本發(fā)明涉及臨床消毒技術(shù)，具體涉及一種新型免洗抗菌凝膠的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耐藥細(xì)菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的問(wèn)題，也是造成重癥感染死亡的首要原因。2014年世界衛(wèi)生組織《全球抗生素耐藥報(bào)告》發(fā)出警告，耐藥致病菌在全世界范圍內(nèi)繼續(xù)蔓延擴(kuò)散，多重耐藥和新耐藥細(xì)菌持續(xù)不斷出現(xiàn)，耐藥菌感染所致疾病的死亡率依然不斷攀升。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(cdc)最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年耐藥細(xì)菌感染的人數(shù)高達(dá)200多萬(wàn)，有耐藥菌感染所致死亡人數(shù)達(dá)23000余人，每年用于對(duì)抗耐藥菌感染的費(fèi)用高達(dá)350億美元。我國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(carss)最新監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，目前臨床感染常見(jiàn)的致病菌已經(jīng)對(duì)大多數(shù)一線主流抗生素產(chǎn)生耐藥，特別是臨床分離的甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(mrsa)和甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌(mrse)檢出率依然較高。在我國(guó)廣州地鐵檢等公共設(shè)施超級(jí)細(xì)菌耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(mrsa)的檢出率為2.5％。為了嚴(yán)格控制感染，加強(qiáng)個(gè)人衛(wèi)生防護(hù)、去除手部細(xì)菌接觸是有效預(yù)防耐藥菌感染和傳播的重要措施。特別是醫(yī)院中人流量大、耐藥細(xì)菌分布密集，患者和家屬、以及醫(yī)務(wù)人員在就診和治療等過(guò)程中，互相接觸的機(jī)會(huì)較多，做好手部皮膚的清潔與消毒是防止醫(yī)院感染的重要措施，以及術(shù)前進(jìn)行手部消毒對(duì)于防止手術(shù)患者的醫(yī)院感染起著至關(guān)重要的作用。因此，研制能有效殺滅多重耐藥細(xì)菌的免洗消毒凝膠具有重要臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。

目前免洗消毒凝膠的種類繁多，其中皮膚消毒劑的成分及含量各有不同。免洗消毒凝膠所采用的溶劑主要為易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，常用的為醇溶劑，尤其采用乙醇、異丙醇為最多，但是這些成分存在消毒作用時(shí)效不長(zhǎng)、效果不理想、對(duì)皮膚刺激較大、易燃等缺點(diǎn)。此外，傳統(tǒng)的抑菌或抗菌凝膠或洗手液不能有效殺死耐藥細(xì)菌，抗耐藥細(xì)菌效果較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種免洗抗菌凝膠。

本發(fā)明的免洗抗菌凝膠的制備原料包括：3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素、卡波姆、甘油、乙醇和水。

進(jìn)一步，免洗抗菌凝膠由3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素、卡波姆、甘油、無(wú)水乙醇和去離子水制備而成；其中3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的質(zhì)量/體積百分比為0.1％、卡波姆的質(zhì)量/體積百分比為0.6％、甘油的體積百分比為5.0％、無(wú)水乙醇的體積百分比為45％，去離子水的體積百分比為50％。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述免洗抗菌凝膠的制備方法。

本發(fā)明的制備方法包括：在甘油、卡波姆和水的混合溶液中加入配方量的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素乙醇溶液。

采用試管法檢測(cè)免洗抗菌凝膠的最低抑菌濃度，以市售潔芙柔免洗消毒凝膠為對(duì)照，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌為抗菌對(duì)象，進(jìn)行最低抑菌濃度的檢測(cè)。結(jié)果表明本發(fā)明制備的免洗抗菌凝膠對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明顯的殺菌作用，對(duì)上述四株細(xì)菌的最低抑菌濃度為15.625‰(v/v)，此時(shí)3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的濃度為16μg/ml，對(duì)耐藥細(xì)菌的殺菌活性強(qiáng)于對(duì)照凝膠的殺菌活性。

采用試管法檢測(cè)免洗抗菌凝膠的殺菌曲線，以金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐藥菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302)、usa300(lac)，中度耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)為檢測(cè)菌進(jìn)行殺菌活性的測(cè)定。殺菌曲線結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，凝膠濃度為15.625‰(v/v)對(duì)上述四種菌株有明顯的殺菌作用，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)逐漸降低。

采用mtt法檢測(cè)化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范圍內(nèi)對(duì)人表皮細(xì)胞和人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示在上述濃度范圍內(nèi)化合物對(duì)人表皮細(xì)胞和人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有毒性。

在sd大鼠完整皮膚，連續(xù)涂抹免洗抗菌凝膠14d，給藥側(cè)皮膚均未見(jiàn)紅斑和紅腫，與對(duì)照側(cè)皮膚比較未見(jiàn)異常。試驗(yàn)期內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物受試側(cè)皮膚最高積分均值為0，刺激強(qiáng)度屬無(wú)刺激性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的有效成分3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的核磁共振圖譜；

圖2為本發(fā)明的免洗抗菌凝膠的殺菌曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的合成路線及方法為：

a：將適量的4-羥基香豆素和無(wú)水乙醇混合后加熱至4-羥基香豆素溶解；

b：加入3-溴-4-氟苯甲醛，加熱回流；

c：有固體顆粒析出，繼續(xù)加熱，待反應(yīng)結(jié)束，冷卻、抽濾，再用乙醇重結(jié)晶，最終得純白色顆粒狀結(jié)晶。

結(jié)構(gòu)鑒定：

利用質(zhì)譜(ms)、核磁共振波譜(nmr)、紅外吸收光譜(ir)和紫外吸收光譜(uv)等有機(jī)波譜，對(duì)合成的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素進(jìn)行分子量、結(jié)構(gòu)和純度等鑒定。

鑒定結(jié)果為：

3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素

3,3′-(3-bromo-4-fluorobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)

1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.885-7.901(d,3h),7.763(s,2h),7.562-7.601(t,2h),7.279-7.357(m,4h),6.403(s,1h).

化合物對(duì)表皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

第一步，培養(yǎng)人表皮細(xì)胞(hacat細(xì)胞系)和人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec細(xì)胞系)，收集細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照2.5×10⁴個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中，5％co2、37℃孵箱中培養(yǎng)。

第二步，實(shí)驗(yàn)前棄去培養(yǎng)基，用pbs淋洗細(xì)胞3次。對(duì)照組設(shè)為3列24個(gè)孔，加入含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基100μl，dmso濃度共8個(gè)梯度，從化合物最高濃度32μg/ml和dmso濃度1％開(kāi)始，向下倍比稀釋，5％co2、37℃孵育8～24h。

第三步，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，倒去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀od490nm處檢測(cè)各孔的吸光度值。

結(jié)果如表1所示，與空白對(duì)照組相比，化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范圍內(nèi)對(duì)人表皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯示化合物對(duì)上述細(xì)胞活性沒(méi)有影響，毒性較低。

表1.化合物對(duì)表皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒性試驗(yàn)

實(shí)施例2：本發(fā)明免洗抗菌凝膠的制備

在本實(shí)施例中，免洗抗菌凝膠具體制備步驟如下。

第一步，將0.6g卡波姆940、5ml甘油和適量去離子水?dāng)嚢杌旌虾笤?0～60℃的水中微熱30min。

第二步，放置過(guò)夜，使卡波姆940充分溶脹。

第三步，將100mg3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素溶解在45ml無(wú)水乙醇中，攪拌均勻，將該溶液緩慢加入到步驟二的混合溶液中，邊加邊攪拌。

第四步，加入適量去離子水配至100ml，將凝膠ph值調(diào)至6～7。

ph調(diào)節(jié)劑可選用三乙醇胺。

另外一種制備方法中，用卡波姆941替換實(shí)施例2中的卡波姆940。

又一實(shí)施方案中，用卡波姆934替換實(shí)施例2中的卡波姆940。

實(shí)施例3：實(shí)施例2免洗消毒凝膠的最低抑菌濃度測(cè)定

第一步，免洗抗菌凝膠和對(duì)照凝膠的梯度稀釋方法：吸取100μl制好的免洗抗菌凝膠加入96孔板的每排第1號(hào)孔內(nèi)，l號(hào)孔經(jīng)混合后吸出100μl，加入2號(hào)孔內(nèi)，依次倍比稀釋至8號(hào)后，吸出100μl棄去，這樣凝膠的的梯度濃度依次為50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰(v/v)，相對(duì)應(yīng)的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。陽(yáng)性對(duì)照為潔芙柔免洗手消毒凝膠，陰性對(duì)照為不含有3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的凝膠。此外，設(shè)置單獨(dú)使用梯度濃度的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素溶液作為對(duì)照。

第二步，檢測(cè)菌的準(zhǔn)備：取凍存于-20℃的金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)以及中度耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)四種檢測(cè)菌，劃線接種于m-h瓊脂培養(yǎng)基，在孵箱(35±2℃)中孵育20～24h。次日挑取單克隆菌落，接種于3mltsb培養(yǎng)基中，180rpm、37℃搖菌過(guò)夜。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌液，用m-h肉湯培養(yǎng)基校正濃度至od630＝0.1(含菌量約10⁸cfu/ml)，再用m-h肉湯1:1000稀釋(含菌量約10⁵cfu/ml)。稀釋后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種。

第三步，檢測(cè)菌的接種：用微量加樣器取100μl稀釋后的菌液依次加到96孔板中，最終接種細(xì)菌濃度為每孔5×10⁴/ml。這時(shí)從第1孔到第8孔藥物的濃度依次為25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰、1.953125‰(v/v)，相對(duì)應(yīng)的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml。振蕩1min，使各孔內(nèi)菌液混勻，微孔板加蓋以減少孵育過(guò)程中的蒸發(fā)，并置濕盒內(nèi)35℃孵育16～20h。同時(shí)每組設(shè)無(wú)凝膠生長(zhǎng)對(duì)照孔(即只加100μlm-h肉湯和100μl復(fù)蘇后的菌液)和無(wú)菌對(duì)照孔(即只加200μlm-h肉湯)。

第四步，結(jié)果判斷：無(wú)菌對(duì)照孔在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)始終保持清亮，表明整個(gè)實(shí)驗(yàn)是無(wú)菌操作。與生長(zhǎng)對(duì)照孔中細(xì)菌生長(zhǎng)特性(如微孔內(nèi)肉湯呈混濁狀，孔底出現(xiàn)沉淀等)相比較進(jìn)行判斷，無(wú)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低凝膠濃度為測(cè)定凝膠對(duì)檢測(cè)菌的最低抑菌濃度(mic)。

結(jié)果如表2所示，可以看出，免洗消毒凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明顯的殺菌作用，對(duì)上述四個(gè)細(xì)菌的最低抑菌濃度為15.625‰，此時(shí)3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為16μg/ml。與對(duì)照免洗手消毒凝膠和陰性對(duì)照凝膠相比，本發(fā)明免洗抗菌凝膠對(duì)藥物敏感菌和多重耐藥的金黃色葡萄球菌均有明顯殺菌活性，且比單獨(dú)使用3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的抗菌活性高(由表2所示，本發(fā)明免洗抗菌凝膠內(nèi)含16μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素時(shí)有抑菌效果，3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素水溶液中內(nèi)含32μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素時(shí)有抑菌濃度)。

表2.免洗抗菌凝膠的最低抑菌濃度

實(shí)施例4：實(shí)施例2免洗抗菌凝膠殺菌曲線的測(cè)定

第一步，取無(wú)菌錐形瓶8個(gè)，分別標(biāo)記為“生長(zhǎng)對(duì)照和免洗抗菌凝膠”。每瓶分別加入6ml營(yíng)養(yǎng)肉湯。

第二步，在免洗抗菌凝膠標(biāo)記的錐形瓶中加入定量免洗抗菌凝膠，其濃度為15.625‰(v/v)，生長(zhǎng)對(duì)照組加同等體積的去離子水。

第三步，在各錐形瓶中加入6μl濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的待測(cè)菌液金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)，各管菌液的最終濃度約為10⁵cfu/ml。

第四步，加菌后立即將錐形瓶均勻渦旋15s，倍比連續(xù)稀釋1000倍后，分別取0.1ml菌液接種于m-h瓊脂平板上(各接種兩份)，用l型玻棒均勻涂布接種，35℃孵育過(guò)夜后做菌落計(jì)數(shù)，并取其平均數(shù)。

第五步，37℃分別培養(yǎng)0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18h后，將錐形瓶均勻渦旋15s，同上法倍比連續(xù)稀釋100～10⁷倍后，分別取0.1ml菌液接種于m-h瓊脂平板上(各接種三份)，35℃孵育過(guò)夜后，取菌落數(shù)在30-300之間的平板計(jì)數(shù)，并取其平均數(shù)。

第六步，cfu＝三塊板的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)，即為原液中每毫升菌液中的活菌數(shù)。肉眼計(jì)數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)的菌落，并求其平均值，從而在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙繪制不同時(shí)間點(diǎn)的殺菌曲線圖。

結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，抗菌凝膠作用后的金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)的生長(zhǎng)均受到明顯的抑制。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抗菌凝膠作用后的上述四種細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少，說(shuō)明抗菌凝膠對(duì)藥物敏感菌和多重耐藥的金黃色葡萄球菌有快速、明顯的殺滅作用。

實(shí)施例5：實(shí)施例2抗菌凝膠皮膚刺激試驗(yàn)

第一步，選健康、成年、皮膚無(wú)損傷的sd大鼠10只，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)背毛剪掉，不損傷表皮，去毛范圍1.5cm×1.5cm。

第二步，取免洗抗菌凝膠受試物0.5ml直接涂在皮膚上，然后用二層紗布(2cm×2cm)和一層無(wú)刺激油紙覆蓋，再用無(wú)刺激膠布固定，另一側(cè)作為對(duì)照。刺激4h后，用生理鹽水除去殘留受試物。

第三步，每天涂抹1次，連續(xù)14d，每次涂抹后24h觀察結(jié)果。

結(jié)果表明，連續(xù)涂抹14d，給藥側(cè)皮膚均未見(jiàn)紅斑和紅腫，與對(duì)照側(cè)皮膚比較未見(jiàn)異常。試驗(yàn)期內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物受試側(cè)皮膚最高積分均值為0，刺激強(qiáng)度屬無(wú)刺激性。