰基甲基、2-甲硫基乙基、羧甲基、2-羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基，或者，E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個(gè)4-、5-、6-或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明制備的更優(yōu)選的化合物是式II所述的化合物，其中E2是氫、烷基、羥甲基、1-羥基乙基、巰基甲基、2-甲硫基乙基、羧甲基、2-羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基，或者，E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個(gè)4-、5-、6-或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明制備的更為優(yōu)選的化合物是式II所述的化合物，其中B是烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基。
根據(jù)本發(fā)明制備的一個(gè)具體的實(shí)施方案是式IIa所描述的化合物
其中B是烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；J是H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基；L是OR1或NR1R2；R1和R2彼此獨(dú)立地是H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；m是1-5；n是2-6；p是1或2。
根據(jù)本發(fā)明制備的更優(yōu)選的具體實(shí)施方案是式IIa所描述的化合物，其中B是烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基；
J是H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基；m是3；n是3或4。
根據(jù)本發(fā)明制備的進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方案是式IIa所描述的化合物，其中B是烷基；J是烷基、環(huán)烷基或、環(huán)烷基烷基；R1和R2彼此獨(dú)立地是H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基；m是3；n是3或4；p是1。
根據(jù)本發(fā)明制備的另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方案是式IIa所描述的化合物，該化合物是N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是形成N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的穩(wěn)定的、不吸濕的結(jié)晶形式。根據(jù)本發(fā)明，化合物的這種形式可以制成化合物的穩(wěn)定制劑。N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的穩(wěn)定的、不吸濕的結(jié)晶形式還具有高的熔點(diǎn)，并且沒有吸水的傾向。在高于運(yùn)輸、劑型生產(chǎn)或長期運(yùn)輸或儲存過程中所遇到的正常濕度和溫度下，該穩(wěn)定的形式還對濕度和溫度表現(xiàn)出獨(dú)特的、意想不到的良好穩(wěn)定性。這些特性也有利于劑型的生產(chǎn)。向穩(wěn)定形式的轉(zhuǎn)變還不會引起物質(zhì)或其純度的損失，也不會對其顆粒性質(zhì)產(chǎn)生不利影響。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括文中所定義的優(yōu)選化合物、優(yōu)選實(shí)施方案和具體實(shí)施方案的所有組合。
本發(fā)明的化合物可以以游離堿或酸的形式、其兩性離子鹽的形式或其可藥用鹽的形式使用。所有這些形式均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如果本發(fā)明的化合物被堿性基團(tuán)取代，則可以形成酸加成鹽，所述酸加成鹽是更便于使用的形式；在實(shí)踐中，鹽形式的應(yīng)用相當(dāng)于游離堿形式的應(yīng)用?？捎糜谥苽渌峒映甥}的酸優(yōu)選包括那些當(dāng)與游離堿混合時(shí)可形成可藥用鹽的酸，可藥用鹽是指，在鹽的藥物劑量下，其陰離子對患者無毒的鹽，從而游離堿所具有的對血小板凝集和血栓形成的有利的抑制效果不會被陰離子的副反應(yīng)所影響。盡管優(yōu)選所述堿性化合物的可藥用鹽，但所有酸加成鹽均可用作游離堿形式的來源，即使某個(gè)具體的鹽本身僅適用于作為中間體產(chǎn)物，例如，當(dāng)成鹽僅僅是為了純化和鑒定的目的時(shí)，或?qū)⑵溆米魍ㄟ^離子交換的方法制備可藥用鹽的中間體。本發(fā)明范圍內(nèi)的可藥用鹽是從如下酸衍生的鹽無機(jī)酸如鹽酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸；以及有機(jī)酸如乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)己基氨基磺酸、奎尼酸等。相應(yīng)的酸加成鹽包括氫鹵酸鹽，例如鹽酸鹽和氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、氨基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、亞甲基-雙-β-羥基萘酸鹽、龍膽酸鹽、甲磺酸鹽、羥乙基磺酸鹽和二對甲苯甲酰酒石酸甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽和奎尼酸鹽等。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)，本發(fā)明化合物的酸加成鹽采用已知的方法，通過將游離堿與適宜的酸反應(yīng)制得。例如，本發(fā)明化合物的酸加成鹽的制備可以通過將游離堿溶于含有適宜酸的水溶液或水-醇溶液或其它適宜的溶劑中并通過蒸發(fā)溶液分離鹽來進(jìn)行，或通過將游離堿和酸在有機(jī)溶劑中反應(yīng)來進(jìn)行，在該情況下，鹽可以直接分離出來或可以通過濃縮溶液得到。
本發(fā)明化合物的酸加成鹽可以通過已知的方法從鹽再生。例如，本發(fā)明的母體化合物可以通過用堿例如碳酸氫鈉水溶液或氨水溶液處理從其酸加成鹽再生。
如果本發(fā)明的化合物被酸性基團(tuán)取代，則可以形成堿加成鹽，所述堿加成鹽是更便于使用的形式；在實(shí)踐中，鹽形式的應(yīng)用相當(dāng)于游離酸形式的應(yīng)用。可用于制備堿加成鹽的堿優(yōu)選包括那些當(dāng)與游離酸混合時(shí)可形成可藥用鹽的堿，可藥用鹽是指，在鹽的藥物劑量下，其陽離子對動物體無毒的鹽，從而游離酸所具有的對血小板凝集和血栓形成的有利的抑制效果不會被陽離子的副反應(yīng)所影響。可藥用鹽包括，例如堿金屬鹽和堿土金屬鹽，本發(fā)明范圍內(nèi)的可藥用鹽是從如下堿衍生的鹽氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅、氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N，N，-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)-氨基甲烷、四甲基氫氧化銨等。
本發(fā)明化合物的金屬鹽可以通過將選定金屬的氫化物、氫氧化物、碳酸鹽或類似的活潑化合物在含水或有機(jī)溶劑中與化合物的游離酸形式接觸制得。所用的含水溶劑可以是水或是水與有機(jī)溶劑的混合物，優(yōu)選醇如甲醇或乙醇、酮如丙酮、脂肪族醚如四氫呋喃或酯如乙酸乙酯。所述反應(yīng)通常在室溫下進(jìn)行，如需要，也可以在加熱下進(jìn)行。
本發(fā)明化合物的銨鹽可以通過將胺在含水或有機(jī)溶劑中與化合物的游離酸形式接觸制得。適宜的含水溶劑包括水和水與醇如甲醇或乙醇、醚如四氫呋喃、腈如乙腈、或酮如丙酮的混合物。氨基酸鹽可按照類似的方法制得。
本發(fā)明化合物的堿加成鹽可以通過已知的方法從鹽再生。例如，本發(fā)明的母體化合物可以通過用酸例如鹽酸處理從其堿加成鹽再生。
本發(fā)明化合物的鹽除了本身可用作活性化合物外，還可用于純化化合物的目的，例如，通過利用鹽和母體化合物、副產(chǎn)物和/或原料之間溶解度的不同，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行純化。
本發(fā)明的化合物可以含有不對稱中心。這些不對稱中心可以彼此獨(dú)立地是R或S構(gòu)型。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，某些式I化合物可以具有幾何異構(gòu)體。幾何異構(gòu)體包括帶有烯基部分的本發(fā)明化合物的順式和反式形式。本發(fā)明包括單獨(dú)的幾何異構(gòu)體和立體異構(gòu)體以及它們的混合物。
所述異構(gòu)體可以通過已知的方法，例如色譜法和重結(jié)晶技術(shù)從它們的混合物中分離出來，或可以從它們中問體的適宜異構(gòu)體通過本文所述的方法分別制得。
美國專利申請08/138820和08/476750描述了無定形式II化合物、特別是無定形式I化合物的制備方法，以上專利申請?jiān)诖艘氡疚淖鳛閰⒖肌?br>
反應(yīng)路線II中所示的合成方法描述了用于制備式II化合物、特別是本發(fā)明的結(jié)晶狀式I化合物的本發(fā)明的新方法，其中B、E1、E2、G、R、m、n和p如上所定義，P1是對氫化不穩(wěn)定的酸保護(hù)基如芐基，P2是對酸不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基如叔丁氧羰基(BOC)，P3是對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基如芐氧羰基(CBZ)。反應(yīng)路線II
在制備式II化合物或其中間體的過程中，可能還需要防止天然或假氨基酸上存在的化學(xué)活潑取代基之間的交叉反應(yīng)。這些取代基可以用常規(guī)的保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)，所述保護(hù)基隨后可以根據(jù)需要通過已知方法脫除或保留以生成所需的產(chǎn)物或中間體(參見，例如Greene，“有機(jī)合成中的保護(hù)基”，Wiley，New York，1981)。還需要進(jìn)行選擇性地保護(hù)或脫保護(hù)以轉(zhuǎn)化或除去己存在的保護(hù)基，或以便進(jìn)行隨后的反應(yīng)以生成最終的所需產(chǎn)物。
以式II化合物的制備對反應(yīng)路線II的方法進(jìn)行舉例說明，但應(yīng)當(dāng)理解，式I化合物是用適宜的原料制得的。在根據(jù)反應(yīng)路線II制備式I化合物時(shí)，B是乙基，E是H，F(xiàn)是環(huán)已基甲基，G是NH2，R是H，m是3，n是3，p是1，P1是芐基，P2是BOC，P3是CBZ。
根據(jù)本發(fā)明，制備式I化合物的另一種方法與反應(yīng)路線II中的方法相似，所不同的是用式III化合物(其中的P3如上所定義)
代替式IV化合物，
其中R是H，m是3，n是3，p是1，P3是CBZ，以生成式V的中間體，
其中B是乙基，E1是H，E2是環(huán)己基甲基，G是NH2，p是1，P1是芐基，P3是CBZ 。
反應(yīng)路線II說明了一種制備本發(fā)明化合物的五步方法，首先是形成本發(fā)明式VI的中心二肽中間體，
其中B、p、P2和P1如上所定義。在制備式I化合物的情況下，本發(fā)明的中心二肽中間體是BOC-N(Et)-Gly-(L)-Asp-(OBzl)-OH。制得的中心二肽中間體未對游離的羧基部分進(jìn)行保護(hù)。
在反應(yīng)路線II的第2步中，偶聯(lián)形成中心二肽的反應(yīng)可以在二氯甲烷或乙酸乙酯(含或不含DMF作為助溶劑)和有機(jī)堿如NMM的混合物中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為室溫至約40℃。用于偶聯(lián)的下式氨基酸或假氨基酸的活化可以采用
不用分離的活潑酯的形式用對硝基苯酚、五氟苯酚和N-羥基-琥珀酰亞胺通過二環(huán)己基碳二亞胺的作用來完成。根據(jù)所要偶聯(lián)的氨基酸或假氨基酸、活化劑、溶劑和溫度，偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為約1-20小時(shí)。步驟1的中心二肽產(chǎn)物無需分離。步驟1的反應(yīng)混合物通常用水或稀的含水酸(例如鹽酸)洗滌，然后不經(jīng)干燥直接用于步驟2。當(dāng)使用基于苯酚的活潑酯時(shí)，將中心二肽產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中萃取到堿性水溶液中，然后再從酸化的水溶液中萃取到有機(jī)溶劑中，然后將該溶液直接進(jìn)行步驟2的反應(yīng)。
式VI的二肽中間體用于制備本發(fā)明式VII的三肽中間體，
其中B、E1、E2、G、p和P1如上所定義，P2’是P2或TFA·H-。當(dāng)P2’是TFA·H-時(shí)，“·”符號表示TFA解離形成F3CCO2-和H+，其中H+質(zhì)子化式VII化合物末端的胺，即形成式VIIa的TFA鹽。
在制備式I化合物時(shí)，本發(fā)明的三肽中間體是p2'-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2。
在步驟2中，氨基酸或假氨基酸與中心二肽的偶聯(lián)反應(yīng)可以在二氯甲烷或乙酸乙酯和DMF或THF的混合物中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為室溫是低于室溫。用于偶聯(lián)的下式中心二肽的活化
可以用五氟苯酚或N-羥基-琥珀酰亞胺通過二環(huán)己基碳二亞胺的作用形成不用分離的活潑酯來完成?；罨磻?yīng)還可以用氯甲酸異丙酯來進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間隨所要偶聯(lián)的氨基酸或假氨基酸、活化劑、溶劑和溫度而改變，為約1-20小時(shí)。三肽產(chǎn)物可以不用分離。當(dāng)不分離三肽中間體時(shí)，將反應(yīng)混合物用有機(jī)堿的水溶液如N-甲基嗎啉水溶液和含水的酸如鹽酸洗滌，在用水洗滌后不經(jīng)干燥直接通過步驟3的方法進(jìn)行反應(yīng)。
在反應(yīng)路線II的步驟3中，可以用三氟乙酸的二氯甲烷溶液，或用HBr在乙酸和乙酸乙酯中的混合物從步驟2的三肽產(chǎn)物上脫除保護(hù)基如BOG。反應(yīng)可以在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)分別需要約1小時(shí)(HBr法)和約2小時(shí)(TFA法)。通過過濾以結(jié)晶狀固體的形式從反應(yīng)混合物中分離出三肽的酸加成鹽產(chǎn)物，該過程可以直接進(jìn)行(HBr法)，也可以在蒸除部分溶劑并向殘余物中加入非極性溶劑后進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個(gè)方法可描述為從BOC-N(Et)Gly-OH迅速、簡便地制備TFA·H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的單一連環(huán)方法，該方法是包括反應(yīng)路線II的前兩步和用TFA處理的“一勺燴”反應(yīng)。結(jié)果出人意料地得到TFA·H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2，因其從連環(huán)反應(yīng)溶液中直接結(jié)晶出來。該連環(huán)方法避免了反應(yīng)路線II中相應(yīng)的三步不連續(xù)的反應(yīng)，建立了一種簡單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)的合成方法，該方法可用于工業(yè)生產(chǎn)。
反應(yīng)路線II表明了以相反的順序構(gòu)建多肽，從N-保護(hù)的氨基酸開始，然后依次在羧基末端添加，該順序與常規(guī)的順序相反，在常規(guī)的順序中，多肽是通過在保護(hù)的C-末端氨基酸的氨末端依次酰胺化構(gòu)建的。本發(fā)明的反向合成方法僅需對第一個(gè)氨基酸的氮進(jìn)行保護(hù)，從此以后可以使用在胺或酸末端均未保護(hù)的氨基酸(側(cè)鏈功能基除外)。反向合成方法還可以以流水線生產(chǎn)式II化合物、特別是式I化合物，因?yàn)榭梢允褂昧鲃有蜕a(chǎn)技術(shù)而不是液相肽化學(xué)通常需要的批量型技術(shù)。這種新方法無需購買在胺末端保護(hù)的氨基酸，從而降低了生產(chǎn)成本。無需特殊的設(shè)備、試劑或分析方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方法是通過新型的固態(tài)轉(zhuǎn)變方法從通過反應(yīng)路線II和指出的替代反應(yīng)步驟中所述方法制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶可重復(fù)地形成N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的穩(wěn)定的、不吸濕的結(jié)晶。
N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式的物理性質(zhì)不穩(wěn)定，在接觸濕度和溫度的條件下轉(zhuǎn)變成高度穩(wěn)定的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕的結(jié)晶形式。
根據(jù)本發(fā)明，用于從N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式向高度穩(wěn)定的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-B-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕性結(jié)晶形式轉(zhuǎn)變的一般條件在靜態(tài)和動態(tài)條件下完成。
本發(fā)明的靜態(tài)方法是指靜態(tài)轉(zhuǎn)變，因?yàn)樵摲椒ò▽⒅糜诓荒芤苿拥娜萜魅缧∑炕蛲斜P內(nèi)的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸溫性結(jié)晶形式在控制的環(huán)境室內(nèi)暴露于特定的溫度和濕度條件。該“靜態(tài)”轉(zhuǎn)變在約20℃-80℃、更優(yōu)選約40℃-80℃的溫度下和約40％-100％RH、優(yōu)選約65％-80％RH的相對濕度下進(jìn)行。
本發(fā)明的動態(tài)方法是指動態(tài)轉(zhuǎn)變，因?yàn)樵摲椒ò▽-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式暴露于與靜態(tài)模型相同的濕度和溫度條件下，并同時(shí)進(jìn)行攪拌，包括將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中翻滾或在圓柱形容器中(在濕度烘箱中)用攪拌葉片攪拌。
以下實(shí)施例是用來說明本發(fā)明的，并不對其范圍構(gòu)成限定。
若無相反說明，所報(bào)道的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)是在VG 70SE上進(jìn)行的低分辨快原子轟擊質(zhì)譜，“計(jì)算”值為(M＋H)+。核磁共振(NMR)波譜數(shù)據(jù)用Brucker ACF 300在D2O中得到?？焖偕V在硅膠上進(jìn)行。高效液相色譜(HPLC)在粒度為8-15μ的C-18反相柱上進(jìn)行。
若無相反說明，所報(bào)道的x-射線粉末衍射圖是用帶有Cu輻射源的Siemens D5000衍射儀(1.8kW，45kV，40mA)掃描粉末樣品得到的。在測定前，將樣品研磨以消除粒度對峰強(qiáng)度的影響。將約60mg樣品上樣到1.5×1cm樣品器內(nèi)并以3-40°2θ的范圍進(jìn)行掃描，步長為0.04°，每一步長共照射1秒。實(shí)施例1 BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-OH的制備(反應(yīng)路線II的步驟1)向1升的三頸圓底燒瓶中加入51g(0.25mol)BOC-N(Et)Gly-OH、35g(0.25mol)PNP、400mL乙酸乙酯和100mLDMF。將該混合物攪拌形成溶液并冷卻至4-6℃。在10分鐘內(nèi)滴加51.5g(0.25mol)DCC的125mL乙酸乙酯溶液，同時(shí)將溫度保持在約5℃-約8℃。將所有DCC加完后，移走冷卻浴，將混合物升溫至室溫(20-22℃)并攪拌1.5小時(shí)。在此期間內(nèi)有DCU固體沉淀生成。通過分析型HPLC(BOC-N(Et)Gly-OH的消失)確定PNP酯的形成是否完全。將反應(yīng)混合物過濾并將DCU殘余物用2-50mL乙酸乙酯洗滌，將洗滌液加入到濾液中。棄除DCU。
向攪拌的濾液中加入67g(0.3mol)H2N-(L)-Asp-(OBzl)-OH在150mml(138g，1.36mol)NMM中的漿液。將混合物加熱至38-40℃并在該溫度下保持41小時(shí)，此刻的分析型HLPC表明BOC-N(Et)Gly-OPNP已完全消耗掉。將反應(yīng)混合物冷卻至25℃并濾除未反應(yīng)的H2N-(L)-Asp-(OBzl)-OH。將溶液冷卻并過濾，再次得到1.2g(回收21.7g，11.2g是加入的20％過量，10.5g(0.047mol)是未反應(yīng)的物質(zhì))。
將濾液在2升Squibb漏斗中用500mL去離子水萃取，然后用2×250mL萃取。將合并的水溶液用3×300mL 1∶1 MTBE/EtOAc萃取以除去殘余的PNP(HPLC分析表明僅有痕量殘余)，然后冷卻至5℃并滴加150mL濃鹽酸進(jìn)行酸化，從pH8.9至pH1.79。將酸化的水溶液用2×200mL乙酸乙酯萃取。對水溶液的HPLC分析表明不含殘余的所需產(chǎn)物。將乙酸乙酯萃取液合并，用硫酸鎂干燥，過濾并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35℃濃縮。將得到的淡橙色油于35℃抽真空，以盡可能地除去殘余的溶劑，得到85.68g油狀的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-OH(21.3mol，85.5％收率，未對殘余的溶劑進(jìn)行校正)。鑒定NMR(250MHz)7.3ppm(s)，5.1ppm(s)，3.3ppm(dq)，3.0ppm(dq)，1.4ppm(s)，1.1ppm(t)MSM=408；M+1觀測值=409HPLC90.79A％(3.87A％對硝基苯酚，未對e進(jìn)行校正)元素分析C20H28N2O7H，N；C實(shí)測值57.54，C計(jì)算值58.81實(shí)施例2 BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的制備(反應(yīng)路線II的步驟2)方法A氯甲酸異丙酯法將1當(dāng)量BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH溶于乙酸乙酯(6-8體積；1∶6.5重量體積)并將溫度保持在-15℃至0℃。加入NMM(1當(dāng)量)并將溫度保持在約-15℃至約0℃。在約-15℃至0℃的溫度下向保護(hù)的二肽溶液中加入氯甲酸異丙酯(1-1.1當(dāng)量)。將反應(yīng)液在約-15℃至約0℃的溫度下保持2-5分鐘。向維持在約-15℃至約0℃的二肽溶液中加入H2N-(L)-Cha-NH2(1當(dāng)量)的THF溶液(10體積，1∶10重量體積)。用在1 5分鐘、1小時(shí)和2小時(shí)得到的進(jìn)程控制(HPLC)樣品監(jiān)測反應(yīng)，以評估反應(yīng)是否完成。(當(dāng)所觀察的二肽在HPLC分析中的面積小于10％時(shí)，表明反應(yīng)完成)。
BOC-三肽產(chǎn)物直接從反應(yīng)溶液中沉淀出來，從反應(yīng)混合物中濾出沉淀，用乙酸乙酯洗滌(2次，1體積，重量∶體積)，然后真空干燥。一般產(chǎn)率＞60％，純度＞90A％；通常觀察到＜1A％的天冬氨酸差向非對映異構(gòu)體。
用乙酸乙酯形成漿液，由此可得到最終收率約為60％的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2并將純度提高到＞95A％，同時(shí)將非對映異構(gòu)體降低至＜0.5％。
作為氯甲酸異丙酯的一個(gè)具體例子，當(dāng)進(jìn)行實(shí)施例A的一般方法并使用4.55g(8.1mmol)BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH時(shí)，則制得的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的量為3.26g(純度97.9A％，0.3A非對映異構(gòu)體)，70％理論收率。方法B五氟苯酚-DCC復(fù)合物法將五氟苯酚(PFP，2.9當(dāng)量)和DCC(1當(dāng)量)于室溫下溶于乙酸乙酯(5體積；1∶5重量∶體積)并冷卻至-15℃至0℃。將1當(dāng)量BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH溶于乙酸乙酯(6體積，1∶6重量∶體積)并與事先溶于DMF(10體積，1∶10重量∶體積)的1當(dāng)量H2N-(L)-Cha-NH2混合。將二肽/H2N-(L)-Cha-NH2溶液滴加到PFP和DCC的溶液中，保持溫度在-15℃至0℃。將反應(yīng)液在15-22℃保持5-16小時(shí)，用在1、2、3、4和16小時(shí)得到的進(jìn)程控制(HPLC)樣品評估反應(yīng)是否完成。(當(dāng)所觀察的二肽的量在HPLC分析中面積小于2％時(shí)，表明反應(yīng)完成)。
將反應(yīng)混合物過濾并將濾餅(DCU)用乙酸乙酯(2×0.5體積；重量∶體積)洗滌。將濾液用水(10體積；1∶10重量∶體積)處理并除去水層。將乙酸乙酯層用水(1次，5體積；1∶5重量∶體積)洗滌。將乙酸乙酯層冷卻至析出產(chǎn)物沉淀，濾出沉淀并用乙酸乙酯(2×0.4體積；1∶0.4重量∶體積)洗滌。分離的摩爾收率＞60％，一般純度＞90A％；含1-4A％的天冬氨酸差向非對映異構(gòu)體。
用乙酸乙酯形成漿液，由此可得到最終收率約為60％的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-(L)-Cha-NH2并將純度提高到＞99A％，同時(shí)將非對映異構(gòu)體降低至＜0.5％。
作為五氟苯酚-DCC復(fù)合物法的一個(gè)具體例子，當(dāng)進(jìn)行實(shí)施例B的一般方法并使用10g(24.5mmol)BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH時(shí)，則制得的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的量為8.15g(純度99A％，0.49A非對映異構(gòu)體)，59％理論收率。方法C羥基苯并三唑(HOBT)/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)法將1當(dāng)量BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH溶于DMF(9-10體積，1∶10重量∶重量)并保持在室溫。向該溶液中加入H2N-(L)-Cha-NH2(1當(dāng)量)和羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。將得到的溶液冷卻至約0℃-10℃，然加入NMM(1-1.1當(dāng)量)。將偶聯(lián)劑TBTU(1-1.1當(dāng)量)溶于DMF(4-5體積，1∶5重量∶重量)并于0℃至約10℃下加入到保護(hù)的二肽溶液中。將該溶液于約10℃-25℃攪拌約3小時(shí)，直至HPLC分析表明反應(yīng)完成(原料的面積小于2％)。將反應(yīng)混合物加入到攪拌中的5％氯化鈉水溶液(約為反應(yīng)液體積的4倍)和乙酸乙酯(約為反應(yīng)液體積的2倍)的混合物中。分液，將水相用另外的乙酸乙酯(約為反應(yīng)液體積的1.5倍)萃取。合并有機(jī)相，依次用0.5N檸檬酸水溶液(約為有機(jī)相體積的0.6-0.7倍)、10％碳酸氫鈉水溶液(兩次，每次均約為有機(jī)相體積的0.6-0.7倍)和25％氯化鈉水溶液(約為有機(jī)相體積的0.3-0.4倍)洗滌。將得到的有機(jī)相在約30-50℃下減壓濃縮至約1/4至1/2體積，然后向該溫?zé)岬娜芤褐屑尤胪w積的庚烷。將混合物攪拌并冷卻至約0℃至約20℃以析出所需三肽的沉淀。濾出固體，用乙酸乙酯和庚烷的混合物洗滌，干燥。一般收率＞60％，一般純度＞95.7A％；天冬氨酸差向非對映異構(gòu)體的含量＜2A％。
作為HOBT/TBTU法的一個(gè)具體例子，當(dāng)按照該一般方法進(jìn)行時(shí)，使用10g(24.5mmol)BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH，制得9.3gBOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(純度96.1A％，1.77A％Asp的非對映異構(gòu)體)，67.7％理論收率。質(zhì)譜M計(jì)算值560.7；M+1觀測值561mp 182.17(DSC)1H NMR(δ vs TMS，D6 DMSO)0.89 m(1H)；0.94，m(1H)；1.0，dt(2H)；1.15，m(2H)；1.06-1.3,m(4H)；1.36，d(9H)；1.4-1.74，m(6H)；2.65，m(1H)；2.85，m(1H)；3.18.m(2H)；3.75，d(2H)；4.2，s(1H)；4.66，d(1H)；5.08，s(2H)；7.02，s(1H)；7.18，d(1H)；7.36，s(5H)；7.88，dd(1H)；8.24，dd(1H)。實(shí)施例3 TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的制備(反應(yīng)路線II的步驟3)將BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2溶于二氯甲烷(約1∶12w/w)，然后于室溫下向該溶液中加入TFA。將其攪拌至HPLC表明反應(yīng)完成(3-5小時(shí))。將溶液于40-45℃濃縮至約1/2體積。向該溫?zé)岬娜芤褐屑尤隡TBE(相對于BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2約1∶10w/w)，同時(shí)保持溫度＞40℃。將該混合物緩慢冷卻至約5℃并攪拌1小時(shí)以確保完全結(jié)晶。將生成的固體過濾，用冷的MTBE洗滌。將固體減壓干燥并分析TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的含量(HPLC w/w分析)。收率通常接近定量，純度＞95A％。質(zhì)譜M計(jì)算值460(游離堿)；M+1觀測值461元素分析C26H37N4O7F3H，N，F(xiàn)，C 54.35，實(shí)測值53.821H NMR(δ vs TMS，D6DMSO)0.9，m(2H)；1.15，1(6H)；1.5，m(1H)；1.5-1.8，m(6H)；2.65 dd(1H)；2.9 m(3H)；3.7，s，(2H)；3.9，m(2H)；4.2，m(1H)；4.75，m(1H)；5.1，s(2H)；7.0，s(1H)；7.15，s(1H)；7.2，s(5H)；8.13，d(1H)；8.7-8.8，m(3H)。13C NMR(顯著信號，δvs TMS，D6 DMSO)10.76，25.49，25.68，25.96，31.66，33.07，33.36，36.25，38.59，41.88，47.02，49.40，50.47，65.71，127.81-128.34，135.82，165.10，169.34，173.79脫保護(hù)的具體例子如表A所示。
表A
實(shí)施例4 CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的制備(反應(yīng)路線II的步驟4)制備約等摩爾量的TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2、CBZ-PipBu和TBTU在乙酸乙酯、DMF和水(100∶8∶4v/v；相對于TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2約11∶1總體積/重量)中的懸浮液。將該懸浮液冷卻至0-10℃并加入約3-4當(dāng)量的NMM。將該混合物升溫至室溫并攪拌至HPLC表明反應(yīng)完成(1-3小時(shí)，在此期間內(nèi)形成溶液)。加入水(最初加入水量的2-3倍)并分液。保留水相，將有機(jī)相用水洗滌兩次。將合并的含水洗滌液用乙酸乙酯萃取，將合并的有機(jī)相用25％氯化鈉水溶液洗滌。將有機(jī)相減壓濃縮至約1/2體積，加入MTBE(相對于溶液體積，約1/2v/v)。使混合物結(jié)晶(數(shù)小時(shí))，過濾收集固體，用冷的乙酸乙酯和MTBE的混合物沖洗。將固體減壓干燥。通過HPLC w/w分析確定CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的含量。收率通常＞80％，純度＞95A％。
作為上述制備方法的具體實(shí)例，當(dāng)按照該一般方法進(jìn)行時(shí)，使用7.25g(24.5mmol)TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2，制得7.9g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(純度＞99A％，0.08A％ Asp的非對映異構(gòu)體)，84％理論收率。元素分析C41H57N5O8H，N，C，65.84，實(shí)測值，65.38質(zhì)譜M計(jì)算值747；M＋1觀測值748mp 101.6(DSC)1H NMR(δvs TMS，CDCl3)0.88m(1H)；0.98，m(1H)；1.13(2H)；1.23，m(6H)；1.4，m(1H)；1.62-1.76，m(8H)；1.86，qd(1H)；2.35，t(1H)；2.74，dd(2H)；3.25，dd(1H)；3.47，q(2H)；3.7，d(1H)；3.84，d(1H)；4.15，ds(2H)；4.5，qd(1H)；4.68，dt(1H)；5.07，d(1H)；5.14 bd(2H)；5.16，d(1H)；7.28-7.39，m(10H)；7.57，dd(1H)13C NMR(相對于TMS的δ，CDCl3)[顯著峰]66.93(兩個(gè)芐基碳)，127.78-128.64(兩個(gè)苯環(huán))，155.249，170.00，170.24，171.69，174.27，175.21(所有的羰基碳)。實(shí)施例5 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式的制備(反應(yīng)路線II的步驟5)制備CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2、甲酸銨和10％Pd/C在20∶1醇/水(相對于CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2，10∶1體積/重量)中的混合物。將該混合物加熱至40-50℃，然后攪拌至HPLC表明反應(yīng)完成(1-2小時(shí))。將該混合物冷卻至室溫并濾除催化劑。將得到的溶液加熱至40-50℃并加入丙酮(約于濾液等體積)，使溶液冷卻至35-40℃。向混合物加入N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的晶種，在冷卻至室溫時(shí)結(jié)晶出N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式(數(shù)小時(shí))。在氮?dú)夥障逻^濾收集固體，用丙酮沖洗。將固體減壓干燥并分析N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶的含量(HPLC w/w分析)。收率通常＞85％，純度＞95A％。
作為上述制備方法的具體實(shí)例，當(dāng)按照步驟5的一般方法進(jìn)行時(shí)，使用5g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2制得了3.1g白色固體狀的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式(純度99.6A％)，化學(xué)計(jì)量收率的89.4％。
根據(jù)上述實(shí)施例1-5，使用適宜的原料制得了如下化合物N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]纈氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-D-纈氨酸，N-[N-[N-(3-(哌啶-4-基)丙?；?-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]纈氨酸，N-[N-[N-(5-(哌啶-4-基)戊?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]纈氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-α-環(huán)己基甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]正亮氨酸，
N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-α-(2，2-二甲基)丙-3-基甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]-L-β-十氫萘-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-α-(2-環(huán)己基乙基)甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]苯丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-β-萘-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-β-萘-2-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-β-環(huán)己基丙氨酸，乙酯N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-L-β-順-十氫萘-2-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-α-氨基環(huán)己烷甲酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-環(huán)己基-D-丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]-β-十氫萘-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-環(huán)己基丙氨酸-N-乙基酰胺，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-環(huán)辛基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-環(huán)己基甲基丙氨酰胺，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-金剛烷-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-(1，2，3，4)-四氫萘-5-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-(4-環(huán)己基)環(huán)己基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-環(huán)庚基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]-β-環(huán)辛基丙氨酰胺，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]--環(huán)己基丙基甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]-β-環(huán)辛基甲基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠天冬氨酰]-β-環(huán)戊基丙氨酸，和N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]天冬氨酰]-β-環(huán)己基甲基丙氨酸乙酯。實(shí)施例6 4-N-CBZ-哌啶酮的制備將40Kg N-芐氧羰氧基琥珀酰亞胺和26Kg(175mol)4-哌啶酮·HCl·H2O在38.8Kg水和88Kg THF中的混合物在15℃±5℃下攪拌直至溶解(約15分鐘)。向攪拌的混合物中加入NMM(22.8Kg)(放熱)，同時(shí)將溫度保持在20℃或20℃以下。將其在20℃±5℃下攪拌2.5小時(shí)，此刻的HPLC表明反應(yīng)完成。將混合物用115.2Kg MTBE和38.8Kg水稀釋并在20℃±5℃下攪拌5分鐘。停止攪拌，分層，分出水層(下層)并棄除。將有機(jī)層用2×129.6Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離并棄除水相[下層])。將有機(jī)層用5.2Kg氯化鈉的46.8Kg水溶液洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離并棄除水相[下層])。將有機(jī)層用11.5Kg硫酸鎂處理，攪拌1小時(shí)，然后將混合物過濾。將反應(yīng)器用8Kg MTBE沖洗(過濾，與主濾液合并；總濾液水的含量0.52％)。于30℃下減壓蒸餾將混合物的體積減少-半。向真空中充入氮?dú)獠堄辔锢鋮s至20℃(殘余物中水的含量0.43％)。將殘余物用57.6Kg MTBE稀釋，然后通過30℃下減壓蒸餾再次將混合物的體積減少一半。向真空中充入氮?dú)獠堄辔锢鋮s至20℃(殘余物中水的含量0.25％)。如此重復(fù)5次。將最終的殘余物用28.8KgMTBE稀釋并攪拌5分鐘，然后分析水含量和4-N-CBZ-哌啶酮的含量(水0.05％，4-N-CBZ-哌啶酮w/w分析22.66重量％，35.36kg，155mol，88.6％化學(xué)計(jì)量收率)。實(shí)施例7 PipBu的制備在氮?dú)饬飨录皵嚢柘?，制?3.5Kg 3-羧基丙基三苯基溴化鏻在230.1Kg 1，2-二甲氧基乙烷中的溶液。于35分鐘內(nèi)加入叔丁醇鉀/THF(20重量％，141.8Kg溶液)，同時(shí)將溫度保持在24-28℃。將混合物于該溫度下攪拌0.5小時(shí)，此刻的HPLC表明反應(yīng)完成。將攪拌下的混合物冷卻至10℃±2℃，然后于40分鐘內(nèi)向該混合物中加入96.45Kg(滴定度1.15摩爾當(dāng)量)4-CBZ-哌啶酮的MTBE溶液，將反應(yīng)液的溫度保持在12℃±2℃。將混合物在該溫度下攪拌10分鐘，然后加熱至20℃±2℃并將該溫度下攪拌2小時(shí)。向攪拌的混合物中加入22.5Kg濃鹽酸在245.6Kg水中的溶液，同時(shí)將溫度保持在20℃±2℃；最終的pH為0.5。將混合物在攪拌下用214.0Kg甲基叔丁基醚萃取。停止攪拌，分液，棄除水層(下層)。將有機(jī)相用133.75Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離并棄除水[下]層)，然后用10.7Kg50％氫氧化鈉的126.8Kg水溶液洗滌(攪拌10分鐘，分液，分離并棄除有機(jī)[上]層)。將水層用2×123.05Kg乙酸乙酯萃取(攪拌5分鐘，分液，分離并棄除有機(jī)[上]層)。向攪拌的水溶液加入13.1Kg濃鹽酸至pH 2.5-3.5(最終2.82)。然后將混合物用123.05Kg乙酸乙酯萃取(攪拌5分鐘，分液，分離并棄除水[下]層)。將乙酸乙酯溶液用133.75Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離并棄除水[下]層)，然后分析(w/w)CBZ-PipBuen的含量(總重量194.86kg，17.05％CBZ-PipBuen[33.22kg，108mol]，87.9％化學(xué)計(jì)量收率)。
將PipBuen的乙酸乙酯溶液與6.6Kg 5％Pd/C(50％水，重量％)-起在攪拌下加入到不銹鋼壓力箱內(nèi)，然后將該混合物加熱至55℃±2℃。加入溶于66.4Kg水的甲酸鉀(38.2Kg)，同時(shí)將反應(yīng)混合物的溫度保持在55℃±2℃(約30分鐘)。將該混合物在55℃±2℃攪拌2小時(shí)，此刻反應(yīng)結(jié)束(HPLC)。向反應(yīng)器中加入6.6Kg硅藻土和33.2Kg水，將混合物攪拌，然后過濾。將反應(yīng)器用33.2Kg水沖洗(過濾，加入到主濾液中)。將濾液置于新的容器中，冷卻至20-25℃，分液，棄除有機(jī)層。將水層用52.1Kg濃鹽酸酸化至pH 2-3(最終2.82)，然后用4×129.5Kg二氯甲烷萃取(攪拌5分鐘，分液，棄除有機(jī)[下]層)。攪拌下加入17.85Kg 50％氫氧化鈉水溶液將水相調(diào)至pH 6.1。將混合物過濾得到224Kg含有17.6Kg(103mol)4-(3’-羧基丙基)哌啶的溶液。實(shí)施例8 CBZ-PipBu的制備將4-(3’-羧基丙基)哌啶在氫氧化鈉水溶液中的224Kg溶液與55.3Kg THF混合，然后將該混合物于攪拌下冷卻至8℃±2℃。加入NMM(20.9Kg)，同時(shí)保持溫度＜10℃。加料結(jié)束后，將溫度調(diào)至8℃±2℃，然后在1小時(shí)內(nèi)加入溶于49.8Kg THF的25.7Kg 1-(芐氧羰基)琥珀酰亞胺，同時(shí)將溫度保持在＜15℃。10-15℃下3小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束(分析HPLC)。加入濃鹽酸(29.9Kg)將pH調(diào)至2.5-3.5(最終3.3)，然后加入61.4Kg MTBE并將該混合物攪拌5分鐘。停止攪拌，分液，分出水(下)層(棄除)。將MTBE層用3×83.1Kg水洗滌(分別攪拌10分鐘、5分鐘和5分鐘)；每次均分出水層并棄除。在不攪拌的條件下，加入8.3Kg 50％氫氧化鈉在95.7Kg水中的溶液，加料結(jié)束后，將混合物攪拌約5分鐘。停止攪拌，分液，分出有機(jī)(上)層并棄除。將水層倒回反應(yīng)器中，用2×38.4Kg甲基叔丁基醚萃取(攪拌5分鐘，分液，棄除有機(jī)[上]層)。用18.5Kg甲基叔丁基醚重復(fù)該操作。將水層倒回反應(yīng)器中，用9.9Kg濃鹽酸酸化至pH2.5-3.5(最終3.37)。將混合物用76.4Kg甲基叔丁基醚萃取(攪拌5分鐘，分液，棄除下[水]層)。將有機(jī)層用1.1Kg碳酸氫鈉在12.4Kg水中的溶液洗滌(攪拌5分鐘，分液，棄除水[下]層)，然后用41.5Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，棄除水[下]層)。將反應(yīng)器置于減壓條件下并于55℃蒸除揮發(fā)性溶劑直至不再有餾出液流出。加入甲苯(32.4Kg)，將混合物常壓下蒸餾直至不再有餾出液流出，此刻的浴溫升至90-95℃。然后將混合物冷卻至30-35℃，向反應(yīng)器中加入庚烷(56.85Kg)(兩相)，將混合物加熱至90-95℃(一相)，然后再次冷卻至38-42℃。加入CBZ-PipBu晶種，產(chǎn)物在1小時(shí)內(nèi)從混合物中析出結(jié)晶。過濾收集固體，依次用19.35Kg 1∶2甲苯/庚烷和33.4Kg庚烷洗滌。將濾餅于40℃下真空干燥(干燥分析中有0.13％的損失)得到22.4Kg(72.96mol，以4-哌啶酮計(jì)，42％化學(xué)計(jì)量收率)CBZ-PipBu。實(shí)施例9 CBZ-PipBuen的制備14℃下，向82g 3-羧基丙基三苯基溴化鏻的407mL 1，2-二乙氧基乙烷懸浮液中于25分鐘內(nèi)加入220g 20％(重量)叔丁醇鉀的四氫呋喃溶液，同時(shí)保持反應(yīng)混合物的溫度在24-28℃。將混合物攪拌1小時(shí)，冷卻至10℃，然后在冷卻下于30分鐘內(nèi)加入52.5g 4-N-CBZ-哌啶酮的246mL甲基叔丁基醚溶液。加料結(jié)束后，將混合物于12℃攪拌10分鐘，然后升溫至20℃并攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物用410mLlN鹽酸處理10分鐘，用328mL甲基叔丁基醚稀釋，然后分液。將有機(jī)相用205mL水洗滌，然后用210mL1N氫氧化鈉水溶液洗滌。分出含有產(chǎn)物的氫氧化鈉層，用3×189g乙酸乙酯洗滌，用濃鹽酸酸化至pH 3.48，然后用189mL乙酸乙酯萃取。分出乙酸乙酯層，用211mL水洗滌，然后用10g硫酸鎂干燥30分鐘，過濾，真空濃縮。將油狀殘余物(50.7g)用甲苯/庚烷結(jié)晶得到29.46g CBZ-PipBuen(50.9％收率，約95A％純)。質(zhì)譜M計(jì)算值303，M＋1觀測值3041H NMR(δvs TMS，CDCl3)2.2，t(2H)；2.25，t(2H)；2.35，m(4H)；3.45，m(4H)，5.15，s(2H)；5.2，m(1H)；7.33，2(5H)。13C NMR(δvs TMS，CDCl3)22.43，28.2，34.26，35.66，44.88，45.74，67.20，122.02，127.83，127.95，128.45，128.69，128.90，136.17，136.72，155.34，178.39實(shí)施例10 CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的制備(反應(yīng)路線II的另一種步驟4)將CBZ-PipBuen(70g，0.23mol)和DMF(230mL)加入到1升帶夾套的燒瓶中，攪拌下冷卻至0℃，然后立即加入TBTU(74.9g，0.23mmol)。將溫度保持在0℃，開始加入DIPEA(61.9g，0.61mol)。45分鐘后，加入TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(138.7g，0.24mol)的DMF(230mL)溶液。加入DIPEA(45mL)將pH調(diào)至7-8并將混合物升溫至室溫。2小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束(HPLC分析)。在水(2.5升)中終止反應(yīng)并用乙酸乙酯(1升)萃取。將水相用乙酸乙酯(0.3升)萃取。合并有機(jī)層，依次用檸檬酸水溶液(5％w/w，2×1升)、碳酸氫鈉水溶液(5％w/w，2×1升)和水(2升)洗滌。將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移至2升燒瓶中，于攪拌下加入庚烷(500mL)以引發(fā)結(jié)晶。在Buchner漏斗上抽濾收集固體，用乙酸乙酯/庚烷(2∶1 v/v，1升)洗滌并干燥至恒重得到CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(143.2g，0.19mol，83％收率)。元素分析C41H55N5O7C計(jì)算值66.02實(shí)測值65.53，H，N。質(zhì)譜M計(jì)算值745.91；M＋1觀測值7461H NMR(δvs TMS，CDCl3)0.86qd(1H)；0.98，qd(1H)；1.16，t(2H)，1.24，dt(6H)；1.37，m(1H)；1.64-1.78，m(4H)；1.86，qd(1H)；2.2bd(4H)；2.35，m(1H)；2.4，m(2H)；2.74，dd(1H)；3.07，m(4H)；3.52，d，(1H)；3.85，d(1H)；4.12，q(1H)；4.49，qd(1H)；4.68，dt(1H)；5.07，d(1H)；5.14，s(1H)；5.16，d(1H)；5.22，t(2H)；6.45，s(1H)；7.28，d(1H)；7.26，s(5H)；7.35，s(5H)；7.56，d(1H)13C NMR(δvs TMS，CDCl3)14.15，22.68，24.95，25.61，26.03，26.45，28.20，31.71，32.89，33.80，33.89，34.00，35.63，38.37，44.79，45.13，45.65，50.23，51.34，60.40，66.87，67.06，76.50，77.13，77.77，122.46，126.88，127.80-128.60，135.15，155.19，170.11，170.20，171.61，173.76，175.35.實(shí)施例11 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式的制備(反應(yīng)路線II的另一種步驟5)將CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(140g，0.19mol)、甲酸銨(61g，0.96mol)和10％Pd/C(含50％水，degussa型，28g)加入到5升帶夾套的燒瓶中。加入乙醇(200標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度，1260mL)、異丙醇(70mL)和水(去離子水，70g)。將混合物加熱至40-50℃，攪拌至HPLC表明反應(yīng)結(jié)束(5小時(shí))。將混合物冷卻至升溫，濾除催化劑。將得到的溶液加熱至40-50℃并加入丙酮(約與濾液等體積)，將溶液冷卻至35-40℃。向混合物中加入N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的晶種，在冷卻至室溫的同時(shí)(數(shù)小時(shí))，從其中析出N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕形式的結(jié)晶。在氮?dú)夥障?，用Buchner漏斗抽濾收集固體，將濾餅用丙酮洗滌并晾干至恒重得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺(84.3g，0.16mol，84.8％收率，＞95A％)。實(shí)施例12 TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的連鎖制備(反應(yīng)路線II的另一種步驟1-3)向裝有溫度計(jì)的500mL燒瓶中加入BOC-N(Et)Gly(20.3g，0.1mol)、N-羥基琥珀酰亞胺(11.5g，0.1mol)和二氯甲烷(200mL)。將混合物以適當(dāng)?shù)乃俣葦嚢璨⑾蛐纬傻娜芤褐幸淮涡约尤隓CC(20.6g，0.1mol)固體。將該溶液攪拌1小時(shí)，在此期間內(nèi)觀察到輕微的放熱(溫度從20℃升至28℃)和DCU沉淀。將形成的懸浮液用裝有1號Whatman濾紙的Buchner漏斗真空過濾。將濾餅用二氯甲烷(2×25mL)洗滌。將濾液倒回最初的500mL燒瓶內(nèi)，然后依次加入(L)Asp(OBzl)(22.3g，0.1mol)、NMM(33.8ml，0.3mol)和DMF(80g，1.01mol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，形成BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)的反應(yīng)結(jié)束(HPLC監(jiān)測)。將反應(yīng)混合物倒入含有冰水(100mL)的萃取漏斗中。將混合物用鹽酸(36％，25mL)酸化至pH 1.分層，將二氯甲烷層用冰水(100mL)洗滌并分液(水相pH 3-4)。將二氯甲烷層倒回最初的500mL燒瓶內(nèi)，然后依次以固體形式一次性加入NH2-(L)-Cha-NH2(17g，0.1mol)、N-羥基琥珀酰亞胺(11.5g，0.1mol)和DCC(20.6g，0.1mol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，形成BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的反應(yīng)結(jié)束(HPLC監(jiān)測)，用裝有1號Whatman濾紙的Buchner漏斗真空濾除DCU。將濾餅用二氯甲烷(2×25mL)洗滌。將濾液轉(zhuǎn)移到萃取漏斗中并用含有N-甲基嗎啉(15mL，pH 8-9)的去離子水(200mL)洗滌。分液并將二氯甲烷層再次用水(去離子水，2×150mL)洗滌。將二氯甲烷層用150mLlN鹽酸洗滌(pH 1)洗滌。分液并將二氯甲烷層用去離子水洗滌(200mL，pH3)。將BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的二氯甲烷溶液倒回干凈的500mL燒瓶中，然后加入TFA(100mL)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，形成TFA·HN(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-(L)-Cha-NH2的反應(yīng)結(jié)束(HPLC監(jiān)測)。將反應(yīng)混合物真空蒸餾除去二氯甲烷和大部分TFA，然后加入MTBE(500mL)和晶種以引發(fā)產(chǎn)物結(jié)晶。將混合物用裝有1號Whatman濾紙的Buchner漏斗真空過濾。將濾餅用MTBE(2×25mL)洗滌并晾干得到白色固體狀TFA·HN(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-(L)-Cha-NH2(46.8g，81.5％收率)(＞97A％純，＜0.2A％D-Asp非對映異構(gòu)體)。實(shí)施例13 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的穩(wěn)定的不吸濕結(jié)晶形式的制備方法A靜態(tài)轉(zhuǎn)變將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式(7.45Kg)用錘式磨研磨。將得到的7.35Kg固體置于不銹鋼干燥器托盤內(nèi)(90×28cm)并將該托盤用穿孔的鋁箔覆蓋。然后將托盤密封在濕度烘箱內(nèi)(LUNAIRE Humidity Cabinet CEO 941W-3型)；除了取樣用于分析外，將烘箱在整個(gè)形式轉(zhuǎn)變過程中保持密封。將烘箱調(diào)至40％RH和60℃并在該水平保持1小時(shí)。然后將濕度烘箱調(diào)至80％RH/60℃并在該水平保持12小時(shí)。在80％RH/60℃下18小時(shí)后，取樣并通過X-射線粉末衍射分析進(jìn)行檢測，以分析向N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕結(jié)晶形式的轉(zhuǎn)變。將濕度烘箱再次密封并調(diào)至40％RH/60℃，保持2小時(shí)。將烘箱調(diào)至周圍環(huán)境條件，然后從烘箱中取出托盤得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕結(jié)晶形式(7.2Kg，96.6％收率)。通過X-射線粉末衍射圖(圖1)證實(shí)轉(zhuǎn)變。還將X-射線粉末衍射以用單位埃(A)表示的晶體平面內(nèi)距離(d)、每秒計(jì)數(shù)(Cps)和相對峰強(qiáng)度(％)按衍射角(2θ)增加的順序制成表(表1)。表1-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.06517.4314 86.00 5.822 6.32313.9672 248.0016.783 7.51811.7489 221.0014.954 8.16310.8222 496.0033.565 8.78010.0633 155.0010.496 10.383 8.5125218.0014.757 11.351 7.7886112.007.588 12.596 7.0218999.0067.599 13.858 6.3852316.0021.381015.191 5.82741338.00 90.531116.476 5.3759481.0032.541216.745 5.2901556.0037.621317.980 4.9294679.0045.951418.572 4.77351079.00 73.001518.799 4.71651230.00 83.221619.147 4.63151229.00 83.151719.619 4.52111380.00 93.371820.200 4.39241246.00 84.301920.466 4.33601478.00 100.002020.870 4.25281088.00 73.612121.625 4.1061584.0039.512222.088 4.0210891.0060.282322.840 3.8903613.0041.472423.947 3.7129597.0040.392524.569 3.6203680.0046.012625.608 3.4757506.0034.242727.015 3.29781100.00 74.422827.837 3.2022420.0028.422927.967 3.1877400.0027.063029.255 3.0502536.0036.273129.689 3.0066603.0040.803230.665 2.9130518.0035.053331.318 2.8538451.0030.513431.894 2.8036533.0036.063533.370 2.6829518.0035.053633.562 2.6679552.0037.353733.919 2.6407581.0039.313834.840 2.5730561.0037.963935.789 2.5069559.0037.824035.940 2.4967560.0037.894136.780 2.4416740.0050.074237.042 2.4249736.0049.804337.959 2.3684683.0046.214439.017 2.3066643.0043.50方法B動態(tài)轉(zhuǎn)變a.形式轉(zhuǎn)變將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式(50g)置于位于環(huán)狀支架上的帶有機(jī)械攪拌器的400mL量筒內(nèi)(高度6cm)。將該裝置置于溫度控制烘箱(LUNAIRE Humidity Cabinet CEO 941W-3型)內(nèi)。將攪拌設(shè)置在275rpm，將溫度和RH在30分鐘內(nèi)分別調(diào)至60℃和40％。將化合物在該條件下保持1小時(shí)，然后將條件在45分鐘內(nèi)改變至80％RH/60℃。將化合物在該條件下保持16小時(shí)，然后將烘箱重新設(shè)置為40％RH/60℃并保持3.25小時(shí)。然后將化合物恢復(fù)至周圍環(huán)境條件(床高4cm)，從量筒內(nèi)取出得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕結(jié)晶形式(收率＞95％)。通過X-射線粉末衍射分析(圖2)證實(shí)轉(zhuǎn)變。還將X-射線粉末衍射以用單位埃(A)表示的晶體平面內(nèi)距離(d)、每秒計(jì)數(shù)(Cps)和相對峰強(qiáng)度(％)按衍射角(2θ)增加的順序制成表(表2)。表2-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---15.186 17.0268 196.008.4326.371 13.8615 722.0031.0737.570 11.6689 516.0022.2048.232 10.7323 1094.00 47.0758.817 10.0206 257.0011.06610.4288.4761365.0015.71711.3777.7714129.005.55811.6007.6223117.005.55912.6676.98281805.00 77.6710 13.9136.3599551.0023.7111 14.3986.1468178.007.6612 15.2265.844 2285.00 98.3213 16.5385.3557861.0037.0514 16.7735.2814929.0039.9715 18.0194.91901132.00 48.7116 18.6724.74831871.00 80.5117 18.8154.71252052.00 88.3018 19.2044.61782071.00 89.111919.6544.51322226.0095.782020.2374.38451939.0083.432120.5234.32402324.00100.002220.9344.24001656.0071.262321.6914.0938923.00 39.722422.1434.01121411.0060.712522.9103.8786994.00 42.772624.0073.7037964.00 41.482724.6423.6097991.00 42.642825.6423.6097991.00 42.642927.0703.29131687.0072.593(27.8553.2002688.00 29.603129.4973.0258843.00 36.273229.4973.0013878.00 37.783330.7512.9051809.00 34.813431.9162.8017821.00 35.333533.9822.6360882.00 37.953635.2002.5475865.00 37.223736.0012.4926841.00 36.193836.9272.43221106.0047.593938.3892.3429968.00 41.65b.形式轉(zhuǎn)變將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式(370g)加入到2L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶內(nèi)。將該燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph UV2002)上并降至預(yù)先加熱(58℃)的水浴(Heidolph MR 2002)中。用真空泵(Divatrion DV1)將該裝置置于60毫巴的真空下，然后以控制的方式通入在另一個(gè)加熱的含水燒瓶內(nèi)產(chǎn)生的潮濕空氣打破真空。通過濕度控制裝置(Vausalo Humiditique and TemperatureTraumettor)控制溫空氣的通入，以便在裝置內(nèi)得到79％的RH(130-180毫巴的內(nèi)壓)。然后將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以145-160轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)5小時(shí)，同時(shí)將加熱浴保持在約60℃并將容器內(nèi)的RH保持在71-79％。然后用氮?dú)獯蚱普婵?，將容器及其?nèi)容物冷卻至室溫，取出產(chǎn)物得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕結(jié)晶形式。將第2批317g N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)已基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式按照同樣方式進(jìn)行處理得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕結(jié)晶形式。通過X-射線粉末衍射分析(圖3)證實(shí)轉(zhuǎn)變。兩次共得到667g N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的不吸濕結(jié)晶形式(97％總收率)。通過X-射線粉末衍射分析(圖3)證實(shí)轉(zhuǎn)變。還將X-射線粉末衍射以用單位埃(A)表示的晶體平面內(nèi)距離(d)、每秒計(jì)數(shù)(Cps)和相對峰強(qiáng)度(％)按衍射角(2θ)增加的順序制成表(表3)。表3-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.12417.2309 180.0010.172 6.32813.9565 408.0023.053 7.57411.6623 305.0017.234 8.19110.7851 556.0031.415 8.79710.0432 166.009.386 10.398 8.5004244.0013.797 12.628 7.00401198.00 67.688 13.871 6.3791353.0019.949 15.218 5.81721543.00 87.181015.723 5.6317187.0010.561116.538 5.3558589.0033.281216.751 5.2882621.0035.081318.024 4.9175869.0049.101418.640 4.75631156.00 65.311518.809 4.71411241.00 70.111619.191 4.62101521.00 85.931719.659 4.51201413.00 79.831820.865 4.40641303.00 73.621921.495 4.32991770.00 100.002020.865 4.25391120.00 63.282121.616 4.1077683.0038.592222.113 4.0166919.0051.922322.950 3.8719697.0039.382424.117 3.6871659.0037.232524.618 3.6132716.0040.452625.644 3.4709662.0037.402726.297 3.3862486.0027.462827.052 3.29341270.00 71.752927.960 3.1885518.0029.273029.640 3.0115705.100 39.383130.744 2.9058695.0039.273233.465 2.6755697.0039.383333.840 2.6467764.0043.163435.812 2.5053736.0041.583536.811 2.4396858.0048.473637.076 2.4228919.0051.923738.185 2.3549870 49.153839.622 2.2728882.0049.83實(shí)施例14 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶形式及其轉(zhuǎn)變的不吸濕結(jié)晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖取實(shí)施例5或11制得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性結(jié)晶樣品，及其按照實(shí)施例13的方法轉(zhuǎn)變的相應(yīng)不吸濕的結(jié)晶形式的樣品。吸濕性結(jié)晶形式和不吸濕結(jié)晶形式的X-射線粉末衍射圖分別如圖4和5所示。還將吸濕性結(jié)晶形式和不吸濕結(jié)晶形式的X-射線粉末衍射以對用單位埃(A)表示的晶體平面內(nèi)距離(d)、每秒計(jì)數(shù)(Cps)和相對峰強(qiáng)度(％)按衍射角(2θ)增加的順序制成表(分別參見表4和表5)。表4-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.073 17.4037 1487.00 86.502 6.451 13.6905 447.0026.003 7.837 11.2712 411.0023.914 8.491 10.4049 602.0035.025 9.699 9.111993.00 5.416 10.4888.4278421.0024.497 11.5707.642392.00 5.358 12.5507.0474411.0023.919 13.5766.5168760.0044.211015.3275.7763606.0035.251115.7905.6080456.0026.531216.1795.4739346.0020.131316.7705.2824938.0054.571417.0855.1856685.0039.851517.7504.9927924.0053.751618.1514.8835741.0043.111718.5044.7909593.0034.501819.3234.5897930.0054.101919.7144.4996792.0046.072020.5454.31941719.00 100.002121.3884.1510897.0052.182222.3813.9691373.0021.702322.8703.8852258.0015.012423.6403.7604563.0032.752523.8413.7292680.0039.562624.0483.6976623.0036.242724.7463.5949338.0019.662825.2003.5311366.0021.292925.7923.4513590.0034.323026.2663.3901731.0042.523126.9593.3045555.0032.293227.4263.2494769.0044.743327.9673.1876528.0030.723429.0203.0744771.0044.853529.9222.9837491.0028.563630.9702.8851384.0022.343731.5522.8332510.0029.673833.3382.6854627.0036.473934.8382.5731520.0030.254035.8732.5012653.0037.994136.1072.4855639.0037.174237.1622.4174683.0039.734338.5092.3359775.0045.084439.7012.2684784.0045.61表5-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.152 17.1371 123.007.342 6.386 13.8287 483.0028.843 7.580 11.6540 389.0023.224 8.225 10.7410 752.0044.905 8.801 10.0390 180.0010.756 10.4088.4928276.0016.487 12.6606.98631399.00 83.528 13.9146.3594391.0023.349 15.2515.80471675.00 100.001016.5415.3548608.0036.301116.7715.2818652.0038.931218.0474.9112775.0046.271318.6764.74721078.00 64.361418.9024.69101099.00 65.611519.1824.62311151.00 68.721619.6974.50351164.00 69.491720.2404.38381049.00 62.631820.5684.31471403.00 83.761929.9334.24031024.00 61.1 32021.6844.0951569.0033.972122.1224.0150746.0044.542222.9703.8685564.0033.672324.0803.6927546.0032.602424.2183.6720556.0033.192524.6943.6023618.0036.902625.6803.4662510.0030.452726.4003.3732403.0024.062827.1053.28711093.00 65.252927.9293.1920450.0026.873029.3603.0395555.0033.133129.7243.0031595.0035.523230.3402.9435429.0025.613330.6932.9105552.0032.963431.3532.8507476.0028.423531.8222.8098531.0031.703632.0062.7940545.0032.543732.8852.7213485.0028.963833.5082.6722547.0032.663934.0402.6316606.0036.1 84034.8392.57305 80.00 34.634135.9982.4928596.0035.584236.6802.4480629.0037.554336.9482.4309727.0043.404437.1972.4152703.0041.974539.6022.2739697.0041.61實(shí)施例15 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性和不吸濕的結(jié)晶形式的等溫微量量熱實(shí)驗(yàn)用ThermometricThermal Activity Monitor(TAM)對N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性和不吸濕的結(jié)晶形式進(jìn)行等溫微量量熱實(shí)驗(yàn)。通過將不同的結(jié)晶形式在不同溫度下暴露于不同的濕度或溶劑蒸氣中來研究所述結(jié)晶形式的固態(tài)轉(zhuǎn)變。使用如下鹽溶液來形成不同的濕度KCl(80％RH)，NaCl(75％RH)和NaBr(65％RH)。稱取約100mg各種結(jié)晶形式的化合物置于TAM玻璃安瓿內(nèi)并將含有飽和鹽溶液(含有過量的固體)或有機(jī)溶劑的微恒濕器置于安瓿內(nèi)。將安瓿密封，使其與環(huán)境溫度平衡，然后降至TAM的測量位置。將用洗滌過的海沙代替了待測試樣品的相同系統(tǒng)置于參考側(cè)。測定輸出功率(μW)隨時(shí)間的變化(圖6-8)。實(shí)施例16 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁酰基)-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性和不吸濕的結(jié)晶形式的吸濕等溫線在VTI MB300G濕度天平上測定N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨酰]-(L)-β-環(huán)己基丙氨酰胺的吸濕性和不吸濕的結(jié)晶形式的吸濕等溫線。實(shí)驗(yàn)可按照兩種方式進(jìn)行，一種是對約15mg的待測結(jié)晶形式進(jìn)行增加和降低％RH的步驟并測定(在每一平衡步驟)重量增加隨％RH的變化(圖9)，另一種是將待測結(jié)晶形式置于恒定的濕度下并測定重量增加隨時(shí)間的變化。
式II化合物顯示出有價(jià)值的藥理活性，因此可摻入藥物組合物中并用于對患有特定疾病的患者進(jìn)行治療。
本發(fā)明還涉及對患有可通過施用血小板凝集抑制劑通過抑制纖維蛋白原與激活的血小板和血小板凝集和血液凝固中涉及的其它粘著糖蛋白結(jié)合而得到緩解或預(yù)防之疾病的患者進(jìn)行治療的方法。此外，本發(fā)明還涉及用于在人和其它哺乳動物中預(yù)防或治療與心肌梗塞、中風(fēng)、外周動脈疾病和彌散性血管內(nèi)凝血等疾病有關(guān)的血栓形成的方法。
本文所指的治療應(yīng)理解為包括預(yù)防性治療以及對已確定的疾病進(jìn)行治療。
本發(fā)明還包括含有藥物可接受量的至少一種式I化合物以及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
實(shí)踐中，用于治療的本發(fā)明化合物或組合物可以通過任何適宜的方式，例如局部、吸入、胃腸外、直腸或口服給藥，但優(yōu)選通過口服給藥。
式II化合物可以以允許通過最佳途徑進(jìn)行給藥的形式提供，并且本發(fā)明還涉及適用于人或獸醫(yī)的含有至少一種本發(fā)明化合物的藥物合物。這些組合物可以根據(jù)常規(guī)方法，用一種或多種可藥用輔劑或賦形劑制得。所述輔劑包括，稀釋劑、無菌含水介質(zhì)和各種無毒的有機(jī)溶劑。所述組合物可以呈片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑、粉劑、水溶液或混懸液、可注射溶液、酏劑、糖漿等形式，并且可以含有一種或多種選自甜味劑、矯味劑、著色劑、穩(wěn)定劑或防腐劑的試劑以得到可藥用的制劑。
對于載體以及載體中活性成分含量的選擇通常根據(jù)產(chǎn)物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、具體的給藥方式和藥物實(shí)踐中需要注意的條件來決定。例如，可將賦形劑如乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鈣和崩解劑如淀粉、藻酸和某些復(fù)合硅膠及潤滑劑如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石用于制備片劑。為了制備膠囊，優(yōu)選使用乳糖和高分子量的聚乙二醇。當(dāng)使用含水混懸液時(shí)，其可含有乳化劑或有助于懸浮的試劑。還可使用稀釋劑如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或它們的組合。
為了進(jìn)行胃腸外給藥，可以使用本發(fā)明化合物在植物油如蓖麻油、花生油或橄欖油或水-有機(jī)溶液如水和丙二醇、可注射有機(jī)酯如油酸乙酯以及可藥用鹽的無菌水溶液中的乳液、混懸液或溶液。還可用本發(fā)明產(chǎn)物的鹽溶液通過肌肉內(nèi)或皮下注射進(jìn)行給藥。水溶液，包括鹽在純凈蒸餾水中的溶液還可用于靜脈內(nèi)給藥，條件是對其pH值進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)、進(jìn)行了正確地緩沖并用足夠量的葡萄糖或氯化鈉使其等滲，并且通過加熱、輻射和/或微孔過濾對其進(jìn)行了滅菌。
局部給藥時(shí)，可以使用含有本發(fā)明化合物的凝膠(水或醇基質(zhì)的)、霜劑或軟膏。還可將本發(fā)明化合物摻入凝膠或貼劑的基質(zhì)中，從而可以透過皮膚屏障控釋化合物。
用于直腸給藥的固體組合物包括根據(jù)已知方法配制的含有至少一種式II化合物的栓劑。
本發(fā)明組合物中活性成分的百分含量可以改變，條件是其應(yīng)構(gòu)成適宜劑量的一定份額。顯然，可以在大概同一時(shí)間施用多個(gè)單位劑量形式。所采用的劑量可由醫(yī)生或有資格的醫(yī)務(wù)工作者確定，并取決于所需的治療效果、給藥途徑和治療的持續(xù)時(shí)間，以及患者的病情。完成本發(fā)明方法的劑量方案是，先是確保最大治療反應(yīng)的劑量直至病情得到改善，然后用可以緩解病情的最低有效量。通常，口服劑量可以從約0.1mg/kg至約100mg/kg，優(yōu)選從約0.1mg/kg至約20mg/kg，首選從約1mg/kg至約20mg/kg，靜脈內(nèi)劑量為約0.1μg/kg至約100μg/kg，優(yōu)選從約0.1mg/kg至約50mg/kg。對于各具體情況，劑量根據(jù)待治療患者的具體因素如年齡、體重、一般健康情況和可以影響本發(fā)明化合物效果的其它特點(diǎn)來確定。
此外，還可將式II化合物按照所需的頻率進(jìn)行給藥以得到所需的治療效果。某些患者可能對較高或較低的劑量迅速反應(yīng)，可能僅需非常小的維持劑量。對于其他患者，根據(jù)具體患者的生理需要，可能需要以1-4次口服劑量/天、優(yōu)選每天1-2次進(jìn)行長期治療。當(dāng)然，對于其他患者，可能需要醫(yī)囑每天不超過一或兩次劑量。
當(dāng)根據(jù)文獻(xiàn)中的記載進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，式II化合物顯示出顯著的藥理學(xué)活性，相信這些試驗(yàn)結(jié)果與在人和其它哺乳動物中的藥理學(xué)活性相關(guān)聯(lián)。以下體外和體內(nèi)藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果是式II化合物的特典型結(jié)果。
以下藥理學(xué)試驗(yàn)評估式II化合物對于纖維蛋白原介導(dǎo)的血小板凝集、纖維蛋白原與凝血酶激活的血小板結(jié)合的抑制活性，以及對ADP誘導(dǎo)的離體血小板凝集的抑制作用，這些試驗(yàn)的結(jié)果與式II化合物的體內(nèi)抑制特性相關(guān)聯(lián)。
血小板凝集試驗(yàn)是基于“血液”，66(4)，946-952(1985)中的描述。纖維蛋白原結(jié)合試驗(yàn)是基于Ruggeri，Z.M.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，83，5708-5712(1986)和Plow，E.F等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，82，8057-8061(1985)。對ADP-誘導(dǎo)的離體血小板凝集的抑制作用試驗(yàn)是基于Zucker，“通過光電方法測定的血小板凝集”，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，169，117-133(1989)。血小板凝集試驗(yàn)制備固定的活化血小板用Magueie.G.A等，生物化學(xué)雜志，254，5357-5363(1979)和Rggeri，Z.M.等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)72，1-12(1983)所述的凝膠過濾技術(shù)，從人血小板濃縮物中分離血小板。將血小板以2×108細(xì)胞/mL的濃度懸浮在改性的無鈣Tyrode氏緩沖液中，該緩沖液含有127mM氯化鈉，2mM氯化鎂，0.42mM Na2HPO4，11.9mM NaHCO3，2.9mM KCl，5.5mM葡萄糖，pH為7.35的10mMHEPES，和0.35％人血清白蛋白(HSA)。通過加入終濃度為2單位/mL的人a-凝血酶，然后加入濃度為40μM的凝血酶抑制劑I-2581來激活這些洗滌過的血小板。向激活的血小板中加入低聚甲醛至終濃度為0.50％，然后將其在室溫保溫30分鐘。然后通過以650xg離心15分鐘來收集固定的活化血小板。用上述Tyrode氏-0.35％HSA緩沖液將血小板沉淀洗滌4次，然后用相同的緩沖液重懸至2×108細(xì)胞/mL的濃度。血小板凝集試驗(yàn)將固定的活化血小板與所選劑量的待測化合物一起保溫，以檢測1分鐘的血小板凝集抑制作用以及加入終濃度為250μg/ml的人纖維蛋白原而引發(fā)的凝集作用。用血小板凝集繪圖儀PAP-4記錄血小板凝集作用。將凝集作用的抑制程度表示為不存在抑制劑的情況下所觀察到的凝集率的百分比。然后計(jì)算每種化合物的IC50，即將凝集率降低50％所需的抑制劑的量(參見例如Plow，E.F.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，82，8057-8061(1985))。纖維蛋白原結(jié)合試驗(yàn)用Walsh，P.N.等，Br.J.Haematol.281-296(1977)所述的，Trapani-Lombardo，V.等改進(jìn)的白蛋白密度梯度技術(shù)(臨床研究雜志76，1950-1958(1985))，從血小板中洗去血漿組分。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將改性的Tyrode氏緩沖液(Rggeri，Z.M.等，臨床研究雜志，72，1-12(1983))中的血小板混合物用人a-凝血酶在22-25℃刺激10分鐘(3.125×1011血小板/升和凝血酶為0.1 NIH單位/mL)。然后將25倍過量(單位/單位)的水蛭素在加入125I-標(biāo)記的纖維蛋白原和待測化合物前5分鐘加入。加入所有這些物質(zhì)后，混合物中最終的血小板計(jì)數(shù)為1x1011/L。繼續(xù)在22-25℃保溫30分鐘后，通過將50μL混合物在300μL 20％蔗糖溶液中以12000xg離心4分鐘使結(jié)合的和游離的配體分離。然后將血小板沉積物與混合物的其余部分分離以測定血小板結(jié)合的放射性。在含有過量未標(biāo)記配體的混合物中測定非特異性結(jié)合。當(dāng)通過Scatchard分析法對結(jié)合曲線進(jìn)行分析時(shí)，利用計(jì)算機(jī)程序從結(jié)合等溫線中以擬合參數(shù)的形式得到非特異性結(jié)合(Musson.P.J.酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)92，542-576(1983))。為了測定各化合物抑制50％纖維蛋白原與凝血酶激活的血小板結(jié)合所需的濃度(IC50)，對各化合物試驗(yàn)6個(gè)或更多的濃度，125I-標(biāo)記的纖維蛋白原保持在0.176μmol/L(60μg/mL)。將殘余的纖維蛋白原結(jié)合對樣品化合物濃度的對數(shù)繪制曲線求得IC50。對ADP-誘導(dǎo)的離體血小板凝集的抑制實(shí)驗(yàn)方法在向體重為10-20kg的雜種狗施用試驗(yàn)化合物5-10分鐘之前取對照血液樣品。將化合物通過水飼管胃內(nèi)給藥，或通過明膠膠囊口服給藥。給藥后，以30分鐘的間隔取血樣(5mL)3小時(shí)，然后在6、12和24小時(shí)取樣。通過靜脈穿刺頭部靜脈獲得各血液樣品并直接收集在含有3.8％檸檬酸三鈉的塑料注射器內(nèi)，檸檬酸三鈉的量為每9份血液1份檸檬酸三鈉。離體犬血小板凝集將血液樣品以1000rpm離心10分鐘以得到血小板富集的血漿(PRP)。取出PRP后，將樣品以2000rpm繼續(xù)離心10分鐘得到血小板較少的血漿(PPP)。用Coulter計(jì)數(shù)器(Coulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)L)對PRP中的血小板計(jì)數(shù)。如果PRP中血小板的濃度大于300000血小板/μL，則將PRP用PPP稀釋將血小板計(jì)數(shù)調(diào)整到300000血小板/μL。然后將PRP的等分液(250μL)置于石英玻璃比色杯(7.25×55mm，Bio/Data Corp.Horsham，PA)中。然后向PRP中加入腎上腺素(最終濃度為lμM)，將其于37℃保溫1分鐘。然后向PRP中以10μM的最終濃度加入血小板凝集刺激物，ADP。用光透射集合度計(jì)(Bio/Data Platelet Aggregation Profiler，PAP-4型，Bio/Data Corp.Horsham，PA)通過分光光度法監(jiān)測血小板的凝集。為了測定化合物，一式兩份記錄透光率和最大透光率(最大凝集)的改變率(斜率)。以與從對照PRP得到的數(shù)據(jù)相比，斜率或最大凝集的減少百分比(平均值±SEM)報(bào)道血小板凝集數(shù)據(jù)，所述對照PRP是從在施用試驗(yàn)化合物前得到的血液樣品制得的。
式II化合物在前述試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的活性，被認(rèn)為可用于預(yù)防和治療與某些疾病有關(guān)的血栓形成。由離體犬血小板凝集試驗(yàn)中的抗血栓形成活性可以預(yù)測到其在人中的活性(參見，例如Catalfamo，J.L.和Dodds，W.Jean，“從實(shí)驗(yàn)室動物中分離血小板”，酶學(xué)方法，169，A部分，27(1989))。通過以上方法對式II化合物進(jìn)行的試驗(yàn)所得到的結(jié)果列于下表6中。在該表中還給出了4-4(哌啶基)丁?；拾滨Ｌ於滨Ｉ彼帷⒓礆W洲專利申請公開說明書0479481中公開的化合物的對比試驗(yàn)結(jié)果。表6固定化血小板凝劑量ADP誘導(dǎo)的離體血小板凝集的抑制作用化合物 集的抑制作用(mg/kg)口服給藥后離體血小板凝集的％抑制作(IC50，μM) 用1h3h 6h 12h 24h實(shí)施例15 0.097 5100 100 100 9850EPA’481的化合物 0.047 553＜20本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，本發(fā)明可以很好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的并達(dá)到所述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文所述的化合物、組合物和方法是優(yōu)選實(shí)施方案的代表，或是用于舉例說明，而并非想要對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。
權(quán)利要求
1. 化合物N-(N-叔丁氧羰基-N-乙基甘氨?；?-(L)-天冬氨酸β-芐酯。
2. 化合物N-[N-[N-[4-[N-芐氧基羰基哌啶-4-基]丁酰基-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨?；?芐基酯]-(L)-β-環(huán)己基-丙氨酰胺。
3. 化合物4-(哌啶-4-叉)丁酸。
4. 化合物N-[N-[N-[3-[N-芐氧基羰基-4-哌啶基]亞丙基羰基]-N-乙基甘氨酰基]-(L)-天冬氨?；?芐基酯]-(L)-β-環(huán)己基-丙氨酰胺。
5. 不吸濕結(jié)晶形式的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨?；鵠-(L)-β-環(huán)己基-丙氨酰胺化合物或其可藥用鹽。
6. 一種藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1的化合物以及可藥用載體。
7. 制備不吸濕結(jié)晶形式N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨?；鵠-(L)-β-環(huán)己基-丙氨酰胺的方法，該方法包括將吸濕性結(jié)晶形式N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁?；?-N-乙基甘氨?；鵠-(L)-天冬氨?；鵠-(L)-β-環(huán)己基-丙氨酰胺在大約20℃至大約80℃下暴露在大約40％-100％相對濕度中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述暴露是在大約65％-大約80％相對濕度下進(jìn)行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述暴露是在大約40℃-大約80℃下進(jìn)行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述暴露是在靜態(tài)條件下進(jìn)行。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述暴露是在動態(tài)條件下進(jìn)行。
12. 制備下式鹽化合物的方法
其中B代表烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基，或烷基芳烷基；E1代表H；E2代表天然α-氨基酸的-碳側(cè)鏈，H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，雜環(huán)基烷基，取代的雜環(huán)基烷基，或者E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子一起形成4-、5-、6-、或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)；G代表OR1或NR1R2；R1和R2獨(dú)立地代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷基芳基或烷基芳烷基；p代表1-4；和P1代表酸保護(hù)基，該方法包括偶聯(lián)下述兩式化合物
其中P2代表對酸不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基，形成下式第一中間體化合物
然后將下式化合物
偶聯(lián)到第一中間體化合物上，形成下式第二中間體化合物
接著用三氟乙酸除去第二中間體化合物的P2保護(hù)基，得到所要的鹽化合物。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中P1為對氫化不穩(wěn)定的酸保護(hù)基。
14. 下式化合物
其中P3代表氨基保護(hù)基；B代表烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基，或烷基芳烷基；P1代表酸保護(hù)基；E1代表H；E2代表天然α-氨基酸的α-碳側(cè)鏈，H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，雜環(huán)基烷基，取代的雜環(huán)基烷基，或者E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子一起形成4-、5-、6-、或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)；G代表OR1或NR1R2；R1和R2獨(dú)立地代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷基芳基，或烷基芳烷基；和p代表1-4。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，其中P1代表對氫化不穩(wěn)定的酸保護(hù)基，且P3代表對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的化合物，其中B代表烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基或烷基芳烷基；E1代表H；E2代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基或取代芳烷基；L代表OR1或NR1R2；R1和R2獨(dú)立地代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基或烷基芳烷基；和p代表1或2。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的化合物，其中B代表烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基；和E2代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中B代表烷基；E2代表烷基，環(huán)烷基或環(huán)烷基烷基；R1和R2獨(dú)立地代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基烷基；和p代表1。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中P3代表芐氧基羰基；B代表乙基；P1代表芐基；E2代表環(huán)己基甲基；和G代表NH2。
20. 制備下式化合物的方法
其中P3代表氨基保護(hù)基；B代表烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基，或烷基芳烷基；P1代表酸保護(hù)基；E1代表H；E2代表天然α-氨基酸的α-碳側(cè)鏈，H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，雜環(huán)基烷基，取代的雜環(huán)基烷基，或者E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子一起連接成4-、5-、6-、或7-元氮雜環(huán)烷烴環(huán)；G代表OR1或NR1R2；R1和R2獨(dú)立地代表H，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，烷基環(huán)烷基，烷基環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，烷基芳基，或烷基芳烷基；和p代表1-4，該方法包括使下式((哌啶-4-叉)丁酸)化合物
與下式三肽或其酸加成鹽偶聯(lián)
21. 權(quán)利要求20的方法，其中P1代表對氫化不穩(wěn)定的酸保護(hù)基，且P3代表對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基。
22. 下式化合物
其中P3代表氨基保護(hù)基。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的化合物，其中P3代表對氫化不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的化合物，其中P3代表芐氧基羰基。
全文摘要
本發(fā)明涉及不吸濕穩(wěn)定結(jié)晶形式的抗血栓形成化合物N－[N－[N－(4－(哌啶－4－基)丁?；?－N－乙基甘氨?；鵠－(L)－天冬氨酰基]－(L)－β－環(huán)己基—丙氨酰胺、制備所述穩(wěn)定晶形的方法、其藥物組合物、以及其中間體。本發(fā)明還涉及制備式(Ⅱ)化合物的方法,其中:A,B,Z,E
文檔編號A61K38/00GK1231659SQ97198210
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月21日
發(fā)明者Z·J·克贊, J·J·曼塞爾, D·托勒多－維拉絲奎咨, V·溫迪施, R·G·伍德沃德, D·C·薩拉扎, N·M·維默里, A·J·加德托, M·R·帕沃斯, G·G·庫比克, R·C·劉, B·J·瓦納瑟, J·P·舍比恩, W·羅德里奎茲, A·W·斯勒德斯基 申請人:羅納·布朗克羅爾藥制品有限公司