專利名稱：鑒定具有無限增殖或腫瘤形成潛力之人和動物細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適用于檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力之細(xì)胞的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)DNA序列和抗體；得到所述DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)或DNA序列的方法以及它們鑒定具有無限增殖和腫瘤形成潛力之人和動物細(xì)胞的用途。
所有分化的人和動物細(xì)胞在其衰老和死亡之前均具有有限的體內(nèi)和體外增殖潛力。在一給定的時間，可能有的細(xì)胞分裂數(shù)目取決于細(xì)胞的分化程度，其年齡和細(xì)胞所來自的供體的種類，以及細(xì)胞培養(yǎng)的持續(xù)時間(Goldsten，S.Replicative Senescence，Science 249(1990)，1129-1133)。然而經(jīng)常在腫瘤形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中見到無限增殖。因此，它們形成導(dǎo)致腫瘤形成的不斷生長的合胞體，最后隨著這些細(xì)胞的其它特性的改變，導(dǎo)致腫瘤疾病。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤的臨床特征在于它們生長迅速并經(jīng)常轉(zhuǎn)移。細(xì)胞的腫瘤形成轉(zhuǎn)化的特征在于也取決于細(xì)胞分化程度的大量細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)之改變的異型圖像。到目前為止，僅僅了解很少的腫瘤轉(zhuǎn)化的分子水平上可確定的參數(shù)；例如它們包括某些基因甲基化的改變程度(W.Doerfler et al.，Eukaryotic DNA甲基化事實(shí)和問題，F(xiàn)EBS Letters 268(1990)，329-330)，修飾基因的表達(dá)，或某些基因產(chǎn)物的改變的磷酸化。
大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共性是具有無限的體內(nèi)增殖能力?；诟鞣N觀察，研究人員認(rèn)為不依賴于生長因子的腫瘤細(xì)胞的增殖確實(shí)是腫瘤形成細(xì)胞經(jīng)常有的特征，但并不是絕對必需的(M.Strauss，B.E.Griffin，Cellular Immortalization，Cancer Cells 2(1990)，360-365)。然而，對于診斷和治療領(lǐng)域的許多問題來說，鑒別那些不再遵循正常的增殖控制并因此獲得無限增殖潛力的那些細(xì)胞是很重要的。
在此所涉及的問題是將腫瘤細(xì)胞無限增殖的這種特性與在許多組織中所見到的再生能力區(qū)別開。再生是一種受控的短期(短暫)細(xì)胞復(fù)制，并且作為對生理刺激的反應(yīng)，僅僅是程序化細(xì)胞死亡的間歇抑制。在組織再生后，正常細(xì)胞的短期增殖又會由未鑒定的信號抑制。
檢測惡性腫瘤細(xì)胞的已知方法是以臨床，組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究為基礎(chǔ)，并以改變的生理學(xué)檢測結(jié)果為依據(jù)。以組織學(xué)檢測為基礎(chǔ)，常規(guī)診斷方法通常是進(jìn)行組織切片(W.A.D.Anderson and J.M.Kissane，Pathology I，II，Mosby，Saint Louis 1977，7th edition；C.S.Herrington andJ.O.D.McGee，Diagnostic Molecular Pathology，Oxford University Press，Vol.I，II.1st ed.，1992)。與良性生長相反，惡性細(xì)胞群與相鄰組織僅有模糊的分界，并且細(xì)胞生長到其周圍組織中浸潤并破壞之。大多數(shù)情況由病灶周圍的炎癥引發(fā)。通常許多有絲分裂會提高腫瘤細(xì)胞的增生活性。
除這些組織學(xué)檢測外，利用抗體檢測增生的惡性細(xì)胞的方法變得越來越普遍使用，所述的抗體能識別最好是由增生的腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原例如Ki67(D.C.Matthews，F(xiàn).O.Smith，I.D.Bemstein，Monoclonalantibodies in the study and therapy of hematopoietic cancers，Curr.OpinionImmunol.4(1992)，641-646；M.Schwouzen，V.Diehl，M.Pfreundschuh，immunozytologische Phanotypisierung von Leukamien und Lymphomen，Med.Klinik 85(1990)，533-547)。但是，這些方法是以確定間接參數(shù)為基礎(chǔ)，而沒有檢測與無限增生有關(guān)的分子過程。
因此，本發(fā)明的目的之一是在給實(shí)驗(yàn)室動物注射后，以無需體外培養(yǎng)這些細(xì)胞或使其繁殖的快速可行的方法鑒別具有無限增殖潛力的細(xì)胞特別是惡性腫瘤細(xì)胞。它應(yīng)可以區(qū)別具有無限增殖潛力的細(xì)胞和在再生組織中短期增殖的細(xì)胞。
本發(fā)明的上述目的用DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物(下文稱為復(fù)合物)來完成，所述的復(fù)合物適用于檢測有無限增殖和腫瘤形成潛力的人和動物。得到所述的復(fù)合物可以通過從可永久分裂且在氯化銫梯度中的密度為約1.82-1.89g/cm3的人或動物細(xì)胞分離細(xì)胞質(zhì)的無線粒體組分；然后用酚提取和乙醇沉淀從該組分中分裂所述的復(fù)合物。
實(shí)驗(yàn)令人吃驚地表明，與正常休眠細(xì)胞，衰老細(xì)胞或短期繁殖的細(xì)胞相反，具有無限增殖和腫瘤形成潛力的細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中確實(shí)有所述的復(fù)合物。用本發(fā)明的這些復(fù)合物有可能檢測所述的細(xì)胞，作為惡性生長的結(jié)果，這些細(xì)胞表現(xiàn)出無限生長潛力。為了達(dá)到這一目的，通過確定DNA含量或與特異性抗體的反應(yīng)，在凝膠電泳中，人們用本發(fā)明復(fù)合物中的細(xì)胞質(zhì)或適宜的細(xì)胞質(zhì)組分作為標(biāo)準(zhǔn)。
為了分離本發(fā)明的復(fù)合物，根據(jù)已知方法(例如，EP-B-0093436，EP-B-0256512和Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988)，468-472 and lysed forexample using detergents like NP40 or SDS，Wigler and Weistern，Biochem.Biphys.Res.Comm.63(1975)669-674)獲取能永久分裂的人或動物細(xì)胞的胞質(zhì)體。優(yōu)選的用蔗糖梯度從這些胞質(zhì)體組分分離線粒體(J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995)。將這些不含任何線粒體的組分與RNase，優(yōu)選的是RNase A和RNase T1以及與蛋白酶，如，蛋白酶K或灰色鏈霉菌蛋白酶一起培養(yǎng)。富集該混合物中在氯化銫梯度中的密度為約1.82-1.89g/cm3的組分，然后用酚提取和乙醇沉淀從該組分中分離復(fù)合物。用氯化銫密度梯度離心和電泳分離均可以得到在氯化銫梯度中密度為約1.82-1.89g/cm3的組分；這些方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的(Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition，1989)。
通過反復(fù)凍融細(xì)胞或通過得到無核DNA的細(xì)胞組分也可以得到用于分離復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)的無線粒體組分。優(yōu)選的通過用氯化鈉和SDS溶解細(xì)胞(″Hirt提取″，J.Mol.Biol.26(1967)365-369)然后離心得到所述的組分。接著從上清液中可以分離復(fù)合物。
在優(yōu)選的方法中，經(jīng)用鹽梯度沉降從待測細(xì)胞的胞質(zhì)溶解產(chǎn)物中分離復(fù)合物。通過反復(fù)凍融而不用洗滌劑，將細(xì)胞溶解在含Mg2+的緩沖液(50mmol/l Tris-HCl，pH7.2，10mmol/l EDTA，3mmol/l MgCl2)中；以6000xg離心沉淀核，然后用蛋白酶K(100ug/ml)將上清液于60℃消化1小時。用CsCl兩步梯度離心(150,000xg，10小時)分離釋放的復(fù)合物；下層組分的密度為約1.80g/cm3，而上層的密度為約1.70g/cm3。胞質(zhì)復(fù)合物會沉淀，而染色體DNA或不含共價DNA結(jié)合蛋白的復(fù)合物仍會留在上清液中。
利用下列特性，本方法可以迅速地分離胞質(zhì)復(fù)合物-通過凍融含Mg2+的緩沖液而不必溶解核或使用洗滌劑可釋放復(fù)合物。
-復(fù)合物對于蛋白酶來說是穩(wěn)定的，而胞質(zhì)細(xì)胞器和膜則被消化。
-復(fù)合物有很高的密度(約1.86g/cm3)而且利用鹽梯度可以與染色體或其它胞質(zhì)DNA分開。
-DNA結(jié)合蛋白對于高濃度鹽是穩(wěn)定的。
從任何轉(zhuǎn)化細(xì)胞的胞質(zhì)，尤其是永久生長的人或動物細(xì)胞或從腫瘤細(xì)胞，特別是從腫瘤活檢得到的那些細(xì)胞可以得到所述復(fù)合物。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被理解為通過加入一種試劑而不死亡的細(xì)胞。不同種(例如，人，小鼠，大鼠)的永久增殖細(xì)胞和不同分化程度的細(xì)胞(纖維瘤，骨髓瘤，腹水細(xì)胞)含有與其蛋白質(zhì)和/或DNA內(nèi)含物不同的復(fù)合物。因此，對于種和分化程度而言，本發(fā)明的復(fù)合物是特異性的。為了檢測具有無限增殖和腫瘤形成潛力的細(xì)胞，人們從與待測的細(xì)胞為相同的種或相似的細(xì)胞類型的細(xì)胞中分離復(fù)合物。為了檢測無限增殖的小鼠成纖維細(xì)胞/纖維瘤細(xì)胞或腹水腫瘤細(xì)胞，特別優(yōu)選的是使用根據(jù)所描述的方法，從轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞(L929細(xì)胞，ATCC CCL 1)或Ehrlich腹水細(xì)胞(ATCC CL77)的胞質(zhì)體中分離的復(fù)合物。為了得到其它組織或分化程度及其它種之永久組織細(xì)胞的復(fù)合物，可以使用具有所需分化程度的其它腫瘤細(xì)胞系和種作為來源以分離復(fù)合物。若想從人子宮頸腫瘤得到相應(yīng)的復(fù)合物，優(yōu)選的是使用人細(xì)胞系HeLa，或B淋巴瘤細(xì)胞系和B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系BJAB得到相應(yīng)的復(fù)合物。此外，可以使用通過例如將原代細(xì)胞與永久生長細(xì)胞的胞質(zhì)體融合(EP-B-0093，436，Abken et al.，J.Cell.Biol.130(1986)795-805)或通過用來自這些胞質(zhì)體的DNA轉(zhuǎn)染(EP-B-0256512和DE4218945.4和Abken et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988)468-472)的實(shí)驗(yàn)性永生化過程而永生的永久生長細(xì)胞系。
實(shí)驗(yàn)表明密度為1.86g/cm3的胞質(zhì)DNA組分分布于整個Hodgkin淋巴瘤細(xì)胞。該DNA還與蛋白質(zhì)相連。在該組分中所含的DNA分子長度為50-500bp。如果是來自小鼠腫瘤的細(xì)胞，所有DNA分子都是線性的。但是，它們不與來自小鼠腫瘤細(xì)胞的DNA雜交。這表明本發(fā)明中的動物和人淋巴瘤細(xì)胞均含有胞質(zhì)DNA序列。還可以在結(jié)腸和乳腺癌和人黑瘤的人腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的該組分。
可以從這些復(fù)合物中分離蛋白質(zhì)和/或DNA并用它們檢測具有無限增殖和腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞。
因此本發(fā)明的另一目的是分子量為約52、62和/或64KD的蛋白質(zhì)，它們適用于檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞；通過用DNase I處理本發(fā)明的復(fù)合物并分離釋放的約52，62和/或64 KD的蛋白質(zhì)，然后經(jīng)層析或電泳方法可以得到它們。
為了分離這些蛋白質(zhì)，用DNase I處理所述的復(fù)合物，然后經(jīng)凝膠過濾從蛋白質(zhì)中分離消化的核酸；同時根據(jù)大小分離蛋白質(zhì)。若使用來自小鼠L細(xì)胞(L929)和/或Ehrlich腹水腫瘤細(xì)胞復(fù)合物，得到大小為52、62和64KD的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的特征在于它們在存在8mM Zn2+時有能力結(jié)合本發(fā)明克隆的pLC 108 DNA(SEQ ID NO 1)。來自Ehrlich腹水細(xì)胞的蛋白質(zhì)的特征在于，在存在8mM Na+時，它們有能力結(jié)合克隆的pEFC38 DNA(SEQ ID NO 29)。優(yōu)選的是使用模板結(jié)合的DNase制備這些蛋白質(zhì)，例如使用與sepharose共價結(jié)合的DNase。
本發(fā)明的另一目的是適用于檢測具有無限增殖和腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的抗體；通過用本發(fā)明的復(fù)合物或蛋白質(zhì)或DNA免疫動物可以得到所述抗體?？梢杂萌魏纬Ｓ糜诿庖叩膭游铮ㄐ∈?例如MNRI或BALB/c品種)或兔以及免疫方法(參見例如，J.Peters and H。Baumgarten，Monoklonale Antikorper，Springer Verlag，2nd edition1988)。
根據(jù)本發(fā)明復(fù)合物的免疫，DNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生與來自具有無限增殖或腫瘤形成潛力之細(xì)胞的胞質(zhì)的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，但不與有正常增殖能力之細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。用例如ELISA，熒光法，免疫檢測和本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的所有競爭性免疫測定法，可以完成本發(fā)明的抗體對這些蛋白質(zhì)的檢測。
除本發(fā)明復(fù)合物的蛋白質(zhì)部分外，用DNA部分也可以進(jìn)行檢測。
因此，本發(fā)明的另一方面是適用于檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的DNA，通過本發(fā)明復(fù)合物的DNA的克隆或酶促復(fù)制過程可以得到所述的DNA。
實(shí)驗(yàn)令人驚奇地表明，盡管在復(fù)合物中，本發(fā)明復(fù)合物的DNA與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，以致用洗滌劑，蛋白酶高鹽濃度或熱處理均不能除去，但可以使所述DNA連接到象分離的DNA這樣的克隆載體中或可以經(jīng)酶促擴(kuò)增，例如用PCR。通過將復(fù)合物的DNA例如連接到常用載體如pUC19中可以得到DNA，然后克隆在本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的宿主生物例如E.coli HB101或E.coli DH5α中可以得到所述的DNA。然后通過與本發(fā)明復(fù)合物雜交來鑒定含本發(fā)明DNA序列的重組克隆并分離該DNA。從L929細(xì)胞(ATCC CCL 1)可以得到20個重組質(zhì)粒，而從Ehrlich腹水細(xì)胞(ATCC CCL 77)可以得到25個質(zhì)?？寺?，它們適宜于分子鑒定有無限增殖潛力之細(xì)胞。這些DNA序列列于序列表SEQ ID NO 1-45。利用這些序列，可以檢測其它不同分化程度或其它種之細(xì)胞的其它適宜的DNA序列以鑒別具有無限增殖潛力的相應(yīng)細(xì)胞。
SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 29所示的DNA序列適于使人或動物細(xì)胞永生(參見德國專利申請P 4218945.4)。所有其它的DNA序列(SEQ ID NO2-28和SEQ ID NO 30-45)均沒有永生化作用，但適于檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選方面是含有示于SEQ ID NO 2-28或SEQ ID NO30-45的DNA序列之一或與這些序列之一雜交的DNA。
本發(fā)明的另一優(yōu)選目的是含有示于SEQ ID NO 46-61的DNA序列之一或與這些序列中的一個或數(shù)個雜交的DNA。SEQ ID NO 46-58得自HD 428Hodgkin細(xì)胞的DNA 。 SEQ ID NO 59-61得自MCF 7細(xì)胞(乳腺癌)的DNA。
本發(fā)明的核酸可以是DNA，但也可以是RNA或核酸類似物，例如，已經(jīng)用多肽鏈取代了糖磷酸酯骨架的那些。所述核酸可以是雙鏈的，但優(yōu)選的是單鏈的。本發(fā)明還包括各互補(bǔ)序列。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的核酸含有至少15個氨基酸的序列，由此，從一組如下的至少15個氨基酸中選出這些序列-SEQ ID NO 2-28或30-61的序列中所含的序列，-通過連接SEQ ID NO 1-45，46-58，或59-60中的兩個序列而得到的序列，-編碼與上述兩類序列的氨基酸序列相同的序列，-在特定的序列內(nèi)，含有與上述所列的兩類序列有至少70％，優(yōu)選的至少90％以上，最好為95％以上的序列特異性的序列。
特別優(yōu)選的核酸長度為16-100個核苷酸。根據(jù)長度，可以用分子生物學(xué)或化學(xué)/合成方法得到所述的核苷酸。
實(shí)驗(yàn)表明，到目前為止，所檢測DNA序列中的大多數(shù)均含有一致序列NNAAANTNTNGAANTGTANNANTGNAA(SEQ ID NO 62)。
本發(fā)明的另一目的是通過分離人或動物細(xì)胞中的本發(fā)明復(fù)合物然后從該復(fù)合物克隆DNA或經(jīng)酶促復(fù)制而得到本發(fā)明DNA的方法，所述的人或動物細(xì)胞能永久地分裂。
本發(fā)明另一優(yōu)選的目的是獲得本發(fā)明DNA的方法，其中所述的本發(fā)明DNA序列可以通過將人和動物細(xì)胞的基因組基因庫或cDNA庫與示于SEQ IDNO 1-61的DNA序列之一雜交并根據(jù)已知方法從基因庫中分離雜交的克隆DNA來鑒別?？梢允褂糜谰迷錾哪[瘤細(xì)胞基因庫以及正常細(xì)胞或組織的基因庫。
本發(fā)明的另一優(yōu)選目的是通過將人和動物細(xì)胞的DNA與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合而得到本發(fā)明DNA的方法；蛋白質(zhì)結(jié)合到硝酸纖維素或其它載體膜上并于存在Zn2+或Na+的條件下溫育(例如4℃30分鐘)。隨后以高鹽濃度(例如0.1％SDS，2x SSC)嚴(yán)格洗滌混合物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選的目的是通過酶促復(fù)制人或動物細(xì)胞的DNA或RNA組分而得到本發(fā)明DNA的方法；所用的起始分子是與示于SEQ ID NO 1-61的序列之一雜交的寡核苷酸分子。優(yōu)選的寡核苷酸起始分子長度在20-30個堿基對之間。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法(Mullis and Fallona，Meth.Enzymol.155(1987)335-350，Saiki et al.，Science 239(1988)487-491)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以酶促復(fù)制所需的DNA序列?？梢杂没驇煲约癉NA或RNA制品或人或動物無限增殖或正常衰老細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物作為DNA組分。
本發(fā)明方法的另一改變是化學(xué)合成含有示于SEQ ID NO 1-61的DNA序列之一或部分該DNA序列的本發(fā)明DNA。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的寡核苷酸合成方法(F.Eckstein，ed.，Oligonucleotides and analoguesA practicalapproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford(1991))完成合成；優(yōu)選的是使用市售的寡核苷酸合成裝置。
本發(fā)明的另一目的是檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞的方法，通過檢測待測細(xì)胞之胞質(zhì)中的無線粒體組分而檢測本發(fā)明的復(fù)合物。具有有限增殖能力的正常細(xì)胞在胞質(zhì)的該組分中不含有所述的復(fù)合物，而無限增殖的細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞含有數(shù)百拷貝的這些復(fù)合物。
本發(fā)明的復(fù)合物被分泌出。這些復(fù)合物的DNA-蛋白質(zhì)-連接物對于蛋白水解消化是非常穩(wěn)定的。在經(jīng)過水解處理數(shù)周的細(xì)胞上清液中，可以檢測所述的復(fù)合物。
在可以對其進(jìn)行檢測的外周血，尿，或其它體液中也可能含有所述的復(fù)合物。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的目的是通過檢測體液中的本發(fā)明的復(fù)合物而檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的方法。
經(jīng)DNA組成或經(jīng)凝膠電泳可以確定所述的復(fù)合物，而以本發(fā)明的復(fù)合物為標(biāo)準(zhǔn)確定陽性反應(yīng)。然而，在這些方法中，不能分辨不同種或組織類型的復(fù)合物。但是，利用本發(fā)明的抗體就可以進(jìn)行所述的特異性檢測。
除完全抗體外，還可以使用含有輕鏈和重鏈之特異性抗原識別區(qū)(VL和VH)和的抗體片段。這些片段可以與載體例如蛋白質(zhì)，糖或sepharose偶聯(lián)，或可以與染料連接以得到融合產(chǎn)物。
優(yōu)選的，將抗體的抗原識別區(qū)VL和VH的編碼基因序列與載體分子例如噬菌體的表面蛋白或病毒的衣殼蛋白之基因序列融合而得到所述的融合產(chǎn)物；然后在體外表達(dá)該雜合基因。分離和克隆編碼抗體V區(qū)的基因序列并將其插入其它基因的DNA，例如g3p噬菌體蛋白質(zhì)的基因序列的方法以及表達(dá)所述融合蛋白的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的(Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 86(1989)3833-3837；chiang et al.，BioTechniques 7(1989)360-366；Winter，G.and Milstein，C.，Nature349(1991)293-299)。然后象抗體一樣可以在復(fù)合物的檢測中使用融合產(chǎn)物(在噬菌體或病毒表面或以分離的形式)。
最后，通過將待測細(xì)胞中的DNA組分與本發(fā)明的DNA雜交也可以檢測這些細(xì)胞中的復(fù)合物。該方法的優(yōu)點(diǎn)是用這些DNA探針可以區(qū)別不同分化程度(纖維瘤和/或腹水腫瘤)和種(小鼠或人)的細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的另一目的是有關(guān)通過將具有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞的DNA組分與本發(fā)明的DNA雜交，從而檢測這些細(xì)胞的方法。
可以用含有本發(fā)明復(fù)合物的胞質(zhì)體的細(xì)胞組分作為DNA組分。然而，也可以用待測細(xì)胞的核，染色體DNA。實(shí)驗(yàn)表明，與具有無限增殖能力的細(xì)胞相比，在限制性消化并用Southern印跡分析限制性片段后，正常短期增殖細(xì)胞的核染色體DNA與本發(fā)明的DNA序列雜交后，有另一種雜交的限制性片段圖形。通常，與探針雜交的其它限制片段說明存在具有無限增殖和腫瘤形成潛力的細(xì)胞。
本發(fā)明的DNA序列表現(xiàn)出如此高的敏感性和特異性以致可以用這些樣品與細(xì)胞或組織原位雜交。只有表現(xiàn)出無限增殖或腫瘤形成潛力的細(xì)胞在胞質(zhì)中被標(biāo)記。為了進(jìn)行原位雜交，可以用體外培養(yǎng)的細(xì)胞和活檢中得到細(xì)胞或活檢組織切片而不要求為復(fù)制細(xì)胞材料而進(jìn)行的培養(yǎng)步驟。
本發(fā)明的另一優(yōu)選的目的是按原位雜交而完成雜交的本發(fā)明方法的改變。
根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法(Mullis and Fallona，Meth.Enzymol.155(1987)335-350；Saiki et al.，Science 239(1988)487-491)特別是利用聚合酶鏈反應(yīng)，在酶檢測反應(yīng)中，通過復(fù)制來自待測細(xì)胞之復(fù)合物的DNA，可進(jìn)一步提高本方法的敏感性。
因此，本發(fā)明優(yōu)選的目的是本發(fā)明方法的一個具體的實(shí)施方案，其中，利用與本發(fā)明DNA雜交的寡核苷酸，由待測細(xì)胞的溶解產(chǎn)物或這些細(xì)胞的DNA或RNA片段經(jīng)酶促作用復(fù)制核酸。
盡管對于高溫(于90℃，1小時)，高鹽濃度(例如6.9mol/l氯化銫)和蛋白酶K消化(100ug/ml于60℃經(jīng)1小時)來說，DNA蛋白質(zhì)結(jié)合是穩(wěn)定的，但所述的擴(kuò)增是可能的。
用所描述的檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之細(xì)胞的方法檢測惡性腫瘤，其中，用活檢的細(xì)胞、組織切片或來自人或動物體液的細(xì)胞或分泌的復(fù)合物作為樣品材料。因此，描述的方法適用于檢測這些細(xì)胞。此外，若做相應(yīng)的修改，則也可以用描述的方法分離這些細(xì)胞。在該方法中，描述的方法特別要用于分離過程中鑒定某特定組分中的所需細(xì)胞?？梢杂帽景l(fā)明的抗體，隨后，借助熒光激活細(xì)胞分類法(FACS)分離細(xì)胞。
下列實(shí)施例與列出具體優(yōu)選DNA序列的序列表一起更詳細(xì)地說明本發(fā)明。實(shí)施例1分離復(fù)合物并克隆其DNA以及克隆適用于檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力之細(xì)胞的這些復(fù)合物的DNA從L929小鼠腫瘤成纖維細(xì)胞(L929細(xì)胞，ATCC CCL 1)和Ehrlich腹水細(xì)胞(EAZ，ATCC CCL 77)分離胞質(zhì)復(fù)合物。首先，利用細(xì)胞松弛素B(50ug/ml)根據(jù)已知方法(Wigler and Weistein，Biochem.Biophys.Res.Comm.63(1975)669-674)得到這些細(xì)胞的胞質(zhì)體，然后經(jīng)反復(fù)凍融而溶解。根據(jù)J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995利用蔗糖梯度從胞質(zhì)體溶胞產(chǎn)物中分離線粒體。將不含線粒體的組分與RNase A(20ug/ml)和RNaseT1(1000U/ml)一起于37℃溫育30分鐘，隨后，與蛋白酶K(50ug/ml)于60℃溫育20-60分鐘。根據(jù)分離DNA的已知方法例如，用酚或氯仿/異戊醇提取從該混合物中分離復(fù)合物；經(jīng)CsCl密度梯度(Sambrook etal.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition 1989)富集在氯化銫梯度中密度為約1.82-1.89g/cm3的組分。對10mmol/l Tris-HClpH7.2，1mmol/l EDTA透析該組分，用乙醇和乙酸鈉沉淀所述的復(fù)合物。
為了分離這些復(fù)合物的DNA，對10mmol/l Tris-HCl，1mmol/lEDTA，pH7.2透析所述的復(fù)合物。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，2nd edition 1 989)，在存在各種dNTP的條件下，用Klenow DNA聚合酶使DNA進(jìn)行“填補(bǔ)反應(yīng)”；隨后在存在0-10U連接酶的條件下將其連接到pUC19載體中，并在E.coli.中克隆所得的重組質(zhì)粒。在質(zhì)粒于細(xì)菌中復(fù)制期間，生產(chǎn)出該重組DNA分子的無蛋白質(zhì)拷貝。
因此，可以得到數(shù)個獨(dú)立的L929細(xì)胞胞質(zhì)復(fù)合物的質(zhì)粒克隆(pLC)和來自Ehrlich腹水細(xì)胞相應(yīng)組分的質(zhì)?？寺?pEFC)，它們適用于檢測有無限增殖潛力的腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞(見實(shí)施例2)。相應(yīng)的DNA序列列于SEQID NO 1-46。實(shí)施例2分離復(fù)合物的簡化方法于存在50mmol/l Tris-HCl pH7.2，10mmol/l EDTA和1.5mmol/l氯化鎂的條件下，通過反復(fù)冷融來溶解小鼠腫瘤胞質(zhì)體細(xì)胞系L929細(xì)胞(ATCCCCL 1)；隨后以6000g離心30分鐘分離核。將所得的上清液與蛋白酶K(100ug/ml)于60℃溫育20分鐘。然后放在氯化銫兩步梯度上；底層的組分的密度為約1.80g/cm3，而上層的組分(1ml)的密度約為1.70g/cm3。以150,000g離心10小時后，將沉淀重懸于100ul 10mmol/lTris-HCl pH7.2，1mmol/l EDTA中，按實(shí)施例1所述確定在該組分中所得DNA的量。實(shí)施例3用胞質(zhì)復(fù)合物檢測具有無限增殖能力的人或動物細(xì)胞通過確定這些細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的胞質(zhì)復(fù)合物來檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞。首先，用細(xì)胞松弛素B(50ug/ml)根據(jù)已知方法(Wigler and Weistein，Biochem.Biophys.Res.Comm.63(1975)669-674)得到這些細(xì)胞的胞質(zhì)體，然后重復(fù)凍融以使其溶解。用蔗糖梯度(J.Biol.Chem.249(1974)7991-7995)從胞質(zhì)體溶解產(chǎn)物中分離線粒體，然后將無線粒體的組分與RNase A(20ug/ml)和RNase T1(1000U/ml)溫育，隨后與蛋白酶K(50ug/ml)溫育。按已知方法(Sambrook et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition 1989)用CsCl密度梯度使該混合物經(jīng)超速離心。經(jīng)密度約1.82-1.89g/cm3之組分中的DNA組成物，確定可能存在的復(fù)合物(結(jié)果見表1)。根據(jù)已知方法(Sambrooket al.)經(jīng)光度計(jì)或通過攝取溴化乙錠來確定DNA組成物。
實(shí)驗(yàn)表明，有有限預(yù)期壽命且在培養(yǎng)中只有一定數(shù)目的細(xì)胞分裂(約15-20代)的正常小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)在胞質(zhì)的這些組分中檢測不到DNA。在其達(dá)到預(yù)期的細(xì)胞死亡之前，經(jīng)歷了該分化階段且在體內(nèi)體外僅有3-5次細(xì)胞分裂的人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)也沒有可檢測的胞質(zhì)復(fù)合物。但是，有無限增殖能力的細(xì)胞例如，惡性腫瘤建立的細(xì)胞系確實(shí)在相應(yīng)的組分中含有胞質(zhì)復(fù)合物(表1)。
表1通過確定胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物來檢測具有無限增殖能力的人或動物細(xì)胞細(xì)胞 種類 細(xì)胞表型增殖作用胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物(μg DNA/109細(xì)胞)PBL人 正常 短暫 ＜1ngWIL-2 人 腫瘤細(xì)胞 無限 約200ngHS-Sultan 人 腫瘤細(xì)胞 無限 約100ngMEF 小鼠 正常 短暫 ＜1ngL929 小鼠腫瘤細(xì)胞 無限 約200ngEAZ 小鼠腫瘤細(xì)胞 無限 約500ngAg8.653 小鼠腫瘤細(xì)胞 無限 約300ngPBL外周血的人淋巴細(xì)胞WIL-2 人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系(ATCC CRL 8062)HS-Sultan 人白血病細(xì)胞系(ATCC CRL 1484)MEF小鼠胚胎成纖維細(xì)胞L929 小鼠L細(xì)胞的腫瘤形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(ATCC CCL 1)EAZ小鼠腹水腫瘤的腫瘤形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(ATCC CCL 77)Ag8.653小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(ATCC CRL 1580)實(shí)施例4通過將胞質(zhì)復(fù)合物與pLC108 DNA探針(SEQ ID NO 1)雜交而檢測細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞將腫瘤形成轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞系L929(A)和原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)(第5代)(B)于50mmol/lTris-HCl，pH7.2，10mmpl/l EDTA，3mmol/l MgCl2存在下，重復(fù)凍融溶解。以6000g離心20分鐘沉淀核。將上清液(胞質(zhì)溶解產(chǎn)物)與蛋白酶K(50ug/ml)于60℃溫育1小時。隨后，將KCl(0.5mol/l)加至該組分中，通過使用“Minifold”裝置的BA85硝酸纖維素濾膜(Schleicher & Schuell)以稀釋系列過濾。由于待測復(fù)合物的DNA蛋白質(zhì)結(jié)合對于高鹽濃度是穩(wěn)定的，而且由于蛋白酶不消化復(fù)合物中的蛋白質(zhì)，因此，在所選的條件下，復(fù)合物(與其它DNA蛋白質(zhì)結(jié)合相反)保持完整并留在濾膜上。然后用20x SSC將硝酸纖維素濾膜洗滌2次并于120℃干燥15分鐘。為了檢測有無限增殖能力的小鼠成纖維細(xì)胞的復(fù)合物，于42℃(Sambrook et al.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory，2nd edition，1989)在嚴(yán)格條件(55％甲酰胺，1mol/l NaCl，1％SES，10％葡聚糖硫酸鹽，100ug/ml Hering SpermaDNA)根據(jù)已知方法與32P-標(biāo)記的示于SEQ ID NO 1(pLC108)的DNA序列雜交。
結(jié)果(A)L929細(xì)胞胞質(zhì)溶解產(chǎn)物樣品表明，與SEQ ID NO 1所示的探針序列(pLC108)的雜交信號依賴于溶解產(chǎn)物的稀釋度。
(B)與原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的胞質(zhì)溶解產(chǎn)物不雜交。實(shí)施例5用原位雜交檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞在顯微鏡玻片的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)L929小鼠腫瘤細(xì)胞(ATCC CCL1)(A)和原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(第5代)(B)。兩種培養(yǎng)物均含有正在增殖的細(xì)胞；在培養(yǎng)約15-20代后，L929細(xì)胞有無限增殖潛力，而原代小鼠成纖維細(xì)胞停止增殖，然后死亡。此外，皮下注射L929細(xì)胞，在C3H小鼠中誘導(dǎo)腫瘤；然后，得到該腫瘤的冷凍切片并放在顯微鏡玻片上(C)。用PBS(Dulbecco/Vogt，J.Exp.Med.99(1954)，167-182)簡單洗滌顯微斜面兩次，并用200ul中性聚甲醛溶液(5％)固定；隨后用乙醇(70％)洗滌兩次。為了檢測有無限增殖潛力的細(xì)胞，使用與SEQID NO 1所示序列(pLC108)類似的寡核苷酸(引物A)5’GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT3 3’(相應(yīng)于SEQ ID NO 1的核苷酸1-25)。在20ul反應(yīng)緩沖液(20mmol/l卡可酸鉀，25mmol/l Tris-HCl，pH6.8，5mmol/l CoCl2，0.25mg/ml牛血清白蛋白)中于37℃用地高辛配基-標(biāo)記的二脫氧UTP(DIG-11-ddUTP)(1nmol)25U的末端轉(zhuǎn)移酶(Boehringer Mannheim Gmbh，Cat.NO.220582)標(biāo)記寡核苷酸20分鐘。然后通過P10柱(Biorad制造)經(jīng)凝膠過濾從無DIG-ddUTP的核苷酸分離標(biāo)記的核苷酸。為了雜交，用200ul雜交溶液(50％去離子甲酰胺，4xSSC，10％葡聚糖硫酸鹽，1x Denhardt溶液，0.25mg/ml變性的tRNA，0.5mg/ml變性的hering sperm DNA)包被固定了細(xì)胞或組織切片的顯微鏡玻片。然后用蓋玻片蓋在所述玻片的溶液上，在保濕器中，將顯微鏡玻片于42℃溫育1小時。隨后，再除去溶液，用DIG-ddUTP-標(biāo)記的寡核苷酸(在40μl雜交溶液中有5ng DNA)包被細(xì)胞，然后于42℃在保濕箱中溫育。接著，于42℃用2x SSC將顯微鏡玻片洗滌兩次。為了檢測雜交的寡核苷酸，在室溫將細(xì)胞與FITC-結(jié)合的抗DIG抗體(由Boehringer Mannheim，Cat.No.1207741制造)溫育20分鐘。用PBS洗滌兩次除去未結(jié)合的抗體。然后在470nm的波長，用熒光顯微鏡評估制品。結(jié)果(A)L929腫瘤細(xì)胞在胞質(zhì)中有增強(qiáng)的熒光，而核沒有任何熒光。在胞質(zhì)的核附近，雜交信號的積累特別明顯。在對照實(shí)驗(yàn)中(沒有寡核苷酸，但與FITC-抗-DIG抗體溫育的細(xì)胞的“假雜交”)沒有熒光信號產(chǎn)生。
(B)在原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)雜交后，細(xì)胞未被標(biāo)記(在胞質(zhì)或核中均沒有)。
(C)由L929細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤的組織切片雜交后，腫瘤細(xì)胞在胞質(zhì)中有熒光，而周圍(正常)組織和皮下組織沒有任何雜交信號。在對照實(shí)驗(yàn)中(沒有寡核苷酸，但與FITC抗-DIG抗體溫育的細(xì)胞的“假雜交”)，沒有產(chǎn)生熒光信號。在組織切片中，通過與本發(fā)明的寡核苷酸樣品雜交，也可以檢測有無限增殖潛力的致腫瘤的L929細(xì)胞的胞質(zhì)復(fù)合物。在組織切片或活檢中，也可以鑒定腫瘤形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。實(shí)施例6通過染色體DNA的雜交檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力的人或動物細(xì)胞從腫瘤形成轉(zhuǎn)化的L929成纖維細(xì)胞(ATCC CCL 1)，Ehrlich腹水腫瘤細(xì)胞(ATCC CCL 77)，骨髓瘤Ag8.653細(xì)胞(ATCC CRL 1580)，永久增殖的WEHI164纖維肉瘤細(xì)胞(ATCC CRL 1751)的小鼠細(xì)胞系但非致瘤性的成纖維細(xì)胞系NIH3T3(ATCC CRL 6473)和根據(jù)已知方法(Abken etal.，J.Cell Biol.103(1986)，795-805；Sambrooket al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd edition 1989)，通過在PBS中于73℃將膠原酶(0.1U/ml)和dipa se(0.8U/ml)切的小鼠胚胎(12型)而得到的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)(6代)中分離染色體DNA。用Hind III裂解后，電泳分離DNA并用Southern印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。檢測有無限增殖的細(xì)胞后，用32P-標(biāo)記的示于SEQ ID NO 29的DNA序列(pEFC38)與血液雜交。結(jié)果在檢測的細(xì)胞中有不同大小的雜交限制性片段(表2)?？梢澡b定下列特征1有有限預(yù)期壽命和有限增殖作用的細(xì)胞(例如MEF)顯現(xiàn)約3kb和約2.6kb的Hind III譜帶。
2有無限增殖潛力和腫瘤形成(L929，EAZ，Ag8.653，WEHI164)或無限增殖但沒有腫瘤形成(NIH3T3)的細(xì)胞顯示出有特定大小的HindIII限制片段的其它雜交信號。3kb譜帶常常不出現(xiàn)。對于所有無限增殖細(xì)胞所共有的是有下列大小的特定的其它Hind III限制片段10kb，13kb，14.5kb，16.6kb，和21.1kb 。如果用示于SEQ ID NO 29的DNA探針(EFC38)產(chǎn)生這些額外的雜交譜帶和/或未出現(xiàn)的雜交的3kb HindIII譜帶，則表明小鼠細(xì)胞有無限增殖潛力。
表2通過將染色體DNA與pEFC38 DNA樣品(SEQ ID NO 29)雜交來檢測具有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞細(xì)胞 雜交的限制性片段(kb)1.9kb2.6kb3.0kb6.0kb＞10kbMEF- ++- -NIH 3T3- ++- +L929 + +++ +EAZ- +++ +Ag8.653+ +-- +WEHI164- +-- ++/-與所列大小的基因組DNA的Hind III限制性片段雜交/不雜交。
Hind III限制性片段＞10kb10kb，13kb，14.5kb，16.6kb，21.1kb實(shí)施例7通過擴(kuò)增某些胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的DNA來檢測有無限增殖能力的人或動物細(xì)胞永久增殖的L929小鼠纖維瘤細(xì)胞攜帶含有DNA的胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述DNA能與LC108DNA(SEQ ID NO 1)雜交。其它分化程度的小鼠腫瘤細(xì)胞，象Ehrlich腹水腫瘤細(xì)胞也有含有DNA的復(fù)合物，所述DNA與EFC38DNA(SEQ ID NO 29)雜交但不與LC108 DNA或SEQ ID NO 1-20所示的任何其它序列雜交。與有無限增殖能力的腫瘤細(xì)胞L929和Ehrlich腹水細(xì)胞相反，在有有限增殖能力的原代成纖維細(xì)胞如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中不能檢測到所述的復(fù)合物，利用聚合酶鏈反應(yīng)，可以特異性地?cái)U(kuò)增相應(yīng)復(fù)合物的DNA以便在細(xì)胞混合物中檢測是否存在永久增殖的細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)所選的條件下，可以區(qū)別這些細(xì)胞的分化程度以鑒別是纖維瘤或腹水細(xì)胞。
將104個原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(6代)，腫瘤形成轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞系L929(ATCC CL1)和Ehrlich腹水(ATC CCL 77)或這些細(xì)胞的混合物重懸于5μl PBS中，然后加入15μl的水，立即將混合物冷凍于-20℃，再加熱到95℃持續(xù)10分鐘。將樣品與蛋白酶K(500ug/ml)于55℃溫育1小時，隨后在95℃再加熱10分鐘。加入下列反應(yīng)混合物以便根據(jù)已知方法用PCR技術(shù)擴(kuò)增胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的DNA(Mullis and Fallona，Meth.Enzymol.155(1987)335-350；Saiki et al.，Science 239(1988)487-491)3μl 10x Taq緩沖液(200mmol/lTris-Hcl，pH8.4，250mmol/lKCl，0.5％吐溫20，1mg/ml BSA)；0.5μl 100mmol/l MgCl2；1μl dNTP溶液(2mmol/l dATP，2mmol/dCTP，2mmol/l dGTP，2mmol/l dTTP)；1U Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)；100ng用于擴(kuò)增LC108的引物寡核苷酸A和B擴(kuò)增EFC38的同源DNA和/或引物寡核苷酸C和D胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的同源DNA。引物寡核苷酸序列(引物)是示于SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 29的部分DNA序列。引物A5’GATCTTGAGTTTCCTCGTTGTAGGT 3’(SEQ ID NO 1的核苷酸1-25)。引物B5’GATCCAAAGCCCTCTGCTGGCCTCC 3’(與SEQ ID NO 1的核苷酸2 03-1 79互補(bǔ))。引物C5’GATCCAATCAGCTCAGCCACCCCCA 3’(SEQ ID NO 29的核苷酸1-25)引物D5’AAAACCAGGCCCTCCCACATG 3’(與SEQ ID NO 2的核苷酸372-352互補(bǔ))然后用下列溫度模式完成30個循環(huán)1. 1×(95℃2分鐘)2. 30×(55℃30秒；72℃90秒；95℃60秒)3. 1×(72℃15分鐘)如此擴(kuò)增的胞質(zhì)復(fù)合物DNA在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離，與溴化乙錠一起保溫后用紫外燈檢測。結(jié)果若用永久增殖的L929細(xì)胞，利用引物A和B擴(kuò)增LC108同源復(fù)合物的DNA，得到擴(kuò)增的DNA(203bp)，但用MEF或Ehrlich腹水細(xì)胞則不行。 EFC38同源DNA的擴(kuò)增在Ehrlich腹水細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中得到擴(kuò)增的DNA(372bp)，但在L929細(xì)胞的MEF樣品中沒有(表3)。在104小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中L929細(xì)胞或Ehrlich腹水細(xì)胞的反應(yīng)混合物表明，在104小鼠正常成纖維細(xì)胞中，用該實(shí)驗(yàn)可以檢測到有無限增殖潛力的設(shè)定細(xì)胞(L929，EAZ)。若選擇引物對(A，B，或C，D)，也可以確定在細(xì)胞混合物中，這些惡性細(xì)胞(纖維瘤(L929)或腹水(EAZ)細(xì)胞)的分化程度。
表3通過擴(kuò)增某些胞質(zhì)復(fù)合物的DNA來檢測具有無限增殖能力的人或動物細(xì)胞細(xì)胞/細(xì)胞混合物細(xì)胞數(shù) 用下述引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增(a)(b) (a) (b) 引物A，B引物C，DMEF -104- --L929-104- +-EAZ -104- -+MEF L929 1041 +-MEFEAZ 1041 -++/-擴(kuò)增/未擴(kuò)增胞質(zhì)復(fù)合物的DNA實(shí)施例8通過競爭性PCR擴(kuò)增胞質(zhì)復(fù)合物的DNA來檢測細(xì)胞混合物中有無限增殖能力的人或動物細(xì)胞的數(shù)量利用所述的實(shí)驗(yàn)安排，在有有限增殖潛力的正常預(yù)衰老細(xì)胞的混合物中，可以(近似地)確定有無限增殖和特定分化程度的細(xì)胞的數(shù)量。用特異性的引物寡核苷酸，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增胞質(zhì)復(fù)合物的DNA；特異性DNA(待測的)與恒定量的已知競爭DNA競爭。由于是在DIG-dUTP的存在下完成PCR反應(yīng)，因此用修飾的核苷酸標(biāo)記了擴(kuò)增的DNA。通過與單鏈同源捕獲探針雜交，待測復(fù)合物的擴(kuò)增DNA被結(jié)合，然后利用抗DIG ELISA實(shí)驗(yàn)確定結(jié)合的DIG-標(biāo)記的DNA的數(shù)量。設(shè)計(jì)該方法以便可以在為該目的而設(shè)計(jì)的微量滴定板上完成實(shí)驗(yàn)步驟。
1.制備細(xì)胞溶解產(chǎn)物將含有遞增濃度的待測Ehrlich腹水細(xì)胞的原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)和ehrlich腹水細(xì)胞(EAZ)的細(xì)胞混合物(共105個細(xì)胞)溶解在100ul 50mmol/l Tris-HCl，pH7.2，10mmol//EDTA，3mmol/l MgCl2中，通過重復(fù)冷凍和凍融溶解細(xì)胞。以6000g離心10分鐘沉淀核；將蛋白酶K(50ug/ml)加到上清液中，于55℃溫育1小時。然后加熱到95℃保持10分鐘使蛋白酶失活。2.制備特異性的捕獲探針用捕獲探針RNA檢測Ehrlich腹水細(xì)胞，所述RNA含有示于SEQ ID NO29的部分序列(372bp)。根據(jù)已知方法(Sambrook et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor laboratory，2nd edition，1989)在SP6載體，例如pSPT18中克隆DNA序列(示于SEQ ID NO 29之序列的堿基對26-堿基對350)。用SP6-RNA聚合酶，根據(jù)已知方法制備并純化單鏈RNA樣品(Dunn and Studier，J.Mol.Biol.166477，1983；Kassavetis et al.，M.Biol.Chem.2575779，1982)，優(yōu)選的是利用模板結(jié)合的DNase I(無RNase)。用生物素UTP和RNA連接酶在其末端標(biāo)記RNA，并在Sphadex G50柱(Biorad)上，經(jīng)凝膠過濾除去未摻入的生物素UTP?，F(xiàn)在可以用生物素EFC38(28-346)捕獲探針以結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板。3.包被微量滴定板用鏈霉抗生物素蛋白包被適用于ELISA實(shí)驗(yàn)的96孔微量滴定板的底部，洗滌，干燥。隨后，將生物素標(biāo)記的捕獲探針[500ng生物素EFC38(26-246)]加到100ulTE緩沖液(10mol/l Tris-HCl，pH7.5，1mmol/lEDTA)中，于37℃溫育1小時。在微量滴定板上，捕獲探針經(jīng)生物素而與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合。隨后，用TE緩沖液將微量滴定板洗滌數(shù)次。
4.制備EFC38-PCR競爭探針使用PCR技術(shù)的競爭性(定量的)擴(kuò)增需要一種DNA，它與待測DNA競爭與特異性寡核苷酸引物的結(jié)合。為了達(dá)到該目的，制備一雙鏈競爭DNA，它有372bp的長度，與SEQ ID NO 29所示的DNA一樣；堿基對1-25和堿基對351-372與示于SEQ ID NO 29的DNA序列相同。然而，堿基對26-350與SEQ ID NO 29所示的DNA序列不一致但表現(xiàn)為用常規(guī)寡核苷酸合成裝置可以得到的隨機(jī)DNA序列。5.DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物之EFC38同源DNA的競爭性PCR將下列PCR反應(yīng)混合物加到細(xì)胞溶解產(chǎn)物(100ul)(來自1)中以擴(kuò)增待測的EFC38同源DNA12ul 10x Taq緩沖液(200mmol/l Tris-Hcl，pH8.4，250mmol/lKCl，0.5％吐溫20，1mg/ml BSA)；1.5ul 100mmol/l MgCl2；2.5ml DIG-dNTP溶液(2mmol/l dATP，2 mmol/l dCTP，2mmol/ldGTP，2mmol/l dTTP，0.7mmol/l DIG-dUTP)(Boehringer Mannheim)；2U Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)；引物寡核苷酸C和D各100ng(見實(shí)施例7)按照下列溫度模式完成30個循環(huán)1. 1x(95℃5分鐘)2. 30x(55℃0秒；72℃90秒；95℃60秒)3. 1x(72℃15分鐘)隨后，將樣品加熱到95℃保持10分鐘，冷卻到75℃，然后加到預(yù)熱的微量滴定板中，慢慢冷卻到室溫(2℃/每分)。6.定量擴(kuò)增的DNA
用500ul的PBS將微量滴定板的孔洗滌數(shù)次，與抗DIG抗體，過氧化物酶結(jié)合的Fab片段(在PBS中150mU/ml，0.5mg/ml牛血清白蛋白)(由Boehringer Mannheim制造)于37℃溫育1小時。用PBS將孔洗滌兩次，然后與200ulABTS底物(過氧化物酶底物溶液)于室溫溫育1小時。用微量板閱讀器檢測孔中405nm的吸收值。吸收值與來自復(fù)合物的PCR擴(kuò)增的DNA量成正比，因此，與細(xì)胞混合物中的Ehrlich腹水細(xì)胞的量成正比例。實(shí)施例9定量檢測由有無限增殖潛力的細(xì)胞分泌的復(fù)合物有無限增殖潛力的細(xì)胞分泌胞質(zhì)復(fù)合物。因此，對這些分泌的復(fù)合物的檢測可被用來檢測有無限增殖能力的細(xì)胞，特別是檢測腫瘤細(xì)胞。該實(shí)施例說明，在無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中可以測量Ehrlich腹水細(xì)胞分泌的復(fù)合物。由該方法可以特異性的確定特定的復(fù)合物以區(qū)別不同分化程度的腫瘤細(xì)胞。1.制備無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液在TranswellsTM盤(Costar，Cambridge，MA)中培養(yǎng)Ehrlich腹水細(xì)胞和原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞在較低的部分生長，然后用有孔(直徑0.3μm)的膜從細(xì)胞中分離培養(yǎng)物上清液；將上清液收集于上部。分泌的復(fù)合物擴(kuò)散到無細(xì)胞的上層部分。將104，105和106個細(xì)胞的部分放在3ml的培養(yǎng)基中，2天后，從上部得到無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(100ul)。將蛋白酶K(50μg/ml)加到上清液中，于55℃溫育1小時。隨后，將探針加熱到95℃10分鐘以便使蛋白酶失活。2.制備微量滴定板，“捕獲探針”和競爭性DNA已在實(shí)施例8中給出了用鏈霉抗生物素蛋白包被ELISA微量滴定板并制備生物素化的捕獲探針的方法；所用的DNA序列也是實(shí)施例8中的。同樣按照實(shí)施例8中的描述制備競爭性DNA。
3.競爭性PCR擴(kuò)增待測復(fù)合物的DNA將培養(yǎng)物上清液加到包被的微量滴定板中，同時還加入實(shí)施例8中描述的PCR反應(yīng)混合物。再按實(shí)施例8所述，在存在DIG-dUTP的條件下擴(kuò)增DNA。隨后，將混合物加熱到95℃10分鐘，然后緩慢冷卻到室溫(2℃/分)。4.確定擴(kuò)增的DNA用500ulPBS將微量滴定板的孔沖洗數(shù)次，然后于37℃與抗DIG抗體，與堿性磷酸酶結(jié)合(在PBS中20ug/ml，0.5mg/ml牛白蛋白)(由BoehringerMannheim生產(chǎn)的)的Fab片段溫育1小時。每次用500ulPBS洗滌孔兩次。加入NADPH，經(jīng)結(jié)合抗DIG抗體的堿性磷酸酶反應(yīng)以得到NADH。使用含有醇脫氫酶和心肌黃酶的酶循環(huán)(AMPAK_，Dako)，加入INT后，經(jīng)心肌黃酶使NADH反應(yīng)，得到NAD+和甲_。加入乙醇后，醇脫氫酶將NAD+變成酸酐和NADH，后者又可用于經(jīng)心肌黃酶的反應(yīng)。在每個循環(huán)中，產(chǎn)生一分子的甲_。用微盤閱讀器于492nm測量所生產(chǎn)染料的吸收值。
使用PCR技術(shù)在存在DIG-dUTP的條件下，競爭性擴(kuò)增待測復(fù)合物的DNA并用堿性磷酸酶結(jié)合的抗-DIG抗體以及隨后在酶循環(huán)中擴(kuò)增信號從而檢測擴(kuò)增的DNA，使得可以極其敏感地檢測細(xì)胞外分泌的復(fù)合物。測量的吸收值與來自分泌之復(fù)合物的PCR擴(kuò)增、DIG-標(biāo)記的DNA的量成正比，并且與在擴(kuò)散室培養(yǎng)中所用的Ehrlich腹水細(xì)胞的量成正比。實(shí)施例10分離DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物以檢測Hodgkin淋巴瘤細(xì)胞人Hodgkin細(xì)胞系HD 540(L540)和HD428(L428)(Diehl etal.，Cancer Treat.Rev.66，615-632(1982))細(xì)胞于1994年6月29日保藏于在Ma scheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig的德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物(DSM)，保藏號為DSM ACC2177(HD540)或者，從DSM的公共收集中心得到，保藏號為DSM ACC197(L428)。通過重復(fù)冷凍和凍融，在50mmol/l Tris，pH7.2，10mmol/l EDTA，和1.5mmol/l MgCl2中溶解所述的細(xì)胞；以6000g離心30分鐘分離核，將所得的上清液與蛋白酶K(100ug/ml)于60℃溫育20分鐘，隨后，放在氯化銫兩步梯度上；下部(1ml)的密度為約1.80g/cm3，而上部(1ml)的密度為約1.70g/cm3。以150,000g離心10小時后，將沉淀重懸于100ul 100mmol/l Tris-HCl，pH7.2，1mmol/l EDTA中。然后對10mmol/l Tris-HCl，1mmol/lEDTA，pH7.2透析；按實(shí)施例1所述確定在該組分中所得的DNA的數(shù)量。
根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法(Sambrook et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor，2nd edition，1989)，在dNTP存在的條件下，利用Klenow DNA聚合酶使DNA進(jìn)行“填補(bǔ)反應(yīng)”，然后在存在10U連接酶的條件下，連接到pUC19載體中；在E.coli.中克隆所得的重組質(zhì)粒。在質(zhì)粒復(fù)制期間，在細(xì)菌中生產(chǎn)該重組DNA分子的無蛋白質(zhì)拷貝。
因此，可以得到數(shù)個人Hodgkin細(xì)胞胞質(zhì)復(fù)合物的獨(dú)立質(zhì)?？寺?pHD540，pHD420)。當(dāng)相應(yīng)地使用實(shí)施例3-9時，這些質(zhì)?？寺〉牟迦隓NA適用于檢測Hodgkin淋巴瘤的腫瘤形成轉(zhuǎn)化細(xì)胞。所用的DNA序列是列于SEQ ID NO 45-85的序列。
這些序列不與小鼠細(xì)胞中的序列雜交。實(shí)施例11使用抗胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的多克隆兔血清以檢測小鼠腫瘤細(xì)胞用抗胞質(zhì)DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的特異性抗血清檢測小鼠腫瘤細(xì)胞。為了達(dá)到該目的，制備這些細(xì)胞的蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物，電泳分離，放在載體膜上，然后用WESTERN印跡與兔的特異性抗血清培養(yǎng)。用第二抗兔抗體和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測結(jié)合的兔抗體。方法
1.獲得抗血清用DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物(從小鼠L929細(xì)胞的胞質(zhì)中分離的)通過每3星期皮下注射3次來免疫兔；隨后獲得血清。2.獲得蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物在50mM Tris-HCl，pH7.2，10mM EDTA，3mM MgCl2，0.3％NP40存在下溶解L929細(xì)胞(小鼠腫瘤細(xì)胞)和MEF(小鼠正常胚胎成纖維細(xì)胞)。以8000 g離心2分鐘分離細(xì)胞片段，核和膜。將上清液(蛋白質(zhì)組分)存于-20℃。3.Western印跡和檢測反應(yīng)在SDS存在下使L929細(xì)胞和MEF(相當(dāng)于約105個細(xì)胞)的蛋白質(zhì)組分以及分離的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物(1μg)(作為陽性對照)變性；然后根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法(E.Harlow，Antibodies，Cold SpringHarbor Laboratories，CSH Press)，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離它們，接著經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在TBS(20mM Tris，137mM，NaCl，pH7.6)，3％(V/V)吐溫20，5％(w/v)于奶粉中將膜溫育1小時；隨后，加入兔抗血清，然后將混合物再培養(yǎng)1小時。用TBS，3％吐溫20洗滌膜，然后，與山羊抗-兔抗體(HRPO-標(biāo)記的)(1∶5000)溫育。再洗滌混合物并加入檢測溶液(ECL，Amersham.RPN2106，2108，2109，完成放射自顯影。結(jié)果來自L929腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物的抗血清與分子量為約36kD，52kD，62kD，64kD的蛋白質(zhì)和＞150kD的蛋白質(zhì)聚集物反應(yīng)。通過與抗血清反應(yīng)，來自腫瘤細(xì)胞(陽性對照)的分離的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物中還發(fā)現(xiàn)了分子量為52kD，62kD，64kD的蛋白質(zhì)。36KD的譜帶最可能是蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物。
在MEF正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物中，與抗血清無特異性反應(yīng)。與＞150KD的蛋白質(zhì)聚集物的弱反應(yīng)可能是抗血清的非特異性結(jié)合。實(shí)施例12從乳癌分離DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物相應(yīng)于實(shí)施例10中描述的方法，從乳癌的MCF 7細(xì)胞系獲得DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物。對部分核酸測序，示于SEQ ID NOS 59-61中。用這些序列作為探針鑒定并分離含有本發(fā)明復(fù)合物的乳癌細(xì)胞。體內(nèi)或體外復(fù)制核酸后，確定這些復(fù)合物該DNA的完整序列。到目前為止所發(fā)現(xiàn)的序列不與Hodgkin或小鼠細(xì)胞中的序列雜交。本發(fā)明的另一目的是核酸，所述核酸是上述復(fù)合物及其功能等同物的完整序列的部分。序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名BOEHRINGER MANNHEIM GMBH(B)街道Sandhofer Str.116(C)城市Mannheim(D)州BW(E)國家德國(F)郵政編碼(ZIP)D-68305(G)電話0621/759-4348(H)電傳0621/759-4457(ii)發(fā)明題目鑒別有無限增殖或腫瘤形成潛力的人和動物細(xì)胞的方法(iii)序列數(shù)62(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式
(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度203個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO1GATCTTGAGT TTCCTCGTTG TAGGTCTTCC CTGGCTCTGC TCACGCTCTC ACTGACTTCT60CTCAGCTCAG TCACAGTGTC TATTTCTTTC CACTTAAAGA TGTGCATTTT TATTTGATGC120GTGCAGGTGT TTTGCCTGCA TGGATGGCTG TGCACCATGT ATGGGACCTG GTGCTCTTGG180AGGCCAGCAG AGGGCTTTGG ATC203(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO2GATCTTTTCT TGAAAGTACG TAAGCCTGGG GTTTTAATTC TCATCTTAGA ACACAGTGTA 60AAAAGGATC 69(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度224個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO3GATCTTCAGT GTCCATACAC TCAGATTCCT GATTAAATCA AAGCATCAGA ACCACTCCCC 60CTGCAAAATG TCCCAAAATG TAAAATCAAT TGATGTACAA CTCAGAATAC ACCACTCTGA 120GGCATATTTT CCAGGGACTC TAACCTACTT CAGAAGTACA TGGTACTTGC TTCTCTATTA 180CAGCATAATA GAGATGAGCA ACATAGTGCA CTTACAAACA GATC 224(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO4GATCAGACCT CTACCTTCAC CCATGAGGCT TGCTTGCAGC AATTAAGATC50(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度55個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO5GATCTTTAGC TCCCTGGATA CTTTCTCTAG CTCCTCCATT GGGGGCCCTG TGATC 55(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO6GATCTTTCCA AGACTTTTAT CATGAATGGG TGTTGGATCT TGTCAAATGC TTTTTCTGCA60TCCAACGAGA TC72(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO7GATCCTGGCA TTACCCTATC CTGCATTAAG GGGGGAACAG GAAGATC47(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO8GATCCATTCT ATCTCCACCC CCACCATGAG GATC34(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度176個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO9GATCTTCGCC GCCGACCTGA CCTCGATCGA GGTGGCGCNN GGCGTCGATC ATATCATCT 60TGGCTGGGTG TTCTTCGCGC TGGTGATGGC AGCGGTGCTG GCCATCGGCT GGCAGTTTTT 120CGATCGTTCC CCCGATGATC CCATCACTGG CCAGGCATGG AGGCCCACAG GGGATC 176(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO10GATCACGCCG GACGAAGCCT ACGACATCAC CGTCTACCAG ATC43(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO11GATCTCCTCG CCTCTCTATC CCCAGCACCT GCCAAGAGGA TC 42(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度110個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO12GATCTGGTCG ATGCCGATTG CTGAGGTTGG TTGGTGCGGT GATTCCTGTT AATTTCCTTA 60GAGGAGGGTG GGTTTGCAGT GTCATGAGAA TGGAGGGTCG GGATTTGATC110(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO13GATCAAAAAG CGTGGAAAAA TTTGAATGTC ATGTCGAGCT GGTATCGGCT TCTGGAATAC 60CGAAAGGATC70(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度88個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO14GATCTGGGGC CAGTGATAGC CATCTCTGTN CCTGTATGTG CCCGGACATC CTGGGGATAA 60AGAGAGATCC TTCATGTGGA GGAAGATC88(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度75個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO15GATCTTTCCA AGACTTTTAT CATGAATGGG TGTTGGATCT TGTCAAATGC TTTTTCTGCA60TCCAACGAGA TGATC 75(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度94個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO16GATCCGTCCT CGCTGCCGTG CRCCGCCTTG CCATGGGAAC CGTGTCTGGG CCCTGTGTCA 60CAAGGTTCCC CCCGGGATGA CAACCGTTGT GATC 94(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO17GATCTAACCG TGGAAGGCAG CGCCAGAGAG ACTGAATCAG GAGGATC47(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度94個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO18GATCTGAGTT CGAGGCTAGT CTGGTCTACA GAATAAGTTC CAGGACAACC AGGGCTGCAC 60AGAGAAATCC TGCCTCCGGA AAGGAAAAAA GATC 94(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度202個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO19GATCTTGAGT TTCCTCGTTG TAGGTCTTCC CTGGCTCTGC TCACGCTCTC ACTGACTTCT 60CTCAGCTCAG TCACAGTGTC TATTTCTTTC CACTTAAAGA TGTGCATTTT TATTTGATGC 120GTGCAGGTGT TTTGCCTGCA TGGATGGCTG TGCACCATGT ATGGGCCTGG TGCTGTTGGA 180GGCCAGCAGA GGGCTTTGGA TC 202(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度80個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO20GATCCATGAC CACTCTTAGA AGCTGGTCTG GGTCTGAAGG GAAGGGGTCT TCAGAAGTCC 60AGATGTGTGTGAACTGGATC 80(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度59個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO21GATCTGCTCT ATCTCAAATG GCATTCATTC CAGGCAGCCT ATGAAAGGAA CACTTGATC 59(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度233個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO22GATCAGCTCT CCTGCTCTCA GGACCCTAGG GCCAGGTCTC CTACCTGCAG CAGGTTATGA 60GGAGTAAAGG GGTCTACCCC ACCATAAGGA GATGAGTATG CCAGTTCCCA TGTTCACATT 120CTTGAGGACA GCTCACTTGT ATCTCCCATG TGAGGGGCTC ACTCTAAGGA GTATTACAAC 180TTGACTGTCA GGTGGCATCC AAGCATCTCT CTGCTGCTAC ATGGCCAAGG ATC233(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度282個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO23GATCTCAGCT TTTGATAGAC TGAGGAAGAA GGGCCTCCTA GGGTACAAAT GTAAGTTTTA 60TTCACCCGAG GTAATTTCCA GCTGCTAACC TGGAAGCTTC TACCCTCAGT AAAATCTTAC 120CTAGACCTAG AATGTTTTTC AGCCTAAGAC TTATTGCAGA ATAATGCTCA CCCTTTCTAG 180GTTCATTCTG TGCTGACTGG TCAACTCAGC TATGCAAATT GCTGACTGAC TTAAGCAGGT 240TCTTCAGCTT GGACTGACGG CCCGCTTGGC CTCAGACTAC TT282(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度125個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO24GATCTTCATA AACGCGGGGT TCGGTCCCAG GGCTGGCACT CTGTCGTAGT ACCCCACCGA 60GACCCCTATT AGGCCAATAC AGCACCGCGN NNCTTCCTTT TCCCCACCCC ACCCGGCCTA 120TAGTT 125(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度118個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO25GATCTTTGGC GCTGCGCAGA AGCCCAGTCC GAGGCGCGCG TCTTCGACCG GGACCGTGCT 60CCGCGGCGNG CTGCCAGCCA AAGCCCAGGT CGACAGGTAG CCGTCGCGGA ACTCGATC118(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度500個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO26GATCTGAGCA AAAGTTTTCA AAATTCTGGA ATTAGAAAAT TTGAAGGTCG AAAATACTTA 60TATGGAACAT GAAGGACTGT GCTTTACACT TATGTGGTTT GTTGTTGTTT ATCTGTTATG 120GTTTTGTTTT TGCTTTGTTT TGTTTTTCTG GTGCTGCACA TAGGCCCTGA AGAAGCTTGG 180TTGCCGAGAC AAGCCACCAC AGCACACGGA ACTCCAGGGC TACTCTGATC CTATTTTTTC 240ATCCATTCAG TTAGCCTGAA TCTTTTTTAT TAGGGAATTG AGTCCATTGA TGTTGAGAGA 300TATTAATGAC CAATGATTGT TAATTCCTGT TATTTTGATG GTGGTGGTAG TAGTGTGTGT 360GTGTGTATGT GTGTGTGTAG TATTTCCCTT CTTTTGGTTT TGCTGATGTG ATATTTATTT 420CATGTTTTCA TGGGTGTACT TAATCTTCTT GGGTTGGAGT TTTCCTTCTA CTAGGGATAA 480ATTTGTGGAC AGATATGGTT 500(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征
(A)長度592個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO27GATCCCGGAC TAGGATTAGC CTGTCTATGC CAGCAAATGA GTCAGGCAAC TGATGGTGAG 60TCCTTCAGGT GTATATGTGT GGACAATTAA TTTTTATTAA AAAAATAAAT AAAGCCAAAG120GGAAATGTAT ATTTTAATGA CCTAGGGTAT TAATTTTTTT GAAAGTCACA CATCAAAGAC180TAGGAAAAGC CACCAACACC CTAAGAATGT GATTTTATCC TTTTTCCTCT GTGTGGGATG240TGTTTTAGTT TAGGTTTCTT TCTGTTTCAA TTTGGACCTG TAGAGGAATG ACCGTCACTG300TCTTATTCTG GAGGGAAGTC CCTGATAGTG CCCCACTACA CACACACACA CACACATACA360CACACACAAA TTAGGTATTA AAATATGGTT TTAAGAGTTT TAAAAATGGA TTAGCAGTGA420TTCAATTAAA ATTAGAAAAG AACAACAACA AATATGTGAG AGACTTGCCT CTCAGTGACC480CCAGGCCCTG TCAGCTGATA GTGGGTGGTA ACCAGACAGC CCATTTCTGT GTCGATAGAT540GAACTGTGGG AGAGTGACTC CAGAAAGAAC CAACCAGTGA GGGGTCGAGA TC592(2)SEQ ID NO28資料(i)序列特征(A)長度255個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO28GATCCCTTTA GCTCCTTGGG TTCTTTCTCT AGCTCCTCCA TTGGGAGCCC TGTGATCAGC 60CTGTACCACA TAGCAAATGT CAGGCCTCTT GGGGGAGTAT TGCAAGATAT TGCTACAAAT 120AACAACAAAA GCAAACAAAG TTAACGTTTG CATAGCAACC TCCACCCCCC CAAGATTATA 180CCTGTACATA ATTTATGTTC AAAGACAGTG GCACAGGTCT GGCAAGATGC CTCACTTGAG 240AGAAGCTCAC AGATC 255(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長度372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO29GATCCAATCA GCTCAGCCAC CCCCAGCTCT CCTGTATGTA TGGCTCCAAT GCTGTTCATC 60CCTCAGCATA AATCAATCAT TTGGTTTAGA TTCCTCCCTT TGACTTATTG CTACTATTAG120TATCAGTGAC TCTTCAGCCG ATTCTTTTCA GACATTGGAA CCCCAGCCTC AGATCACAGT180TGTAGAACAA ATATTAAAAG AGTAAATTAT TATATCATTG AACATTCAAA AGTGCTTTGC240AGTCATTGAC ACATAATAAT AATGAAGCCT AAACAGTAAC ATGAAAATGT GGAATTGTAT300TAATGTAAAA TCAAGGCCTG GGGNATAGCT CATTGGTGGA TGTTTGGCTA TCATGTGGGA360GGGCCTGGTT TT372(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長度128個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO30GATCTTGTCA AATGCTTTTT CTGCATCCAA CGAGATGATC CAACACCCAT TCATGATAAA60AGTCTTGGAA AGATCATGGC GACCACACCC GTCCTGTGGA TCCACAGGAC GGGTGTGGTC 120GCATGATC128(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長度184個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO31GATCAGCAAC AGATTACTAC GAAAAGGCAA GCAAACAAAC AATAACAATA ACAAAACAAA 60CCACTGTGTT GGATTTACTG ACTGCCTGAA ACAAATTACC CAAAGTATAG ACCTCAAAAT120ATCCATGTGA ACAGGGAAAC AAAGCACACA GACGAGCAAA AGTGGTCTCG AGGTGCTTAT180GATC 184(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長度372個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO32GATCTAATAC CAATACTCTT CAAACTATTC CACAAAATAG AAACAGAAGG AACACTACCC60ATTCATTCTA TGAAGCCACA TTTTTGCCAT GTATTCTCCC TTCAAAATGG AAAGGTTTCT 120GTCTAATCAG GAACTTGTCA CAATTTCCTT TCTTGGAGGA CTTCATAAGA GATTTTTTTC 180TACTTCTACC ACATTTAAGA TTCCAAACAG ATTTTAAACG GTTGTGTTCA TATTACTTTA 240GTTCAGAAGA TATCATGTAT ATATAAGAGG CATTTAACAA TTATAAATTA TTTGGATGAC 300TTAAAAATAT CAATACTGAG TTGTATATTT TAAAATAAAT TTTATTGGTT TTAAAAAAAC 360AACCATAGGA TC 372(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長度184個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO33GATCTCAGTT TTTAAAAATA AAGAAAATGC ATTCTTTTCA GAAGGAACAT GAAGATCTAG 60AAGAAGTTCT GTGGCTAGAT GGATTTTGAA AGGTCCCGAA AGGTCCCGAA AGGTCCGGGG120GNNGCCTGCT TCATGACTGT CACACACTTC AGTTGTCCAG GGAAGAGATA GAAAATGTGT180GATC 184(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長度385個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO34GATCTCGCCT TGCAGATTTT TTTACCAACT GCCAGCCAGA GTCAAGGTCT GTCAGCAACT 60GTCTTAAGGA GAACTACGCA GACTGCCTCC TGGCCTACTC GGGACTGATT GGTAAGACCA 120GGGGAGGGAG GGAATGGCAA AGAAATCTGG ATTACAGATC AAGATGGGAC AGTTTAGCTT 180CTGGTGACAG GCTAGATCCG ATGCCCTCTT CTGGTGTGTC TCAAGACAGC TACAGTGTAC 240TTATATACAT AAAGTAAATA AATATTTTAA ACAAAACTTT TAAAAAAAAA AAGATTGGCT 300ACAAAACTGA CCTATAGGGC TCCTAGCAGT CCTTGTCACC ACATAGCTGC AAACCCACCT 360AGGGGAAAAC TGAGGCAGGA GGATC 385(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長度371個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO35GATCTAACTT CCCTGTCCTG ATTGCTTTCA TGTAGAAACA TTCTGCAGCC AGAAGTGGCA 60GCACACAGCC CCGGTCCCCA CATCTGGGAG TCTGAGATAG ATGGAGCCTA AGTTTGAGAA120CTAAGTACTT TACAATTGCA GGCATAATTG AAATTGAGCT GCCTTCTGTG TCTTCTGGAC180AAAGTTAACG TGATTTATAG GAAGGCATTC TGTGATCCTT TTCTGGTTGC ACCATCCTGT240TCTCTCCAGG CCTGTGAATC ACAGCACACC AGTCCACATG TGCCTGCGCT GCTCTGTTGT300GGCAAGTGCT CCATCAGACT GGGATTTCTC TGCCAGGAAG GCAGGCTGGT CCCAGGCTAC 360TTAGGAAGAT C 371(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長度396個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO36GATCTAGAGA GGTTAGGTAA AGAGTAGAGC TATAAATATA AGCCTGGGTT TCCCTGGGAA 60GGAGTATTAA TTAGACTAGA TTCTCCATGA GCTGGGGAAG GGGGTAGAGG GNNGGGGAAG 120GGAAGAAGAC AGGAACAGGA GAGATATTGT GTGTATGTAT GTGGTGGGGT GGTGGAGGGA 180AAGAGTGTAG NNGACTGGCA GTCAGATTGG GAGGCATTGA GTGATGTAGA ACTAGTGTGG 240TAGAACTTGT GACTCTCTGA GTGTAACACT ATTGCAGACT CACTAATGGA GGATTCAGAG 300TCTGATTTGT CACTTTTTGT AGTCAGGCAA GGCTTCCAGC GGAAGCTGTG GGCTACACTT 360GATTGCGCTG TTGGCTGAGG AGGACCCATG GAGATC 396(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征
(A)長度433個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO37GATCCAAGGG AGTGTTCCAG TTTTTCTGGA AGCTGAGATG CTCCAGCTGG TAGCTTGAGC60TTCACAAAGA TGCTGCCCTA ATAAATGTCA AGCACCCAGG GACTTCTCAG GAGCACATGC 120TATGCTTAAA GGGGCCACAG TGAAATCTTA GACAAAGATG GATGGAGGTC TTGGCTTCTT 180TTGTCTGTCT CTGTCTCATC TTTCTCTCTC TCTCTGTGGC CTGTATGTAT GCATGTGCCT 240TGTGCCAAGG AGGGCAGAAA AGGGTGTTAG ATCCTCCTGC CTCAGTCTTC TACATGCTGG 300TTTTGAAGGC TGGTGCCACC ATTCCCAGCT CTCAAACTTG CTCGTGCCTG TCCCCTTTAT 360AGAGGATAAG TTAGCTAAAT TGGTTCTCAT TATCCTTCTG TTTTCTGGCT TTTGGACCAT 420CAGTGGTTTG ATC 433(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長度434個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO38GATCTGTATA AAGCACAAGG AGGCTTTATC TGTCTGGACT CATCTGAGGA TTCTTTGGAT 60CACTATTTAG ACATGTTAAA TTGATTAGAG AAGTCATTCA CTGTCATTGG GTACCATTTG 120TCACATCATA AACAGCTGCA GTGTGCTGCC TCCAAATGCA GAAGGACCAA CAAATAAATC 180ACATCAAATG GTGGGAGTAG ATGCTATCTT TCATCTATAA TTGGTATAGC CTTTCCTGTC 240ACATTGCTCA TTCTTATGAT TCTAGTGTGA TTGACAGACA GGGAAAGGGC AGCCTCTGTC 300AAAGATGTTC AGAGAGTGTG TGTTCGGGTG ATGTACCTGC TAATAGATAT CCATCATAAT 360ATTACATTAA TGTCACCATG CATCAAACAT ACAACTTACC CATCTAGGTA TCTGATGTTA 420GACCCATAAG GATC 434(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長度128個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO39GATCCAGCTA CAAATCTCAC AAAACACTCT GCCTGGGACA GAGGGTGTGA GTTGTAGTGG 60TCTGAGGCAG GAAGCTCTGA GGCAGGGCTA GAAGAATTAC CTTGGAATTA CCTTCAGAAG 120ACAGGATC 138(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長度185個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO40GATCAGCAAC AGATTACTAC GAAAAGGCAA GCAAACAAAC AATAACAATA ACAAAACAAA 60CCACTGTGTT GGATTTACTG ACTGCCTGAA ACAAATTACC CAAAGTATAG ACCGCAAAAT120ATCCATGTGA ACAGGGAAAC AAAGCACACA GACAGAGCAA AAGTGGTCTC GAGGTGCTTA180TGATC185(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長度129個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO41GATCAAGTGA CCATAGGTGT ATGGATTCAT CTCAGGGTCT TCAATTCTGT TCCATTGGTC 60TACTTGTCTG TTGCCATACC AGTACCATGC ACTTTTTATC ACAAGTGCTC TGTAGTACAG 120CTTTAGATC 129(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長度275個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO42GATCTGACAC CCTCTCTGGT CTCTCTGGGC ACTGTGCTCA CGTGCTCCTC AACTCCCATN60ACACGGAATT AAGAATCAAA ATATAAAATC TATAAAAAGA AAGGAAGGAA GGAAGGAAGG 120AAGGAAGGAA GGAAGGAAGG AAGGAAGGAA GGCAGGTAGG CAGACAGGAA GAAAGAAAGA 180AAGAAAGAAA GAAAGAAAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAAGAA GAAGAAGAAG 240AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAA 275(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征(A)長度225個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO43TCCACATTCT CCTTTGCTCT ATTATCCTTT CCTTTCCACT ACCACTGGTG AGTGATGGGC60TAGAGGTTAA AGCTTATATA AACTCTTATT TAAAATAAGT TTTAAAAAAT TTAAGTCTAT 120AAAAGCCAGG AAAAGCAACC AATAATCAGC ATTCTTCCAT GCCCTCTGCT TCAGTTTCTG 180CCTCGAAGTT CCTGCCTTGA CTTCCCTCAT TAATGCAACA TGATC 225(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長度403個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO44GATCTGGCCT CCCTCTTCTT GCCTTTGCAA GAACTCTATG TACATGATAT GTGTACACAT60GCAAGCAAAA TACCCATGCA CACAAAATAA GGGGGTGGGA GGAACAGTCC CAGAGCGAAT 120GCGTGAATTA AGACAAGCCA GGTGTAGTGG CACAGCTCTG TGGTCCTAAT GCTTGGAGAA 180TATAATCAGG AGGATTTCTA GCTCAGTGTA TAACAAGACC TTCTCCTAAG AGAATAAAAA 240TAGATGTAAA TATAAATAAA TAAACATAAA ATAAGACAAT TTGTAAACTC CTTATGAGAA 300CTTGCTGTGG CTTTACTGGT ACATAGACCA GTAAGATTTC AGTGTAAAAG ACGCTCTCTG 360TAAAGGGTGA GNCAAAGGGT CCAGGAGAGG CTTTCCTTAG ATC 403(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長度543個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO45GATCTGAAAT TTTGAATATA TAAATAACTA ATCTTTACTA CCTTTAGATT GATGTCTTCC 60AAGATGAGTA TGGTTAAATA ATATTCAAAA ATCTGCATGC TAAAGATTTG TCTCAAGCAA 120GTCACTGTTG GGAACTAGTT ATATTGTAAG AAGAAGTTGG GTCATAAGGA CACAGCTTGA 180AAGGCAAAGT AGGACTGCAC CCACTTTCTC AGCTTTTATA TTGCTTCATG ACTAGGAAAT 240GAAAAGTTGT CATGTGTCAC CTATCATAGC CATCCAGCAC CCAAGTCAGT GGCCAGAAGA 300CAGTGTGTCA GCTTGGGATG GAATGGAATC TCAAAACTGT CAATCAAATT AAACTGTGTG 360TGTGGAGGGC TGTATAAGTA TGTACATGTG AGTTTATGTT TGTATGTACA TAGATGCACA 420TGTATGTGTG TATATACATG TGTATCATGT GTGTGTGTGT GTGTGTATGT GTATGTGTGT 480GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTAG TACAGAAATC AATCATGGGC ATTATTCCTG 540ATC 543(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長度76個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO46CAAGAAATGC TAGAGCTAGG GTTCCTTTTA AAATTGTCGA TGTTTCTGAT GAAAATTATT 60ATCAAAAGAT TAATAC 76(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長度114個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO47GCCTTTATTT ATTACCAAAA AGAAAAGTAT TTTCTTTAAT TTGGAAGTTT TCACAAAAGG 60CAATATCAAT ATTATATTGT AACATTTAAG AATTTTAAAG CCAGAAATTA AAGA 114(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長度88個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO48ACAGGATCAC TTGGGGACAT CTCAGGTAAC CGTGTTTTCA AAGGTATGAC ATGCCAGGTC 60ACTTAGGAGC TGTTAGAACA ACAGTTCA88(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長度66個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO49CTTTTTAAAG TAATTAGATT TGTAACATAA GGTATTTTAA GAAAATAAAT ATTTTGATTG 60GTTAGT66(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長度105個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO50ATGTCAACAT TTTTTTCTTG AACTAGTGCT AATAGAAGAT CAAGTTGCCT TATTTTTAAA 60ATAAAATTTA GTTAAAATTT TGTCAAAACC CTTTAATTTT ATTTT 105(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長度52個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO51CCAGATTCTC TTGCTTTTTC AGCTGTTTTA TCAGTACAAT TATGTGCTAT AA52(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長度202個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO52CGGACCTATT ATCCTTAATG AATTACTTAA AGTTGCTGAC ACTCGTTCAG TTCAAAACTA 60CTTATTGAAA GAAGTACAAA GACTTTATCG TCTTCAAGGT ATCACAATTA GTGATAAATA 120TATTGAAATG ATTATTCGTC AAATGCTTTC AAAAATTGTT ATTACTGATC CAGGAGATAG 180TAAATTCTTT AGTGGTAACTTA 202(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征(A)長度170個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO53AAGAAGATTA ACTTACAAAG ATTTTTTGGA AAAATATAAA CTTATTATGG ATAAAAATAC 60TATTCTAAAA TTCAAATCAG ATAATGATAA ACTTTATGAA TTTTCATTAG AAAGCTTTAA 120AGAAAACGAT AAATATAATT TCATATGGCA GAGATTTGCA TAAAAGCAAA170(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長度188個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO54TTGAGTTTTA TTAGTTGAAG TTTTAAAGCG CTAGTACAAG AAAATTTTTC AGAAAACGTT 60CTTATTGTAC TTTGAACGTG GTTGTAGAAA TTTAAAAAAC ACACTAGTTA TTTGAGGATT 120CTGTAGTGAA GGCGGACATG AACTCAATTA ATAATAATTA TTTCGGCGAC GATAAGGACG 180AACATTTT 188(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征(A)長度230個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO55CTTTAACAAT TCTTACATTT AAAACTTCTA CTAATACATC TAAATGTTTT TTAACTCCAT60GGCTCGAGCT TAAGCATTAG TACCAGTATC GACAAAGGCA CACATTTAAC AATAGGCGAG 120TGTTAAGGTG TGTTGTATGC TCGGCCTTCG TATTTCACAT TCGGACCCCA CGGATTACTC 180ACTCGATTGA GTGTAATTAA CGCAACGCGA GTGACGGCGA AGTCAGCCTT 230(2)SEQ ID NO56的資料(i)序列特征(A)長度139個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO56CACTTGTAGG TACTACAGTT GTAAAAAAAG AACTTGATCA CGATTATCTT CTAGTTCAAC 60GGAATAAAAA TTTTATTTTA AATCAATTTT AAAACAGTTT TGGAAATTAG AAAATAAAAC 120CCATGGCTCG AGCTTAGCA 139(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征
(A)長度225個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO57ACGTCCGTAC GTTCGAACCG CATTACTACC AGTATCGACA AAGGCACACA TTTAACAATA 60GGCGATTGTT AAGGTGTGTT GTAAGCTCGG CCTTCGTATT TCACATTTCG GACCCCACGG 120ATTACTCACT CGATTGAGTG TAATTAACGC AACGCGAGTG ACGGGCGAAA GGTCAGCCCT 180TTGGACAGCA CGGTCGACGT AATTACTTAG CCGGTTGCGC GCCCC 225(2)SEQ ID NO58的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO58ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT GG 22(2)SEQ ID NO59的資料(i)序列特征
(A)長度215個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO59CCCTAAAATT AAAGAATTTA AAGAATTAGT TAAAAGCAGC AAAGAATTAT TCTTACAAAA 60AATACAAGCA AAATTTGAAA TGACTAAAAC GAGATTCAAG AATCAAGCCT TGCATTGTTT 120CAATAATCAA TTAGCAACTT TTTCAATAGT AAAAGAAAAA GTTATTCAAC GTAATCCATT 180AAAATATTAG AAAGTTTCGA AGTTACAATG AACAC215(2)SEQ ID NO60的資料(i)序列特征(A)長度192個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO60TAATTGAAAA ACATGTTGAT GAACTCGATA TGGTAGAAAA TTAAGTTACA TTTCAAAAAA 60TAGTTGAAAT TGAACAAAAT AACAAAATTA ATAAACCAAC AAAAGTAAAC ATTGAAAACG 120TTTTTGAAAA AGATTATAAA AATTACCTAA TGTAACTTAT TGAAAAAGAA AATGATAACT 180TTTTCAACGA TT 192(2)SEQ ID NO61的資料(i)序列特征(A)長度91個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO61ATGACCAAAA TAAATTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG 60ATCAAAGGAT GTTCTTGAGA CCTTTTTTTCT 91(2)SEQ ID NO62的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)序列描述SEQ ID NO62NNAAANTNTN GAANTGTANN ANTGNAA 2權(quán)利要求
1.適用于檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的DNA-蛋白質(zhì)-復(fù)合物，通過分離密度為約1.82-1.89g/cm3的轉(zhuǎn)化的人或動物細(xì)胞胞質(zhì)的無線粒體組分和從該組分中通過用酚提取和乙醇沉淀分離復(fù)合物而得到所述的DNA-蛋白質(zhì)-復(fù)合物。
2.適用于檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的蛋白質(zhì)，通過用DNase I處理權(quán)利要求1的復(fù)合物，然后層析分離釋放的蛋白質(zhì)可以得到所述蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其分子量為52kD。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其分子量為62kD。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其分子量為64kD。
6.適用于檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的抗體，通過用權(quán)利要求1的DNA-蛋白質(zhì)-復(fù)合物，權(quán)利要求2-5的任一蛋白質(zhì)或權(quán)利要求7或8的DNA免疫動物可以得到所述抗體。
7.適用于檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的DNA，通過克隆或酶促復(fù)制權(quán)利要求1的復(fù)合物的DNA可以得到所述DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA，所述DNA含有示于SEQ ID NO 2-28或SEQ IDNO 30-61的DNA序列之一或與這些序列之一雜交。
9.通過從轉(zhuǎn)化的人或動物細(xì)胞中分離權(quán)利要求1的DNA-蛋白質(zhì)-復(fù)合物，然后克隆或酶促復(fù)制該DNA-蛋白質(zhì)-復(fù)合物的DNA而得到權(quán)利要求7或8之一的DNA的方法。
10.通過將人或動物細(xì)胞基因組基因庫或cDNA庫與示于SEQ ID NO 1-61的DNA序列雜交，然后分離雜交的DNA而得到權(quán)利要求7或8之一的DNA的方法。
11.通過在存在Zn或Na離子的條件下，將人或動物細(xì)胞的DNA與權(quán)利要求2-5之一的蛋白質(zhì)結(jié)合而得到權(quán)利要求7或8之一的DNA的方法。
12.通過用寡核苷酸起始分子，酶促復(fù)制人或動物細(xì)胞的DNA或RNA組分而得到權(quán)利要求7或8之一的DNA的方法，所述的寡核苷酸起始分子與部分示于SEQ ID NO 1-61的序列或其部分同源。
13.通過化學(xué)合成示于SEQ ID NO 1-61的序列之一或該DNA序列的部分而得到權(quán)利要求7或8之一的DNA的方法。
14.得到權(quán)利要求2-5之一的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，用DNase I處理權(quán)利要求1的復(fù)合物，根據(jù)分子大小經(jīng)層析或電泳分離釋放的蛋白質(zhì)。
15.檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的方法，其特征在于在密度為1.82-1.89g/cm3的胞質(zhì)的無線粒體組分中檢測權(quán)利要求1的復(fù)合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于在抗原識別反應(yīng)中使用權(quán)利要求6的抗體。
17.通過將待測細(xì)胞的DNA組分與權(quán)利要求7或8之一的DNA雜交而檢測有無限增殖或腫瘤形成潛力之人或動物細(xì)胞的方法。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于雜交是按原位雜交完成的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于用與權(quán)利要求7或8之一的DNA雜交的寡核苷酸從細(xì)胞溶解產(chǎn)物或這些細(xì)胞的DNA或RNA組分酶促復(fù)制核酸。
20.用權(quán)利要求15-19之一的方法檢測惡性腫瘤，其中，使用人或動物的活檢細(xì)胞，組織切片或體液分泌復(fù)合物的細(xì)胞作為樣品材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了適用于檢測有無限增殖和腫瘤形成潛力之細(xì)胞的DNA-蛋白質(zhì)-復(fù)合物，DNA序列和抗體。本發(fā)明還公開了得到所述蛋白質(zhì)或DNA的方法和用所述蛋白質(zhì)，DNA序列或抗體鑒定有無限增殖和腫瘤形成潛力之動物和人細(xì)胞的方法。
文檔編號A61K49/00GK1129958SQ94193236
公開日1996年8月28日 申請日期1994年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月15日
發(fā)明者H·J·阿肯, W·艾伯特, H·容弗 申請人:曼海姆泊靈格股份公司