本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料及其制備方法。
背景技術(shù)：
：皮膚是人體與外界環(huán)境的屏障，保護(hù)體內(nèi)各種組織和器官免受外界物理性、機(jī)械性、化學(xué)性以及病原微生物的侵襲。當(dāng)皮膚受到損傷時(shí)，若不能及時(shí)愈合，傷口表面需及時(shí)覆蓋敷料。感染是燒創(chuàng)傷護(hù)理領(lǐng)域最為普遍的并發(fā)癥之一，會(huì)導(dǎo)致傷口出現(xiàn)大量的滲出液，分解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及多種生長因子，阻礙表皮再生及傷口閉合，從而顯著影響康復(fù)的進(jìn)程，甚至有可能導(dǎo)致燒創(chuàng)傷患者死亡。全身應(yīng)用抗生素的療法，往往在傷口局部的藥物濃度達(dá)不到防治感染的有效范圍，另外也會(huì)加大藥物劑量，增加副作用。使用適宜的抗菌敷料可以充分降低傷口的感染，同時(shí)全面促進(jìn)傷口愈合。臨床上普遍采用抗生素藥物敷料對(duì)皮膚創(chuàng)面進(jìn)行抗菌治療，雖然抗生素抗菌起效迅速，但長期使用抗生素會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。同時(shí)，臨床治療中應(yīng)用的納米創(chuàng)傷敷料主要是將納米抗菌材料（如：納米銀、納米氧化硅、納米氧化鋅和納米氧化欽等）與棉織物復(fù)合制得，具有較強(qiáng)的抗菌性能，但生物相容性差，無法降解，不宜用于創(chuàng)面的長期覆蓋。因此，研制出一種具有起效迅速、長期使用后無耐受性、具有良好生物相容性和安全性的廣譜抗菌劑是該領(lǐng)域的發(fā)展方向和趨勢(shì)。抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌具有很強(qiáng)的抑制作用。尤為重要的是抗菌肽對(duì)多藥物耐受的細(xì)菌具有明顯的殺滅作用，包括甲氯亞林耐受的金黃色葡萄球菌和萬古霉素耐受的腸球菌?？咕亩鄶?shù)是帶有正電荷，而細(xì)菌的細(xì)胞膜富含林芝酰甘油或絲氨酸磷脂之類的磷脂使其帶有負(fù)電荷，所以兩者之間極易發(fā)生電荷作用，進(jìn)而使抗菌肽產(chǎn)生殺滅細(xì)菌的生物學(xué)效應(yīng)。而哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞膜主要是由兩性離子組成，細(xì)胞膜上不存在甾醇類分子使抗菌肽不易對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生傷害?？咕牡母咛禺愋砸矝Q定了其臨床引用具有較高的安全性?？咕耐ㄟ^在細(xì)菌的細(xì)胞膜積累并發(fā)生構(gòu)象的變化進(jìn)而破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流，細(xì)菌細(xì)胞破裂，同時(shí)存在一些胞內(nèi)抗菌機(jī)制，如抑制核酸合成，干擾蛋白質(zhì)和抑制細(xì)胞膜合成等。而且抗菌肽的抗菌過程迅速，在接觸微生物數(shù)秒內(nèi)就能發(fā)生，這是傳統(tǒng)抗生素?zé)o法比擬的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有抗菌敷料生物相容性低、長期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性、功能單一、不具備誘導(dǎo)組織再生功能等不足，提供一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料及其制備方法。該方法制得的皮膚創(chuàng)傷敷料免疫原性低，具有良好的生物相容性和抗菌性能，同時(shí)具有誘導(dǎo)創(chuàng)面修復(fù)和創(chuàng)面再上皮化的能力，制備過程耗時(shí)短，方法簡單，原料來源豐富。為實(shí)現(xiàn)上述目的，其技術(shù)解決方案為：一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，所述皮膚創(chuàng)傷敷料為海綿狀多孔膜結(jié)構(gòu)，以海藻酸鈉為基質(zhì)，通過用冷凍干燥的方法制備出海藻酸鈉纖維膜，再以表面修飾的方式將生物抗菌肽Cys-KR12固定在纖維膜上制備而成。進(jìn)一步的，所述海藻酸鈉和抗菌肽抗菌肽Cys-KR12的重量份數(shù)比為10﹕0.1～0.5。更進(jìn)一步的，所述海藻酸鈉的分子量為2～3×105g/mol。一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：（1）海藻酸鈉纖維膜的制備和預(yù)處理；（2）抗菌肽Cys-KR12的固定。進(jìn)一步的，所述海藻酸鈉纖維膜的制備和預(yù)處理具體步驟如下：（1）按配方量將海藻酸鈉溶于離子水中，配成質(zhì)量濃度為3％的海藻酸鈉溶液；（2）將配制所得的海藻酸鈉溶液倒入一次性培養(yǎng)皿中，置于-20℃冰箱中24小時(shí)，然后降至-80℃冷凍干燥24小時(shí)，制得海藻酸鈉纖維膜；（3）將步驟（2）所制得的海藻酸鈉纖維膜浸泡于質(zhì)量濃度為2％的氯化鈣溶液中2小時(shí)，再用去離子水沖洗2～3次，置于-20℃冰箱24小時(shí)，然后降至-80℃冷凍干燥24小時(shí)，完成預(yù)處理。更進(jìn)一步的，所述抗菌肽Cys-KR12的固定具體步驟如下：（1）將1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺溶于2-（N-嗎啉代）乙磺酸中配成濃度為0.8mg/mL的EDS溶液，將N-羥基琥珀酰亞胺溶于2-（N-嗎啉代）乙磺酸中配成濃度為1.2mg/mL的NHS溶液，然后將EDS溶液和NHS溶液兩者等體積混合制得羧基活化劑；（2）將預(yù)處理后的海藻酸鈉纖維膜浸泡于步驟（1）所制得的羧基活化劑中，室溫下反應(yīng)30分鐘，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗2～3次；（3）將N-（2-氨基乙基）馬來酰亞胺溶于磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為0.2mg/mL的AME-PBS溶液；（4）將步驟（2）處理后的海藻酸鈉纖維膜浸泡于步驟（3）所配制的AME-PBS溶液中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，然后用去離子水沖洗2～3次；（5）將抗菌肽Cys-KR12溶于磷酸鹽緩沖溶液中配制成濃度為50～500μg/mL的溶液，然后將步驟（4）處理所得的海藻酸鈉纖維膜浸泡于其中，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，再用去離子水沖洗2～3次，置于-80℃冰箱中冷凍干燥24小時(shí)，制得具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：（1）本發(fā)明所制得的皮膚創(chuàng)傷敷料具有廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，且起效快（接觸細(xì)菌后24小時(shí)，抑菌率均能達(dá)95%以上），長期使用后無耐受性；（2）本發(fā)明所制得的皮膚創(chuàng)傷敷料是以海藻酸鈉為基質(zhì)，通過表面修飾將生物抗菌肽Cys-KR12固定在海藻酸鈉纖維膜上，相比于負(fù)載抗菌成分的傳統(tǒng)創(chuàng)傷敷料，該種敷料的抗菌時(shí)效較長，不存在因抗菌成分釋放而導(dǎo)致敷料抗菌性能下降的問題；（3）本發(fā)明所制得的皮膚創(chuàng)傷敷料具有良好的生物相容性，且具有誘導(dǎo)修復(fù)功能，可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合和上皮細(xì)胞的生長，有利于創(chuàng)面的再上皮化；（4）本發(fā)明的制備過程耗時(shí)短，工藝簡單，原料來源豐富，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。附圖說明圖1為實(shí)施例1～3所制備的一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料和對(duì)比例的抗菌性能評(píng)價(jià)結(jié)果；圖2為實(shí)施例1～3所制備的一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料和對(duì)比例的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，所述皮膚創(chuàng)傷敷料為海綿狀多孔膜結(jié)構(gòu)，以海藻酸鈉為基質(zhì)，通過用冷凍干燥的方法制備出海藻酸鈉纖維膜，再以表面修飾的方式將生物抗菌肽Cys-KR12固定在纖維膜上制備而成。其中，所述海藻酸鈉和抗菌肽抗菌肽Cys-KR12的重量份數(shù)比為10﹕0.1，所述的海藻酸鈉的分子量為2～3×105g/mol。實(shí)施例2一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，所述皮膚創(chuàng)傷敷料為海綿狀多孔膜結(jié)構(gòu)，以海藻酸鈉為基質(zhì)，通過用冷凍干燥的方法制備出海藻酸鈉纖維膜，再以表面修飾的方式將生物抗菌肽Cys-KR12固定在纖維膜上制備而成。其中，所述海藻酸鈉和抗菌肽抗菌肽Cys-KR12的重量份數(shù)比為10﹕0.25，所述的海藻酸鈉的分子量為2～3×105g/mol。實(shí)施例3一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，所述皮膚創(chuàng)傷敷料為海綿狀多孔膜結(jié)構(gòu)，以海藻酸鈉為基質(zhì)，通過用冷凍干燥的方法制備出海藻酸鈉纖維膜，再以表面修飾的方式將生物抗菌肽Cys-KR12固定在纖維膜上制備而成。其中，所述海藻酸鈉和抗菌肽抗菌肽Cys-KR12的重量份數(shù)比為10﹕0.5，所述的海藻酸鈉的分子量為2～3×105g/mol。實(shí)施例4實(shí)施例1～3任一例中一種具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，其制備方法的具體步驟如下：1、海藻酸鈉纖維膜的制備和預(yù)處理：（1）按配方量將海藻酸鈉溶于離子水中，配成質(zhì)量濃度為3％的海藻酸鈉溶液；（2）將配制所得的海藻酸鈉溶液倒入一次性培養(yǎng)皿中，置于-20℃冰箱中24小時(shí)，然后降至-80℃冷凍干燥24小時(shí)，制得海藻酸鈉纖維膜；（3）將步驟（2）所制得的海藻酸鈉纖維膜浸泡于質(zhì)量濃度為2％的氯化鈣溶液中2小時(shí)，再用去離子水沖洗2～3次，置于-20℃冰箱24小時(shí)，然后降至-80℃冷凍干燥24小時(shí)，完成預(yù)處理。2、抗菌肽Cys-KR12的固定：（1）將1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺溶于2-（N-嗎啉代）乙磺酸中配成濃度為0.8mg/mL的EDS溶液，將N-羥基琥珀酰亞胺溶于2-（N-嗎啉代）乙磺酸中配成濃度為1.2mg/mL的NHS溶液，然后將EDS溶液和NHS溶液兩者等體積混合制得羧基活化劑；（2）將預(yù)處理后的海藻酸鈉纖維膜浸泡于步驟（1）所制得的羧基活化劑中，室溫下反應(yīng)30分鐘，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗2～3次；（3）將N-（2-氨基乙基）馬來酰亞胺溶于磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為0.2mg/mL的AME-PBS溶液；（4）將步驟（2）處理后的海藻酸鈉纖維膜浸泡于步驟（3）所配制的AME-PBS溶液中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，然后用去離子水沖洗2～3次；（5）將抗菌肽Cys-KR12溶于磷酸鹽緩沖溶液中配制成濃度為50～500μg/mL的溶液，然后將步驟（4）處理所得的海藻酸鈉纖維膜浸泡于其中，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，再用去離子水沖洗2～3次，置于-80℃冰箱中冷凍干燥24小時(shí)，制得具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料。實(shí)施例5對(duì)比例：一種含納米銀的海藻酸鈉基抗菌醫(yī)用敷料（參考申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310165016.3所公開的一種含納米銀的海藻酸鈉基抗菌醫(yī)用敷料及其制備方法的制備方法所制得）。實(shí)驗(yàn)組1～3：實(shí)施例1～3所得的具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，采用實(shí)施例4的方法制備而成。將上述實(shí)施例1～3所制備的具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料與對(duì)比例進(jìn)行抗菌能力評(píng)價(jià)試驗(yàn)，對(duì)比實(shí)施例1～3和對(duì)比例對(duì)大腸桿菌、金華葡萄球菌和白色念珠菌接觸24小時(shí)后的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，實(shí)施例1～3在與大腸桿菌、金華葡萄球菌和白色念珠菌接觸24小時(shí)后抑菌率達(dá)到95％以上，而對(duì)比例僅在60％左右，證明實(shí)施例1～3均具有強(qiáng)效、作用時(shí)間快的廣譜抗菌性能。實(shí)施例6對(duì)比例：一種含納米銀的海藻酸鈉基抗菌醫(yī)用敷料（參考申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310165016.3所公開的一種含納米銀的海藻酸鈉基抗菌醫(yī)用敷料及其制備方法的制備方法所制得）。實(shí)驗(yàn)組1～3：實(shí)施例1～3所得的具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料，采用實(shí)施例4的方法制備而成。將上述實(shí)施例1～3所制備的具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料與對(duì)比例進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)（按國標(biāo)GB/T16886.5-2003進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），對(duì)比實(shí)施例1～3和對(duì)比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)施例1～3在與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞相對(duì)增殖率均在90％以上，細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為0級(jí)，證明其具有良好的細(xì)胞相容性。而對(duì)比例與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后，其對(duì)應(yīng)細(xì)胞相對(duì)增殖率在70％左右，細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為3級(jí)，具有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。此外，共培養(yǎng)時(shí)間的延長實(shí)施例1～3的相對(duì)相比增殖率均有明顯提高，實(shí)施例2和3在48小時(shí)后其細(xì)胞相對(duì)增殖率均較陰性組要高（均高于100％），證明采用本發(fā)明所公開的制備方法所制得的皮膚創(chuàng)傷敷料具有促進(jìn)人成纖維細(xì)胞的生長，有利于創(chuàng)面的愈合。實(shí)施例7對(duì)比例：為市售的海藻酸鈉敷料。實(shí)驗(yàn)組1～3：為實(shí)施例1～3所制備的具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料與對(duì)比例進(jìn)行動(dòng)物傷口修復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比例對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：表1傷口修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3對(duì)比例愈合時(shí)間/天76714愈合情況傷口愈合過程中無炎癥、流膿等狀況發(fā)生，愈合后無瘢痕產(chǎn)生。傷口愈合過程中無炎癥、流膿等狀況發(fā)生，愈合后無瘢痕產(chǎn)生。傷口愈合過程中無炎癥、流膿等狀況發(fā)生，愈合后無瘢痕產(chǎn)生。傷口伴有炎癥、流膿等狀況，傷口愈合后有明顯的瘢痕產(chǎn)生。由上表可知，實(shí)施例1～3所制備的具有抗菌性能的皮膚創(chuàng)傷敷料在傷口的愈合過程中能有效防止因細(xì)菌感染，而且能有效地縮短傷口愈合的時(shí)間。以上結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出詳細(xì)說明，但本發(fā)明不局限于所描述的實(shí)施方式。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的原理和技術(shù)思想的范圍內(nèi)，對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型仍落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3