本申請為2011年3月28日提交的名稱為“用于去除生物膜的組合物及方法”的中國專利申請no.201180014984.3的分案申請。本申請要求2010年3月29日提交的美國臨時(shí)申請61/318,743、2010年5月21日提交的美國臨時(shí)申請61/347,362、2010年6月16日提交的美國臨時(shí)申請61/397,891以及2011年3月21日提交的美國臨時(shí)申請61/454,972的優(yōu)先權(quán)，每件申請的內(nèi)容在此通過引用整體并入本發(fā)明。

政府支持的聲明

本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生院的國立牙科和顱面研究所(nidcr)獲得的合同號為5r01de013230的政府支持下完成的。政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)益。

本發(fā)明主要涉及以減少和/或治愈臨床或工業(yè)細(xì)菌生物膜的方法和組合物。

背景技術(shù)：

哺乳動(dòng)物體內(nèi)生物膜中存在的細(xì)菌引發(fā)了約三分之二的慢性/復(fù)發(fā)性疾病。這些生物膜由被外部“粘液”保護(hù)的細(xì)菌組成，所述粘液通常主要由dna組成，其阻礙天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)、抗生素和其它抗菌劑從獲取入口到達(dá)所述生物膜內(nèi)細(xì)菌，使得從機(jī)體清除所述感染十分困難。此外，所述生物膜可作為未來的通常具有致死后果的急性感染的儲存器。

已發(fā)現(xiàn)dnabii家族蛋白中的至少一種蛋白在所有已知真細(xì)菌中存在，并被發(fā)現(xiàn)自然存在于所述細(xì)菌細(xì)胞的外部。當(dāng)它們引起強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)時(shí)，其感染結(jié)果是宿主個(gè)體不能自然產(chǎn)生針對家族成員的特異性抗體。細(xì)菌生物膜帶來的主要問題是宿主免疫系統(tǒng)和/或抗生素及其它抗菌劑無法獲得接近所述生物膜內(nèi)受保護(hù)的細(xì)菌的途徑。

生物膜也存在于工業(yè)環(huán)境中。例如，生物膜廣泛影響了從生產(chǎn)領(lǐng)域到加油站儲罐的石油處理問題。在該領(lǐng)域，硫酸鹽還原生物膜細(xì)菌產(chǎn)生硫化氫(酸性油)。在生產(chǎn)管道中，生物膜活性產(chǎn)生了阻塞濾器及管口的粘液。生物膜及生物膜有機(jī)體也引起了管道及石油處理設(shè)備的腐蝕。這些問題可出現(xiàn)于整個(gè)石油或天然氣生產(chǎn)設(shè)備，直至在終產(chǎn)物儲存罐表面也發(fā)現(xiàn)污染和腐蝕性生物膜有機(jī)體的地步。

在家庭中，生物膜被發(fā)現(xiàn)存在于支持微生物生長的物體內(nèi)或任意表面上，如谷物內(nèi)、食品表面、衛(wèi)生間內(nèi)以及游泳池和溫泉中。

生物膜廣泛影響了家庭以及工業(yè)的水處理。它們能夠生長在處理設(shè)備表面并妨礙該設(shè)備的性能，如熱傳導(dǎo)的降低或堵塞過濾器和膜。生長在冷卻塔填料上的生物膜可以增加足夠的重量以引起所述填料的塌陷。生物膜甚至引起高度?；讳P鋼的腐蝕。水處理中的生物膜可降低終產(chǎn)品的價(jià)值，如造紙過程中的生物膜污染或硅芯片上甚至單個(gè)細(xì)胞的接觸。生長在飲用水配送系統(tǒng)中的生物膜可以藏匿降低水質(zhì)的潛在病原微生物、腐蝕性微生物或細(xì)菌。

因此，存在突破生物膜的保護(hù)性屏障以治療或殺死相關(guān)細(xì)菌感染并將其從表面及水系統(tǒng)中清除出去的需要。本發(fā)明滿足了這一需要并且還提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。

序列表

seq.idno.1

a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9

其中:

a1是v或者i；

a2是k,q,e,a,v或y中任意一個(gè)；

a3是k,l,i,v或f中任意一個(gè)；

a4是s,i,r或v中任意一個(gè)；

a5是g或s；

a6是f；

a7是g；

a8是n或s或t或k；以及

a9是f.

seq.idno.2是vkksgfgnf

seqidno.3是b1-b2-b3-b4-b5-b5-b6-b7

其中:

b1缺失或是g或k；

b2缺失或是r,i或k中任意一個(gè)；

b3是n或v；

b4是p或i；

b5是k,q,s或g中任意一個(gè)；

b6是t,k或s中任意一個(gè)；以及

b7是g,k,q或d中任意一個(gè).

seq.idno.4是np(k/q)tg

seq.idno.5grnp(k/q)tg

seq.idno.6全長野生型(wt)86-028np流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)ihfa；genbank登錄號:aax88425.1,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

matitkldiieylsdkyhlsk

qdtknvvenfleeirlslesgqdvklsgfgnfelrdkssrpgrnpktgdvvpvsarrvvtfkpgqklrarvektk

seq.idno.7全長野生型(wt)86-028np流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)hu,genbank登錄號:yp_248142.1,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

mrfvtifinhafnssqvrlsfaqflr

qirkdtfkesnflfnrrykfmnktdlidaianaaelnkkqakaaleatldaitaslkegepvqligfgtfkvneraartgrnpqtgaeiqiaaskvpafvsgkalkdaik

seq.idno.8全長野生型r2846流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)ihfa,genbank登錄號:ado96375,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

matitkldiieylsdkyhlskqdtknvvenfl

eeirlslesgqdvklsgfgnfelrdkssrpgrnpktgdvvpvsarrvvtfkpgqklrarvektk

seq.idno.9全長野生型rd流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)ihfa；genbank登錄號:aac22959.1,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

matitkldiieylsdkyhlskqdtk

nvvenfleeirlslesgqdvklsgfgnfelrdkssrpgrnpktgdvvpvsarrvvtfkpgqklrarvektk；

seq.idno.10全長野生型大腸桿菌(e.coli)k12株系ihfa；genbank登錄號:aac74782.1,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

maltkaemseylfdklglskrdakelvelffe

eirralengeqvklsgfgnfdlrdknqrpgrnpktgedipitarrvvt

frpgqklksrvenaspkde；dnagenbank號.nc_000913

seq.idno.11全長野生型銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)pa01株系ihfa；genbank登錄號:aag06126.1,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

mgaltkaeiaerlyeelglnkrea

kelvelffeeirqalehneqvklsgfgnfdlrdkrqrpgrnpktgeeipitarrvvtfrpgqklkarveayagtks

seqidnos.12和13:ihfα的β-3和α-3部分seqidno.12:tfrpgq以及seqidno.13:klksrvenaspkde

seqidnos.14和15:ihfβ的β-3和α-3部分seqidno.14:hfkpgk以及seqidno.15:elrdraniyg

seqidnos.16和17:seqidnos.6的β-3和α-3部分,seqidnos.16:tfkpgq以及seqidno.17:klrarvektk

seqidnos.18和19:2019流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)ihfa的β-3和α-3部分,seqidno.18:tfkpgq以及seqidno.19:klrarventk

seqidnos.20和21:seqidno.8的β-3和α-3部分,seqidno.20:tfkpgq以及seqidno.21:klrarvektk

seqidnos.22和23:seqidno.9的β-3和α-3部分,seqidno.22:tfkpgq以及seqidno.23:klrarvektk

seqidnos.24和25:seqidno.10的β-3和α-3部分,seqidno.24:tfrpgq以及seqidno.25:klksrvenaspkde

seqidnos.26和27:seqidno.11的β-3和α-3部分,seqidno.26:tfrpgq以及seqidno.27:klkarveayagtks

seqidno.28:大腸桿菌(e.coli)hupa,genbank登錄號:ap_003818,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

mnktqlidviaekaelsktqakaalestlaaiteslkegdavqlvgfgtfk

vnhraertgrnpqtgkeikiaaanvpafvsgkalkdavk

seqidno.29:大腸桿菌(e.coli)hupb,genbank登錄號:ap_001090.1,最后獲取時(shí)間2011年3月21日:

mnksqlidkiaagadiskaaagraldaiiasvteslkegddvalvgfg

tfavkeraartgrnpqtgkeitiaaakvpsfragkalkdavn

seqidnos.30和31:seqidno.28的β-3和α-3部分,seqidno.30:afvsgk以及seqidno.31:alkdavk

seqidnos.32和33:seqidno.29的β-3和α-3部分,seqidno.32:sfragk以及seqidno.33:alkdavn

seq.idno.34:ihfαc末端的20個(gè)氨基酸:tfrpgqklksrvenaspkde

seq.idno.35:ihfβc末端的20個(gè)氨基酸:kyvphfkpgkelrdraniyg

seq.idno.36:dnabii結(jié)合共有序列:watcaannnnttr其中w是a或t,n是任意堿基并且r是嘌呤

seq.idno.337:大腸桿菌(e.coli)ihfα:grnpktgedipi

seq.idno.338:大腸桿菌(e.coli)ihfβ:grnpktgdkvel

seq.idno.339:大腸桿菌(e.coli)huα:grnpqtgkeiki

seq.idno.340:大腸桿菌(e.coli)huβ:grnpqtgkeiti

表格說明

表1-5是指定生物體內(nèi)生物膜逆轉(zhuǎn)的體外生物測試的結(jié)果。

表6是化膿性中耳炎(om)南美栗鼠模型(chinchillamodel)的中耳內(nèi)生物質(zhì)相對量的計(jì)分方案。

表7是經(jīng)dna酶處理的生物膜逆轉(zhuǎn)的體外生物測試的結(jié)果。

表8是可用于本發(fā)明所提供方法的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的dna結(jié)合蛋白的非限制性匯總。

表9a是本發(fā)明各個(gè)實(shí)施例的dna結(jié)合蛋白的相關(guān)部分的序列比對。粗體字母表示共有序列的精確匹配，淺灰色的字母表示保守氨基酸變化，并且淺色陰影或深色陰影序列是不同物種間高度保守的。氨基端和/或羧基端的灰色陰影不明確序列是不具有共有序列的不明確氨基酸。表9a是基于先前obeto等人1994年發(fā)表于biochimie76:901-908的信息。表9b是16氨基酸肽基序與liu等人2008年發(fā)表于cellmicrobiol.10(1):262-276的比較。

表10是來源于指定生物體dnabii蛋白的α、β以及c末端部分的列表。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，dnabii蛋白是通過結(jié)合彎曲dna底物所需的dna結(jié)合蛋白。相似地，已處于彎曲構(gòu)型的dna是優(yōu)選底物，因?yàn)椴恍枰獜澢璧哪芰俊?/p>

dnabii蛋白家族被發(fā)現(xiàn)存在于生物膜狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞之外。申請人展示了這些蛋白質(zhì)實(shí)際上在關(guān)鍵分支節(jié)點(diǎn)結(jié)合細(xì)胞外dna。一方面，申請人展示了通過可產(chǎn)生特異性抗體的多肽和蛋白質(zhì)免疫所述宿主，基于dna的晶格充分改變從而允許宿主免疫系統(tǒng)清除所述生物膜。

申請人還通過以dnabii家族成員(e.coli整合宿主因子,ihf)免疫的各種模型證明了南美栗鼠宿主中耳內(nèi)預(yù)先形成的未分型流感嗜血桿菌生物膜的清除。這種南美栗鼠中耳生物膜動(dòng)物系統(tǒng)作為人中耳炎(或中耳感染)的優(yōu)秀模型已是得到充分證明的。

應(yīng)用這種技術(shù)的方法是直截了當(dāng)?shù)?。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述多肽用于免疫個(gè)體作為對慢性/復(fù)發(fā)性生物膜疾病的預(yù)防或作為那些已被感染個(gè)體的治療。所述個(gè)體的免疫系統(tǒng)將隨之天然地產(chǎn)生通過干擾功能保護(hù)性生物膜構(gòu)建和或保持以從所述宿主預(yù)防或清除所述細(xì)菌的抗體?；蛘?，可施用所述多肽的抗體以治療或預(yù)防感染。不能形成功能性生物膜的細(xì)菌更容易被宿主免疫系統(tǒng)的其余部分所清除。

因此，本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種用于抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白結(jié)合微生物dna的方法，通過包含或主要包括，或者還進(jìn)一步包括dnabii多肽或蛋白或微生物dna與干擾劑相接觸，從而抑制、競爭或中和dnabii蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合微生物dna。所述接觸可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜的方法，包括或可選地主要包括，或者還進(jìn)一步包括所述生物膜與干擾劑相接觸，從而抑制、預(yù)防或分解所述微生物生物膜。所述接觸可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

在本發(fā)明的又一方面，提供了一種在受試者中抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜的方法，包括或可選地主要包括，或者還進(jìn)一步包括給所述受試者施用有效量的干擾劑，從而抑制、預(yù)防或分解所述微生物生物膜。

在本發(fā)明的又一方面，提供了一種用于抑制、預(yù)防或治療在受試者中產(chǎn)生生物膜的微生物感染的方法。所述方法包括或可選地主要包括，或者還進(jìn)一步包括給所述受試者施用有效量的干擾劑，從而抑制、預(yù)防或治療在受試者中產(chǎn)生生物膜的微生物感染。

對于本文所述的方法，任何可干擾或阻礙微生物dna結(jié)合所述dnabii蛋白或多肽的制劑均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。干擾劑的非限制性實(shí)例包括：

(a)分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或其片段或等價(jià)物；

(b)分離或重組的來源于e.coli株系u93的組蛋白樣蛋白(hu)多肽或其片段或等價(jià)物；

(c)分離或重組的表8、表9a、表9b、表10所確定的蛋白或多肽或圖6所確定的dna結(jié)合肽，或其片段或等價(jià)物；

(d)分離或重組的seqidno.1至340的多肽，或其片段或等價(jià)物；

(e)分離或重組的seqidno.6-11、28、29、42-100、表8的c末端多肽或表10所確定的那些c末端多肽或其片段或等價(jià)物；

(f)與整合宿主因子競爭性結(jié)合微生物dna的多肽或多核苷酸；

(g)類似holliday交叉的四路交叉多核苷酸，類似復(fù)制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或彎曲的多核苷酸；

(h)編碼(a)至(f)中任意一項(xiàng)的分離或重組的多核苷酸，或seqidno.36的分離或重組的多核苷酸或其等價(jià)物，或在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸、其等價(jià)物或互補(bǔ)分子；

(i)特異性識別或結(jié)合(a)至(f)中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，或其每種抗體或抗原結(jié)合片段的等價(jià)物或片段；

(j)編碼(i)中所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離或重組的多核苷酸或其互補(bǔ)分子；或

(k)與dnabii蛋白或多肽競爭性結(jié)合微生物dna的小分子。

本發(fā)明還提供了一種在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或賦予被動(dòng)免疫的方法，包括或可選地主要包括，或者還進(jìn)一步包括給所述受試者施用有效劑量的一種或多種選自下述組的試劑：

(a)分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或其片段或等價(jià)物；

(b)分離或重組的來源于e.coli株系u93的組蛋白樣蛋白(hu)多肽或其片段或等價(jià)物；

(c)分離或重組的表8、表9a、表9b、表10所確定的蛋白或多肽或圖6所確定的dna結(jié)合肽，或其片段或等價(jià)物；

(d)分離或重組的seqidno.1至340的多肽，或其片段或等價(jià)物；

(e)分離或重組的seqidno.6-11、28、29、42-100、表8的c末端多肽或表10所確定的那些c末端多肽或其片段或等價(jià)物；

(f)編碼(a)至(f)中任意一種的分離或重組的多核苷酸，或seqidno.36的分離或重組的多核苷酸或其等價(jià)物，或在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸、其等價(jià)物或互補(bǔ)分子；

(g)特異性識別或結(jié)合(a)至(e)中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，或其等價(jià)物或片段；

(h)編碼(g)中所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離或重組的多核苷酸。

(i)以(a)至(e)中任意一項(xiàng)沖擊的抗原呈遞細(xì)胞；以及

(j)以編碼(a)至(e)中任意一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)化的抗原呈遞細(xì)胞。

有所述免疫應(yīng)答需要的受試者包括具有產(chǎn)生微生物生物膜感染的風(fēng)險(xiǎn)或痛苦的那些人。

本發(fā)明還提供了用于上述方法的組合物，其非限制性實(shí)例在下面討論。

一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或者基本由選自seqidno.1-5或12-27、30-35、101-340或圖6所確定的dna結(jié)合肽或者其片段或等價(jià)物的氨基酸序列組成。

另一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.1或2，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.3、4或5，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

另一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.12、14、16、18、20、22、24、26、30或32，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.13、15、17、19、21、23、25、27、31或33，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.337、338、339或340，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.12和13、或14和15、或16和17、或18和19、或20和21、或22和23、或24和25、或26和27、或30和31、或32和33，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括包含有dnabii多肽、ihf多肽、hu多肽、seqidno.6-11、28、29或者表8、表10所確定的那些多肽或其片段或等價(jià)物的至少10個(gè)、或可選地至少15個(gè)、或可選地至少20個(gè)、或可選地至少25個(gè)、或可選地至少30個(gè)c末端氨基酸的c末端區(qū)域。

在一個(gè)方面，提供了下述組的分離或重組的多肽：

具有seqidno.12和13的多肽；

具有seqidno.14和15的多肽；

具有seqidno.16和17的多肽；

具有seqidno.18和19的多肽；

具有seqidno.20和21的多肽；

具有seqidno.23和24的多肽；

具有seqidno.25和26的多肽；

具有seqidno.30和31的多肽；

具有seqidno.32和33的多肽；

具有seqidno.34和35的多肽；

具有seqidno.337和338的多肽；或

具有seqidno.339和340的多肽；

條件是所述多肽不是ihfα、ihfβ或seqidno.6至11、28、29，或42至100中任意一個(gè)的野生型。

在一個(gè)方面，提供了下述組的分離或重組的多肽：

基本由seqidno.12和13組成的多肽；

基本由seqidno.14和15組成的多肽；

基本由seqidno.16和17組成的多肽；

基本由seqidno.18和19組成的多肽；

基本由seqidno.20和21組成的多肽；

基本由seqidno.23和24組成的多肽；

基本由seqidno.25和26組成的多肽；

基本由seqidno.30和31組成的多肽；

基本由seqidno.32和33組成的多肽；

基本由seqidno.34和35組成的多肽；

基本由seqidno.337和338組成的多肽；或

基本由seqidno.339和340組成的多肽；

條件是所述多肽不是ihfα、ihfβ或seqidno.6至11、28、29，或42至100中任意一個(gè)的野生型。

本發(fā)明還提供了分離或重組的多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括兩個(gè)或以上、或者三個(gè)或以上、或者四個(gè)或以上、或多個(gè)上述確定的分離多肽，包括其片段和等價(jià)物。所述分離多肽的例子包括seqidno.1-4和/或12-29、和/或30-33、和/或30-35，例如seqidno.1和2，或者可選擇地1和3或可選擇地1和4，或者可選擇地2和3，或者可選擇地seqidno.1、2和3或可選擇地2、3和4，或者可選擇地1、3和4或多肽等價(jià)物，這些例子如表9所示。所述多肽可以是任意方向的，例如seqidno.1、2和3或seqidno.3、2和1或可選擇地seqidno.2、1和3，或者可選擇地3、1和2，或者可選擇地11和12，或者可選擇地1和12，或者可選擇地2和12，或者可選擇地，1和12，或者可選擇地2和13，或者可選擇地12、16和1，或者可選擇地1、16和12。

另一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，包括seqidno.1或2以及3或4，或者一種多肽或重組多肽，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相當(dāng)于dnabii蛋白片段例如流感嗜血桿菌ihfα或ihfβ微生物的β-3和/或α-3片段的氨基酸，非限制性的例子包括seqidno.12-27，或者所述多肽的片段或等價(jià)物，其實(shí)例如表9所示。一方面，分離的野生型多肽被明確排除，例如所述多肽不是seqidno.6-11或表8所確定的野生型序列中的任何一個(gè)。在這個(gè)具體實(shí)施方式中，seqidno.1或2、或者包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相當(dāng)于ihfα或ihfβ微生物β-3和/或α-3片段的氨基酸的多肽，位于seqidno.3或4或者其片段或等價(jià)物的上游或氨基末端，所述多肽的非限制性例子包括seqidno.12-27以及30-33或其等價(jià)物。另一方面，所述分離的多肽包括seqidno.3或4、或者包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相當(dāng)于ihfα或ihfβ微生物β-3和/或α-3片段的氨基酸的多肽，非限制性的例子包括seqidno.12-27或其等價(jià)物，其位于seqid.no.1或2或其等價(jià)物的上游或氨基末端。

在上述任一個(gè)具體實(shí)施方式中，可在所述多肽、其片段或等價(jià)物的n末端或c末端添加肽接頭。一方面，所述接頭連接本發(fā)明的多肽，例如seqidno.1-4、28、29、34，或35或30-33、34，或35或包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相當(dāng)于流感嗜血桿菌ihfα或ihfβ微生物β-3和/或α-3片段的氨基酸的多肽，所述多肽的非限制性的例子包括seqidno.12-27或其等價(jià)物?！敖宇^”或“肽接頭”指的是連接多肽序列的n末端或c末端的肽序列。一方面，所述接頭為約1個(gè)至約20個(gè)氨基酸殘基長度，或者可選擇地2至約10個(gè)、約3個(gè)至約5個(gè)氨基酸殘基長度。肽接頭的一個(gè)例子是gly-pro-ser-leu-lys-leu(seqidno:37)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述確定的任意一種多肽的分離或重組多肽、以及包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括兩個(gè)或多個(gè)上述確定的分離或重組多肽的分離或重組多肽的片段或等價(jià)物。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種干擾微生物dna與多肽或其片段或等價(jià)物結(jié)合的多核苷酸，例如seqid36，或類似holliday交叉的四路交叉多核苷酸，類似復(fù)制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或彎曲的多核苷酸；編碼上述多肽或其抗體或片段的分離或重組的多核苷酸，其可選擇性連接所述多核苷酸表達(dá)和/或復(fù)制所必需的調(diào)控元件。所述多核苷酸可被包含于載體內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種分離的宿主細(xì)胞，其包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括上述的分離或重組的多肽、類似holliday交叉的四路交叉多核苷酸、類似復(fù)制叉的三路交叉多核苷酸、具有固有柔性的多核苷酸或彎曲的多核苷酸；如上所述的分離或重組的多核苷酸，或如上所述的載體。

一方面，所述細(xì)胞是包含所述分離或重組多肽的分離的抗原呈遞細(xì)胞。另一方面，所述多肽是存在于所述細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞表面的。另一方面，所述抗原呈遞細(xì)胞以一個(gè)或多個(gè)編碼所述多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了特異性識別和結(jié)合上述分離或重組多肽、包括其片段或等價(jià)物的抗體或抗原結(jié)合片段?？贵w的非限制性例子包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人源抗體、抗體衍生物、鑲嵌抗體(aveneeredantibody)、雙抗體、嵌合抗體、抗體衍生物、重組人源抗體或抗體片段。在一個(gè)特定的方面，所述抗體是單克隆抗體。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

本發(fā)明還提供了編碼一種或多種上述確定的分離或重組多肽或其抗體或片段的分離或重組的多核苷酸。還進(jìn)一步提供了包含所述分離的多核苷酸的載體。一方面，當(dāng)本發(fā)明的分離多肽不止一種時(shí)，所述分離的多核苷酸可被包含于一個(gè)多順反子載體內(nèi)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了本文所述的包含一個(gè)或多個(gè)分離或重組多肽、或者分離或重組多核苷酸或所述載體的分離的宿主細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述分離的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或諸如抗原呈遞細(xì)胞的真核細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞。

所述多核苷酸、多肽、抗體、抗原結(jié)合片段、載體或宿主細(xì)胞可進(jìn)一步包含可檢測標(biāo)簽。

本發(fā)明還提供了包含運(yùn)載體以及一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離或重組的多肽、本發(fā)明的分離或重組的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的分離的宿主細(xì)胞、或所述具體實(shí)施方式的抗體的組合物。所述運(yùn)載體可以是一個(gè)或多個(gè)固體支持物、醫(yī)療器械如支架或牙植入體、或諸如藥學(xué)上可接受運(yùn)載體的液體。所述組合物可進(jìn)一步包含佐劑、抗菌劑或抗原肽。

所述組合物可進(jìn)一步包含其它生物活性成分。一個(gè)非限制性的例子是抗菌劑諸如其它免疫成分(即抗原肽)如表面抗原，例如ompp5、rspila、omp26、ompp2或iv型菌毛蛋白(參見jurcisek和bakaletz(2007)j.ofbacteriology189(10):3868-3875以及murphy,tf,bakaletz,lo和smeesters,pr(2009)thepediatricinfectiousdiseasejournal,28:s121-s126)以及抗菌劑。

本發(fā)明還提供了一種通過在有利于所述多核苷酸表達(dá)的條件下生長或培養(yǎng)宿主細(xì)胞以產(chǎn)生抗原肽的方法，所述宿主細(xì)胞包含編碼上述抗原肽的分離的多核苷酸。經(jīng)該方法產(chǎn)生的多肽可分離出來用于進(jìn)一步的體外或體內(nèi)應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷或治療用途的試劑盒，其包含上述的組合物以及使用說明。本發(fā)明還提供了一種用于篩選新藥物和/或如本文所提供的聯(lián)合治療的試劑盒。

附圖說明

圖1a是通過nthi株系86-028np在南美栗鼠中耳內(nèi)形成并標(biāo)記nthitfp菌毛蛋白(在該圖的背景下顯示為白色或淺灰色斑點(diǎn)和小團(tuán))、以及以dapi標(biāo)記雙鏈dna(dsdna)(在該圖的前景下顯示為深灰色的重疊鏈以及具有間歇性團(tuán)塊的成束物質(zhì))的生物膜。該圖是從jurcisek和bakaletz(2007)j.ofbacteriology189(10):3868-3875轉(zhuǎn)載而來。圖1b是來源于具有囊性纖維化的兒童的肺臟支氣管肺泡灌洗液(bal)的免疫標(biāo)記。具有囊性纖維化的兒童的肺臟經(jīng)由bal沖洗，并且所述洗液中的顆粒物經(jīng)冷凍并附著在玻片上用于免疫標(biāo)記。所述冷凍的顆粒物以抗ihf抗體免疫標(biāo)記。人囊性纖維化患者生物膜內(nèi)ihf陽性灶的存在充分體現(xiàn)了人囊性纖維化的病因包括在雙鏈dna(dsdna)頂點(diǎn)具有ihf的生物膜。圖1c顯示了鼻竇手術(shù)時(shí)從人鼻竇收集并嵌入oct(最適切割溫度介質(zhì)，可從fisherscientific商購獲得，商品目錄號14-373-65)冷凍液的分泌物。切割10μm的冷凍分泌物并以抗ihf標(biāo)記(顯示為灰色團(tuán)簇)。所述樣品中dsdna以熒光染色劑dapi(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,從invitrogen商購獲得)染色。鼻竇炎患者生物膜內(nèi)ihf陽性灶的存在充分體現(xiàn)了人鼻竇炎的病因包括在dsdna頂點(diǎn)具有ihf的生物膜。

圖2是南美栗鼠中耳內(nèi)形成的nthi生物膜內(nèi)雙鏈dna的免疫組化標(biāo)記(在該圖中顯示為白色鏈)。幾乎在100％的由dsdna形成的頂點(diǎn)上觀察到ihf的陽性標(biāo)記(如在該3畫面圖中的中間畫面由指向點(diǎn)狀灶的箭頭所示)。頂點(diǎn)間的平均距離大約為6μm，或如果假定b型dna的每一個(gè)dna堿基0.34nm的話，每個(gè)頂點(diǎn)間距大約18kb。據(jù)我們所知，具有與抗ihf交叉反應(yīng)的表位的蛋白僅有hu和ihf。因此，基于這些觀察，看來不僅在nthi生物膜基質(zhì)內(nèi)存在細(xì)胞外dnabii蛋白，更重要地，這些蛋白似乎是專門定位于類似十字結(jié)構(gòu)的edna鏈上(參見圖1畫面b，底部區(qū)域)，因而強(qiáng)烈暗示其在調(diào)節(jié)edna產(chǎn)生彎曲構(gòu)型中的作用。

圖3顯示了抗ihf抗體逆轉(zhuǎn)了已在室玻片內(nèi)形成的nthi生物膜。圖3a顯示了以非特異性抗體處理的生物膜。圖3b顯示了以新鮮兔血清處理的生物膜。注意具有豐富塔(abundanttowers)(顯示為白色或淺灰色團(tuán)簇區(qū))和水通道(黑色空間)的強(qiáng)健nthi生物膜。圖3c是以抗ihf處理的生物膜。注意在以抗ihf處理后生物膜結(jié)構(gòu)的根除。殘余個(gè)別的nthi(顯示為小圈點(diǎn)白至淺灰色點(diǎn))以及稀疏、短的塔(顯示為密集的白色至淺灰色團(tuán)簇區(qū))。圖3d和3e進(jìn)一步描繪了抗ihf抗體逆轉(zhuǎn)已建立的nthi生物膜。如圖3(畫面e)所示，與以新鮮血清孵育相比較(圖3，畫面d)，所述生物膜顯示出立體結(jié)構(gòu)的巨大損失。通過多重復(fù)制檢測的comstat分析，所測得的生物膜高度參數(shù)、生物量以及生物膜厚度均在以抗ihf孵育后平均減少了80％以上。

圖4a和圖4b是顯示以抗ihf處理已由nthi形成的生物膜導(dǎo)致更多的nthi釋放至上清液中的圖形。在室玻片中生長16小時(shí)的nthi生物膜以無菌培養(yǎng)基(sbhi)假處理或以新鮮兔血清或兔抗ihf處理。6小時(shí)后(圖4a)或10小時(shí)后(圖4b)，收集上清液并分析。注意在以抗ihf處理后上清液中nthi數(shù)量的增大。以抗ihf孵育導(dǎo)致約6小時(shí)內(nèi)室玻片內(nèi)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的浮游細(xì)菌的明顯增長，并且在孵育10小時(shí)后顯著增加。這些結(jié)果提示了細(xì)菌從生物膜基質(zhì)釋放。

圖5顯示了以ihf經(jīng)皮免疫后減少中耳內(nèi)已建立的生物膜的結(jié)果。注意聽泡的相對殘余生物膜質(zhì)量在0至4+等級上盲目無序。

圖6a是指示ihf與ihf-ihf二聚體中另一ihf相互作用或結(jié)合(通過上一層的三角形指示)或與dna相互作用或結(jié)合的氨基酸殘基(通過下一層的三角形指示)的譜圖。所述肽通過短豎線分成含有3個(gè)氨基酸的區(qū)域。

圖6b圖形化地描述了微生物dna與ihf的相互作用。

圖7描述了由金黃色葡萄球菌、淋球菌和銅綠假單胞菌形成的生物膜在與兔抗ihf孵育后相對于與新鮮兔血清孵育后的減少。

圖8顯示了由e.coli在體外形成的生物膜與新鮮血清或抗ihf血清孵育的效果。生物膜的代表圖像如畫面a-f所示，各個(gè)生物膜的高度顯示在圖像右側(cè)，其中用生物膜高度、生物量和平均厚度經(jīng)與抗ihf孵育調(diào)節(jié)的減少百分?jǐn)?shù)表達(dá)的平均數(shù)如每一行末尾的表中所示。畫面a&b-親本株系mg1655，畫面c&d-hu-hupa,hubb雙缺失突變體，畫面e&f-ihf-himd,hima雙缺失突變體。注意抗ihf血清正如預(yù)期地減少由親本分離物或hu缺陷突變體誘導(dǎo)的生物膜，但不能減少ihf缺陷株系誘導(dǎo)的。

圖9a證明了通過經(jīng)皮遞送途徑的ihf免疫誘導(dǎo)了顯著降低駐留在南美栗鼠中耳內(nèi)nthi誘導(dǎo)的生物膜生物量的抗體的形成(p<0.001)。

圖9b描述了殘留在單獨(dú)以佐劑免疫與以ihf+佐劑免疫的動(dòng)物耳內(nèi)的生物量的代表圖像。圖9b最后的柱狀圖顯示了本發(fā)明所應(yīng)用評分系統(tǒng)的極值的生物量圖像。上圖是含有評分值為4+生物量的中耳的圖像，下圖是評分值為0、表示沒有生物量的健康中耳。

圖10a顯示了從已單獨(dú)應(yīng)用佐劑與應(yīng)用ihf+佐劑經(jīng)皮免疫(tci)的南美栗鼠中耳回收的生物膜的冰凍切片h&e染色。注意由ihf+佐劑免疫的動(dòng)物所回收生物膜相對于僅以佐劑免疫的凝聚且萎陷的外觀。畫面a中的圖像以相同的倍數(shù)放大顯示以說明兩種代表性生物量在高度及密度上的差異。

圖10b證實(shí)了在單獨(dú)應(yīng)用佐劑與應(yīng)用ihf+佐劑免疫的動(dòng)物中耳內(nèi)細(xì)菌負(fù)載量的顯著減少(p<0.05)。

圖11描述了證明在用于免疫南美栗鼠的條件下ihf與dsdna形成特異性復(fù)合物的電泳遷移率變動(dòng)分析。

圖12圖形化地表現(xiàn)了相較于僅接受佐劑免疫(p<0.017)、僅接受dsdna免疫(p<0.003)或已結(jié)合dsdna的ihf+佐劑免疫(p<0.001)，以天然ihf+佐劑的經(jīng)皮免疫誘導(dǎo)了顯著減少駐留在南美栗鼠中耳內(nèi)生物量的抗體的形成。該結(jié)果提示dsdna與天然ihf的結(jié)合屏蔽了這種dnabii家族成員的保護(hù)性抗原表位。

圖13描述了在以ihf或結(jié)合dsdna的ihf經(jīng)皮免疫后，血清內(nèi)抗體對ihf(箭頭)的識別(箭頭)。

圖14是協(xié)同效應(yīng)的示范，單獨(dú)的次優(yōu)濃度抗ihf血清(1:200)與dnasei，然后混合(圖14a)；單獨(dú)的次優(yōu)濃度抗ihf(1:100)與抗外膜蛋白p5血清(ompp5)，然后混合(圖14b)；或單獨(dú)的抗ihf的有效稀釋(根據(jù)生物膜的消退但不包括誘導(dǎo)性細(xì)菌細(xì)胞死亡)與阿莫西林，然后混合(圖14c)。在這些情況中，當(dāng)任意一種試劑與抗ihf組合時(shí)，觀察到的生物膜消退和/或殺傷作用大于任意一種試劑單獨(dú)使用時(shí)所見到的。注意：生物膜的高度(以微米表示)標(biāo)注在每張圖像下方。

圖15是以新鮮兔血清或兔抗ihf血清(頂行的圖像)處理的e.coli的比較；以新鮮大鼠血清或大鼠抗hns(中間行的圖像)血清處理的e.coli的比較；或以新鮮小鼠血清或小鼠抗dps血清(底行的圖像)。注意到以抗ihf血清處理后生物量的明顯減少，然而，在此使用的抗hns血清和抗dps血清都不能誘導(dǎo)生物量的減少。抗ihf的處理導(dǎo)致生物膜高度48.2％的減少，生物膜平均厚度81％的減少以及生物量64.5％的減少。與之相比，抗hns處理或抗dps處理導(dǎo)致標(biāo)稱高度分別減少0.7％和4.2％，平均厚度分別減少5.8％和6.4％，并且生物量分別減少0.3％和17.4％

圖16顯示了生物膜內(nèi)來源于宿主生物體或來源于所述細(xì)菌的dna的相對分布的原位雜交。在每一種情況下，這些黑白圖像前景內(nèi)，dna顯示為更亮、更白的區(qū)域。宿主來源的dna在右上的圖像內(nèi)標(biāo)記得更密集，證明其在生物膜的外周更多分布，而細(xì)菌來源的dna在左下由4畫面組成的圖像內(nèi)標(biāo)記得更密集，從而證明了其在生物膜內(nèi)側(cè)更密集分布。

具體實(shí)施方式

除非另有規(guī)定，本發(fā)明所應(yīng)用的所有技術(shù)和科技術(shù)語均與發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同的含義。本發(fā)明所提供的所有核苷酸均以5’至3’方向呈現(xiàn)。盡管任何類似或等價(jià)于本文所述的方法和物質(zhì)均可用于本發(fā)明的實(shí)踐或檢驗(yàn)，在此介紹優(yōu)選的方法、設(shè)備以及物質(zhì)。本文所引用的所有技術(shù)出版物和專利出版物的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。此處的任何信息均不構(gòu)成對本發(fā)明不能享受借助在先發(fā)明的提早公開的承認(rèn)。

除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用組織培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組dna的傳統(tǒng)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。參見例如sambrook和russell主編的(2001)分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊，第三版；該系列的ausubel等主編的(2007)currentprotocolsinmolecularbiology；該系列的methodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.)；macpherson等(1991)pcr1:apracticalapproach(irlpressatoxforduniversitypress)；macpherson等(1995)pcr2:apracticalapproach；harlow和lane主編的(1999)antibodies,alaboratorymanual；freshney(2005)cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,第五版；gait主編的(1984)oligonucleotidesynthesis；美國專利4,683,195；hames和higgins主編的(1984)nucleicacidhybridization；anderson(1999)nucleicacidhybridization；hames和higgins主編的(1984)transcriptionandtranslation；immobilizedcellsandenzymes(irlpress(1986))；perbal(1984)apracticalguidetomolecularcloning；miller和calos主編的(1987)genetransfervectorsformammaliancells(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)；makrides主編的(2003)genetransferandexpressioninmammaliancells；mayer和walker主編的(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(academicpress,london)；以及herzenberg等主編的(1996)weir’shandbookofexperimentalimmunology。

包括范圍在內(nèi)的所有數(shù)字標(biāo)號，如ph值、溫度、時(shí)間、濃度以及分子量，為增量1.0或0.1的(+)或(-)變化的近似值，適當(dāng)?shù)幕蛘呖蛇x的+/-15％的變化，或者可選的10％或者可選的5％或者可選的2％。盡管并不總是明確規(guī)定，應(yīng)當(dāng)可以理解所有的數(shù)字標(biāo)號之前均有術(shù)語“大約”。同樣應(yīng)當(dāng)可以理解，盡管并不總是明確規(guī)定，本發(fā)明所述的試劑僅僅是示例性的并且其等價(jià)物是本領(lǐng)域所知曉的。

除非上下文另有明確說明，說明書和權(quán)利要求書中所應(yīng)用的單數(shù)形式“a”、“an”以及“the”包括復(fù)數(shù)指代。例如，術(shù)語“一個(gè)多肽”包括多個(gè)多肽(包括其混合物)。

如本文所應(yīng)用的，術(shù)語“包括”意指所述組合物和方法包括所列舉的要素但不排除其它要素。當(dāng)“主要包括”用于限定組合物和方法時(shí)，指將其它具有重要意義的要素排除出用于使用目的的組合。因此，主要包括本文所定義的要素的組合物不排除來自分離和純化方法的痕量污染物以及藥學(xué)上可接受的載體如磷酸鹽緩沖液、防腐劑等等?！坝伞M成”指排除超過痕量的其它成分和施用本發(fā)明組合物的重要方法步驟。由這些過渡術(shù)語定義的具體實(shí)施方式包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。

“生物膜”意指偶然粘附至某結(jié)構(gòu)(其可以是有機(jī)或無機(jī)的)表面的微生物及其分泌和/或釋放的多聚物(如dna)的有組織的群落。所述生物膜十分耐受微抗生素(microbiotics)和抗菌劑。他們生活在牙齦組織、牙齒和修復(fù)組織(restorations)上，引起齲齒以及牙周疾病，也被成為牙周斑塊疾病。它們也引發(fā)慢性中耳感染。生物膜還可以在牙科植入物、支架、導(dǎo)管線和接觸鏡上形成。它們生長在心臟起搏器、心臟瓣膜置換物、人工關(guān)節(jié)和其它外科植入物上。疾病控制中心估計(jì)，超過65％的院內(nèi)(醫(yī)院獲得性)感染是由生物膜引起的。它們引發(fā)慢性陰道感染病并在具有脆弱免疫系統(tǒng)的人群中引起威脅生命安全的全身性感染。生物膜還參與了許多的疾病。例如，假單胞菌感染的囊性纖維化病人通常產(chǎn)生抗生素耐受性生物膜。

術(shù)語“抑制、競爭或中和”意指作為微生物生物膜成分的dna/蛋白質(zhì)基質(zhì)的形成減少(例如圖1所示)。

“dnabii多肽或蛋白”意指由dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成并因而具有特異或一般的微生物dna親和性的dna結(jié)合蛋白或多肽。一方面，它們結(jié)合dna的小溝。dnabii蛋白的非限制性例子是整合宿主因子(ihf)蛋白和來源于u93e.coli株系的組蛋白樣蛋白(hu)。其它可能與生物膜相關(guān)的dna結(jié)合蛋白包括dps(genbank登錄號：caa49169)、h-ns(genbank登錄號：caa47740)、hfq(genbank登錄號：ace63256)、cbpa(genbank登錄號：baa03950)和cbpb(genbank登錄號：np_418813)。

“ihf”蛋白的“整合宿主因子”是噬菌體用于整合其dna至宿主細(xì)菌的細(xì)菌蛋白質(zhì)。它們也結(jié)合細(xì)胞外的細(xì)菌dna。在e.coli中編碼ihf蛋白亞基的基因是hima(genbank登錄號:poa6x7.1)和himd(poa6y1.1)基因。在其它有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)了這些基因的同源基因，并且其它有機(jī)體的對應(yīng)于這些基因的肽在表10中能找到。

“hmgb1”是一種高遷移率族b1蛋白，據(jù)報(bào)道其結(jié)合并扭曲dna的小溝，而且其是干擾劑的一個(gè)實(shí)例。重組或分離的蛋白和多肽可以從atgenglobal、prospecbio、protein1和abnova商購獲得。

“hu”或“e.coli株系u93來源的組蛋白樣蛋白”指通常與e.coli相關(guān)的一類異源二聚體蛋白。已知hu蛋白結(jié)合dna交叉(dnajunctions)。相關(guān)蛋白已從其它微生物體分離得到。e.colihu的氨基酸全序列是laine等人(1980)eur.j.biochem.103(3):447-481報(bào)道的。hu蛋白的抗體可從abcam商購獲得。e.coli中編碼hu蛋白亞基的基因是分別對應(yīng)于seqidnos:28和29的hupa和hupb。在其它有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)了這些基因的同源基因，并且其它有機(jī)體的對應(yīng)于這些基因的肽在表10中能找到。

術(shù)語“表面抗原”或“表面蛋白”指細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)表面的蛋白質(zhì)或肽。表面抗原的例子有例如ompp5(genbank登錄號:yp_004139079.1)、ompp2(genbank登錄號:zzx87199.1)、ompp26(genbank登錄號:yp_665091.1)、rspila或重組可溶性pila(genbank登錄號:efu96734.1)以及iv型pilin(genbank登錄號:yp_003864351.1)的外膜蛋白。

術(shù)語“流感嗜血桿菌”指能夠引起多種不同感染例如耳部感染、眼部感染以及鼻竇炎的病原菌。已分離到許多流感嗜血桿菌的不同株系且其具有ihfa基因或蛋白質(zhì)。流感嗜血桿菌的不同株系的一些非限制性例子包括rdkw20、86-028np、r2866、pittgg、pittee、r2846以及2019。

“微生物dna”指來源于產(chǎn)生生物膜的微生物的單鏈dna或雙鏈dna。

“抑制、預(yù)防或分解”生物膜指生物膜結(jié)構(gòu)的預(yù)防或治療性減少。生物膜分解或減少的例子如圖5所示。

“干擾劑”指一種競爭、抑制、阻止、中和dnabii多肽(如ihf)結(jié)合微生物dna中的一種或多種或者分解微生物生物膜的試劑。它可以是一種或多種化學(xué)分子或生物分子。例如，ihf可以特異性結(jié)合、彎曲或扭曲dna結(jié)構(gòu)，例如含有四路交叉、順鉑加合物、dna環(huán)或堿基突起的dna。所述試劑的例子包括但不限于(1)抑制ihf的dna結(jié)合活性的小分子，(2)在dna結(jié)合中與ihf競爭的小分子，如聚胺和精胺，(3)在dna結(jié)合中與ihf競爭的多肽，如ihf的肽片段，(4)抗ihf的抗體或片段，或者(5)在ihf結(jié)合中競爭的四路多核苷酸或彎曲的多核苷酸或者其它類型的含有彎曲或扭曲dna結(jié)構(gòu)的多核苷酸?！耙种苅hf與核酸結(jié)合的小分子”指上述(1)或者(2)的分子并且包括結(jié)合dna小溝的那些分子，例如小溝結(jié)合分子?！八穆范嗪塑账帷敝冈谒臈ldna鏈間含有四路交叉、也叫holliday交叉的多核苷酸。

“彎曲的多核苷酸”指在一條不能與另一條鏈配對的鏈上含有小環(huán)的雙鏈多核苷酸。在某些具體實(shí)施方式中，所述環(huán)為1個(gè)堿基至約20個(gè)堿基長度，或可選地2個(gè)堿基至約15個(gè)堿基長度，或可選地3個(gè)堿基至12個(gè)堿基長度，或可選地4個(gè)堿基至10個(gè)堿基長度，或可選地具有約4、5、或6、或7、或8、或9或10個(gè)堿基。

“在dna結(jié)合中與ihf競爭的多肽”指在結(jié)合彎曲的或扭曲的dna結(jié)構(gòu)時(shí)與ihf競爭但不與所述dna形成生物膜的蛋白質(zhì)或多肽。例子，包括但不限于包含ihf或其生物等價(jià)物的一個(gè)或多個(gè)dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ihf片段。dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域如圖6所示。

用于診斷或治療的“受試者”是細(xì)胞或動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物或人類。用于診斷或治療的非人類的動(dòng)物是那些用于感染或動(dòng)物模型的，例如，猿人，鼠類例如大鼠、小鼠、南美栗鼠，犬類例如狗，兔類例如兔子，牲畜，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物以及寵物。

術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”以及“多肽”可互換使用，并在其最廣泛的意義上指具有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸亞單位、氨基酸類似物或模擬肽的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述亞單位可通過其它鍵如酯鍵、醚鍵等連接。蛋白質(zhì)或多肽必須含有至少兩個(gè)氨基酸并且氨基酸的最大數(shù)目沒有限制，其可以包含一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽的序列。本文所應(yīng)用的術(shù)語“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d型和l型光學(xué)異構(gòu)體、氨基酸類似物和模擬肽。

“c末端多肽”指多肽的至少10個(gè)、或可選地至少15個(gè)、或可選地至少20個(gè)、或至少25個(gè)c末端氨基酸或可選地為多肽的一半。另一方面，對于含有90個(gè)氨基酸的多肽，c末端多肽將包含46-90位氨基酸。一方面，所述術(shù)語指羧基末端的20個(gè)c末端氨基酸。

術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，并指代任意長度的聚合物形式的核酸，或者是脫氧核糖核酸或者是核糖核酸或其類似物。多核苷酸可具有立體結(jié)構(gòu)并可行使已知或未知的任何功能。下面是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如探針、引物、est或sage標(biāo)簽)、外顯子、內(nèi)含子、信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)運(yùn)rna、核糖體rna、干擾rna(rnai)、核酶、cdna、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、分離的任意序列的dna、分離的任意序列的rna、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果有，核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在多核苷酸組裝之前或之后給予。核苷酸序列可被非核苷酸成分所中斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾，例如與標(biāo)簽成分結(jié)合。所述術(shù)語也指代雙鏈分子和單鏈分子。除非另有說明或要求，本發(fā)明的任何具體實(shí)施方式中，多核苷酸包涵雙鏈形式以及已知或預(yù)期形成雙鏈形式的兩條互補(bǔ)單鏈形式。

多核苷酸由四種核苷酸堿基的特定序列組成：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鳥嘌呤(g)；胸腺嘧啶(t)；以及當(dāng)多核苷酸是rna時(shí)胸腺嘧啶換成尿嘧啶(u)。因此，術(shù)語“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母順序排列表示。這種字母順序排列表示可輸入具有中央處理器的計(jì)算機(jī)中的數(shù)據(jù)庫并用于生物信息學(xué)應(yīng)用，例如功能基因組學(xué)和同源性搜索。

本文所應(yīng)用的與核酸(例如dna或dna)相關(guān)的術(shù)語“分離的”或“重組的”，指代從其它dnas或rnas分離出來的分子，其分別存在于天然來源的高分子以及多肽。術(shù)語“分離或重組的核酸”是指包括不作為片段自然存在并且自然狀態(tài)下無法見到的核酸片段。術(shù)語“分離的”也在此用于指代從其它細(xì)胞蛋白分離出來的多核苷酸、多肽和蛋白質(zhì)，并且包括純化和重組的多肽。在其它的具體實(shí)施方式中，術(shù)語“分離或重組的”表示從所述細(xì)胞、組織、多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段通常在自然界相關(guān)的成分、細(xì)胞等等中分離出來。例如，分離的細(xì)胞是一種由組織或具有不同表型或基因型的細(xì)胞中分離出來的細(xì)胞。分離的多核苷酸是由通常與其原始或自然環(huán)境相關(guān)(例如，在染色體上)的由3’至5’的連續(xù)核苷酸分離的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體及其片段，并不要求“分離”至將它與其天然存在的代表相區(qū)別開。

無需詳細(xì)列舉可以推斷，并且除非另有打算，當(dāng)本發(fā)明涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗體，這樣的等價(jià)物或生物學(xué)等價(jià)物將包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用的，指一個(gè)參考蛋白質(zhì)、抗體、片段、多肽或核酸時(shí)，術(shù)語“其生物學(xué)等價(jià)物”是“其等價(jià)物”的代名詞，意指具有最小同源性但仍保持所需的結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)。除非在本文中特別說明，假定本文提及的任意多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)還包括其等價(jià)物。一方面，多核苷酸等價(jià)物是在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交或用于所描述方法的本文所述多核苷酸的配對物。另一方面，抗體或抗原結(jié)合多肽等價(jià)物意指相對于參考抗體或抗原結(jié)合片段，以至少70％、或可選地至少75％、或可選地至少80％、或可選地至少85％、或可選地至少90％、或可選地至少95％親和性或更高親和性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合多肽。另一方面，所述抗體或抗原結(jié)合片段與其等價(jià)物在競爭性elisa試驗(yàn)中競爭結(jié)合其抗原。另一方面，等價(jià)物指相對于參考蛋白、多肽或核酸，具有至少約80％同源性或同一性并且可選地至少約85％、或可選地至少約90％、或可選地至少約95％、或可選地98％的同源性或同一性百分比，并且展示出基本相同的生物學(xué)活性。多肽的生物學(xué)等價(jià)物的例子在表9中提供，其確定了優(yōu)選氨基酸序列的保守氨基酸替換。

與另一序列具有某個(gè)百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或多肽或多肽區(qū)域)是指，在兩個(gè)序列比較中比對時(shí)，該百分比的堿基(或氨基酸)是相同的。所述比對以及同源性或序列同一性的百分?jǐn)?shù)可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的軟件程序確定，例如currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等主編1987)副刊30，7.7.18章，表7.7.1所記載的。優(yōu)選地，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對。優(yōu)選的比對程序是應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)的blast。特別地，優(yōu)選程序是blastn與blastp，應(yīng)用下述默認(rèn)參數(shù)：geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；matrix＝blosum62；descriptions＝50sequences；sortby＝highscore；databases＝non-redundant,genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。這些程序的詳情可從下述的因特網(wǎng)網(wǎng)址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。序列同一性和百分比同一性通過將其納入clustalw(可在網(wǎng)頁地址獲得://align.genome.jp/，2011年3月7日最后一次訪問)確定。

“同源性”或“同一性”或“相似性”指兩條肽或兩個(gè)核酸分子之間的序列相似性。同源性可通過比較用于比較目的而比對的每一序列中的某一位置來確定。當(dāng)被比較序列的某一位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，那么所述分子在該位置是同源的。序列之間的同源性程度是序列所共有的匹配或同源位置的數(shù)量函數(shù)?！安幌嚓P(guān)”或“非同源”的序列與本發(fā)明的序列具有小于40％的同一性、或可選地小于25％的同一性。

“同源性”或“同一性”或“相似性”也可以指兩個(gè)在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子。

“雜交”指一個(gè)或多個(gè)多核苷酸反應(yīng)以形成復(fù)合物的反應(yīng)，所述復(fù)合物通過核苷酸殘基的堿基對之間的氫鍵來穩(wěn)定。所述氫鍵可通過watson-crick堿基配對、hoogstein結(jié)合、或其它任何序列特異性方式形成。所述復(fù)合物可包含形成復(fù)式結(jié)構(gòu)的雙鏈、形成多重鏈復(fù)合物的三鏈或多個(gè)鏈、自雜交的單鏈或其任意組合。雜交反應(yīng)可構(gòu)成一個(gè)更廣泛過程例如pcr反應(yīng)的起始、或多核苷酸通過核酶酶切中的一個(gè)步驟。

嚴(yán)格雜交條件的例子包括：約25℃至約37℃的孵育溫度；約6xssc至約10xssc的雜交緩沖液濃度；約0％至約25％的甲酰胺濃度；以及約4xssc至約8xssc的洗滌液。溫和雜交條件的例子包括：約40℃至約50℃的孵育溫度；約9xssc至約2xssc的雜交緩沖液濃度；約30％至約50％的甲酰胺濃度；以及約5xssc至約2xssc的洗滌液。高度嚴(yán)格雜交條件的例子包括：約55℃至約68℃的孵育溫度；約1xssc至約0.1xssc的雜交緩沖液濃度；約55％至約75％的甲酰胺濃度；以及約1xssc、0.1xssc或去離子水的洗滌液。通常來說，雜交孵育時(shí)間為5分鐘至24小時(shí)，具有1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)洗滌步驟，并且洗滌孵育時(shí)間為約1分鐘、2分鐘或15分鐘。ssc是0.15mnacl和15mm檸檬酸緩沖液。不言而喻地，可以采用應(yīng)用其它緩沖系統(tǒng)的ssc等價(jià)物。

本文所用的“表達(dá)”指多核苷酸轉(zhuǎn)錄為mrna的過程和/或轉(zhuǎn)錄的mrna繼而翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。如果所述多核苷酸來源于基因組dna，表達(dá)可以包括真核細(xì)胞中mrna的剪切。

當(dāng)術(shù)語“編碼”用于多核苷酸時(shí)，其指代被認(rèn)為“編碼”多肽的多核苷酸，如果處于其原生狀態(tài)或當(dāng)以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法處理時(shí)，它可被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生所述多肽和/或其片段的mrna。所述反義鏈?zhǔn)沁@種核酸的配對物，并且所述編碼序列可由此推斷出來。

本文所用的術(shù)語“處理”、“治療”等等在此用于意指獲得所需的藥學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果可以是從完全或部分地預(yù)防紊亂或其標(biāo)志或癥狀的方面來說的預(yù)防性，和/或從紊亂和/或可歸結(jié)于所述紊亂的副作用的部分或完全治愈方面來說的治療。

預(yù)防是指在易患某種紊亂或影響的系統(tǒng)或受試者的體外或體內(nèi)預(yù)防所述紊亂或影響。一個(gè)這樣的例子是，預(yù)防生物膜在已知可產(chǎn)生生物膜的微生物感染的系統(tǒng)內(nèi)形成。

“組合物”是指活性試劑與另外一種惰性(例如，檢測試劑或標(biāo)簽)或活性的化合物或組合物(例如佐劑)的組合。

“藥物組合物”是指包括活性試劑與惰性或活性載體的組合，使得所述組合物適于體外、體內(nèi)或離體的診斷或治療應(yīng)用。

“藥學(xué)上可接受的載體”指任意的稀釋劑、賦形劑，或可用于本發(fā)明組合物的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀)、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)(例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂)、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。合適的藥物載體在這一領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文本remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany中有記載。優(yōu)選根據(jù)預(yù)期給藥形式選擇所述載體，所述給藥形式有口服片劑、膠囊劑、酏劑、糖漿劑等等，并與常規(guī)藥物實(shí)踐相一致。

本發(fā)明的“生物活性試劑”或活性試劑是指一個(gè)或多個(gè)分離或重組的多肽、分離或重組的多核苷酸、載體、分離的宿主細(xì)胞、或抗體以及包含一個(gè)或多個(gè)相同物質(zhì)的組合物。

“給藥”可在整個(gè)治療期間持續(xù)或間歇性以單劑實(shí)現(xiàn)。確定給藥的最有效方式和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且根據(jù)用于治療的所述組合物、所述治療的目的、待治療的靶細(xì)胞以及待治療的受試者變化。單次或多次給藥可根據(jù)主治醫(yī)生選擇的劑量水平和模式進(jìn)行。施用所述試劑的合適劑型和方法是本領(lǐng)域已知的。給藥途徑也可以確定，并且確定最有效的給藥途徑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且隨用于治療的組合物、治療目的、待治療受試者的健康狀況或疾病階段以及靶細(xì)胞或靶組織變化。給藥途徑的非限制性例子包括口服給藥、鼻腔給藥、注射和局部給藥。

本發(fā)明的試劑可通過任何合適給藥途徑給藥用于治療。還應(yīng)當(dāng)理解優(yōu)選的途徑將隨接受者的病情和年齡以及待治療的疾病變化。

術(shù)語“有效劑量”指足以獲得所需要效果的份量。在治療或預(yù)防的背景下，有效量將取決于所討論病情的類型和嚴(yán)重程度、以及個(gè)體受試者的特點(diǎn)如一般健康狀況、年齡、性別、體重以及藥物組合物的耐受性。在免疫原性組合物的背景下，某些具體實(shí)施方式中，有效量是足以引起對病原的保護(hù)性反應(yīng)的份量。在其它具體實(shí)施方式中，免疫原性組合物的有效量是足以導(dǎo)致針對所述抗原的抗體產(chǎn)生的份量。在某些具體實(shí)施方式中，有效量是在有此需要的受試者中給予被動(dòng)免疫所要求的份量。對于免疫原性組合物，在某些具體實(shí)施方式中，除上述記載的因素外，有效量將取決于預(yù)期的用途、特定抗原化合物的免疫原性程度、以及所述受試者免疫系統(tǒng)的健康狀況/響應(yīng)。熟練的技術(shù)人員能夠依靠這些因素以及其它因素確定適宜份量。

體外應(yīng)用的情況下，在某些具體實(shí)施方式中，所述有效量取決于論及應(yīng)用的規(guī)模和性質(zhì)。它也取決于所述體外靶標(biāo)的性質(zhì)和靈敏度以及使用方法。熟練的技術(shù)人員能夠基于這些考慮和其它考慮確定有效量。有效量可包含取決于具體實(shí)施方式的組合物的一次給藥或多次給藥。

術(shù)語“結(jié)合的基序”指能通過與嵌合多肽的殘基形成共價(jià)鍵而添加至分離的嵌合多肽的基序。所述基序可以直接結(jié)合所述嵌合多肽的殘基或者與依次和所述嵌合多肽的殘基形成共價(jià)鍵的接頭形成共價(jià)鍵。

“肽結(jié)合”指通過一個(gè)或多個(gè)多肽和另一個(gè)化學(xué)或生物學(xué)化合物的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的聯(lián)合。在非限制性的例子中，多肽與化學(xué)分子的“結(jié)合”產(chǎn)生符合預(yù)期目的的提高穩(wěn)定性或效力的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，肽結(jié)合載體，其中所述載體是脂質(zhì)體、膠束或藥學(xué)上可接受的聚合物。

“脂質(zhì)體”是由同心脂雙層組成的微觀囊泡。在結(jié)構(gòu)上，脂質(zhì)體的大小變化，形狀從長管到球形，具有從幾百埃至幾分之一毫米的尺寸。選擇囊泡形成的脂質(zhì)以獲得指定程度流動(dòng)性或剛性的最終復(fù)合物，所述最終復(fù)合物提供所述外層的脂質(zhì)組合物。這些脂質(zhì)是中性(膽固醇)或雙極性的，并包括磷脂，例如磷脂酰膽堿(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)和鞘磷脂(sm)以及其它類型的雙極性脂質(zhì)，包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)，具有14-22范圍內(nèi)的碳?xì)滏滈L度，以及是飽和的或具有一個(gè)或多個(gè)c＝c雙鍵。能夠單獨(dú)地或與其它脂質(zhì)成分組合形成穩(wěn)定脂質(zhì)體的例子是磷脂，例如氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二油酰磷脂酰膽堿(dopc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(popc)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(n-馬來酰亞胺基-甲基)環(huán)己烷-1-碳水化合物的草酸酯(dope-mal)。可整合入脂質(zhì)體的其它無磷脂質(zhì)包括硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、肉豆蔻酸異丙酯、三乙醇胺月桂基硫酸鹽、烷基芳基硫酸鹽、乙酰基棕櫚酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、十六烷基stereate、兩性的丙烯酸類聚合物、聚草酸酯的脂肪酸酰胺、以及上面提到的陽離子脂質(zhì)(ddab,dodac,dmrie,dmtap,dogs,dotap(dotma),dospa,dptap,dstap,dc-chol)。能夠形成囊泡的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)包括硬脂酸(pa)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)和磷酸鯨蠟酯。通常地，基于整體大小和層狀結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，脂質(zhì)體可分為三類。如newyorkacademysciencesmeeting,"liposomesandtheiruseinbiologyandmedicine,"1977年12月,所開發(fā)的三個(gè)分類是多片層囊泡(mlvs)、小單片層囊泡(suvs)和大型單向板層囊泡(luvs)。所述生物活性試劑可包裝入與本文所述方法相符的用于給藥的囊泡。

“膠束”是分散在液態(tài)膠質(zhì)中的表面活性劑分子的聚集。水溶液中的典型膠束通過與周圍的溶劑接觸的親水性“頭部”區(qū)域形成聚集，將疏水性尾部區(qū)域封存在膠束中心。這種類型的膠束被稱為正相膠束(水包油型膠束)。反相膠束的頭部集群在中心而尾部延伸出來(油包水型膠束)。膠束可用于連接多核苷酸、多肽、抗體或本文所述組合物以便能有效地遞送到所述靶細(xì)胞或組織。

短語“藥學(xué)上可接受的聚合物”指一組可結(jié)合一個(gè)或多個(gè)本文所述多肽的化合物?？梢栽O(shè)想的是，多聚物與所述多肽的結(jié)合能夠延長所述多肽在體內(nèi)和體外的半衰期。非限制性的例子包括聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、纖維素衍生物、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、糖、多元醇及其混合物。所述生物活性試劑可結(jié)合與本文所述方法相符的用于給藥的藥學(xué)上可接受的聚合物。

“基因遞送載體”被定義為可以攜帶被插入的多核苷酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何分子?；蜻f送載體的例子有脂質(zhì)體、膠束生物相容性的聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工的病毒薄膜；金屬顆粒；以及細(xì)菌或病毒，例如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、粘粒、脂質(zhì)體、真菌載體和其它通常用于本領(lǐng)域的重組載體，其已記載用于各種真核和原核宿主內(nèi)的表達(dá)，并可用于基因治療以及簡單的蛋白表達(dá)。

本發(fā)明的多核苷酸可應(yīng)用基因遞送載體遞送至細(xì)胞或組織?！盎蜻f送”、“基因轉(zhuǎn)移”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”等如本文所應(yīng)用的術(shù)語是指外源多核苷酸至宿主細(xì)胞的引進(jìn)(有時(shí)稱為“轉(zhuǎn)基因”)，不考慮引進(jìn)所應(yīng)用的方法。這樣的方法包括各種公知技術(shù)例如載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(通過例如，病毒感染/轉(zhuǎn)染、或各種其它的基于蛋白質(zhì)或基于脂質(zhì)的基因遞送復(fù)合物)以及促進(jìn)“裸”多核苷酸遞送的技術(shù)(例如電穿孔、“基因槍”遞送以及各種其它的用于多核苷酸引進(jìn)的技術(shù))。所導(dǎo)入的多核苷酸可以在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定或暫時(shí)保持。穩(wěn)定保持通常要求所導(dǎo)入的多核苷酸或者含有能與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制起始或者整合入所述宿主細(xì)胞的復(fù)制子例如染色體外的復(fù)制子(例如質(zhì)粒)或者核酸或線粒體染色體。如本領(lǐng)域已知的以及本文所述，已知許多的載體能夠介導(dǎo)基因至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

如本文所述的術(shù)語“edna”是指發(fā)現(xiàn)作為致病性生物膜成分的細(xì)胞外dna。

“質(zhì)?！笔菑娜旧wdna分離出來的染色體外dna分子，其能夠獨(dú)立于染色體dna復(fù)制。在許多情況下，質(zhì)粒是環(huán)狀的而且是雙鏈。質(zhì)粒提供了一種在一群微生物中水平基因轉(zhuǎn)移的機(jī)制并通常提供了給定環(huán)境狀態(tài)下的選擇性優(yōu)勢。質(zhì)?？蓴y帶在競爭性環(huán)境生態(tài)位下對天然存在的抗生素提供抗性的基因，或可選擇地產(chǎn)生的所述蛋白可在相似環(huán)境下充當(dāng)毒素。

基因工程中應(yīng)用的“質(zhì)?！苯小百|(zhì)粒載體”。許多質(zhì)粒是可商購獲得用于此類應(yīng)用的。待復(fù)制的基因被插入到含有使細(xì)胞耐受特定抗生素的基因以及一個(gè)多克隆位點(diǎn)(mcs,或者多接頭)的質(zhì)?？截愔校龆嗫寺∥稽c(diǎn)是含有幾個(gè)允許dna片段在該位點(diǎn)容易插入的常用限制性位點(diǎn)的短區(qū)域。質(zhì)粒的另一主要用途是生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)。在此情況下，研究者生長含有質(zhì)粒的細(xì)菌，所述細(xì)菌含有目的基因。正如所述細(xì)菌產(chǎn)生賦予其抗生素耐藥性的蛋白，其也可以誘導(dǎo)用于由所述插入基因生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)。這是一種大規(guī)模生產(chǎn)基因或其編碼蛋白質(zhì)的廉價(jià)且簡單的方法。

“酵母人工染色體”或“yac”指用于克隆大片段dna(大于100kb并且高達(dá)3000kb)的載體。它是一種人工構(gòu)建的染色體并且含有端粒、著絲粒以及在酵母細(xì)胞中復(fù)制和保存所需的復(fù)制起始序列。應(yīng)用起始環(huán)狀質(zhì)粒構(gòu)建，通過應(yīng)用限制性內(nèi)切酶線性化，進(jìn)而dan連接酶可通過應(yīng)用粘性末端在所述線性分子內(nèi)加入目的序列或基因。酵母表達(dá)載體例如yacs、yips(酵母整合質(zhì)粒)以及yeps(酵母游離質(zhì)粒)十分有用，比如能夠獲得具有翻譯后修飾的真核細(xì)胞蛋白產(chǎn)物，如同酵母就是自身的真核細(xì)胞一樣，然而已發(fā)現(xiàn)yacs不如bacs穩(wěn)定，產(chǎn)生了嵌合體效應(yīng)。

“病毒載體”被定義為包含待遞送至體內(nèi)、離體或體外宿主細(xì)胞的多核苷酸的重組產(chǎn)生的病毒或病毒顆粒。病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、甲病毒載體等等。感染性煙草花葉病毒(tmv)為基礎(chǔ)的載體可用于制造蛋白質(zhì)并已被報(bào)道在煙葉中表達(dá)griffithsin(o'keefe等(2009)proc.nat.acad.sci.usa106(15):6099-6104)。甲病毒載體，例如基于森林腦炎病毒的載體和基于辛德畢斯病毒的載體，已被開發(fā)應(yīng)用于基因治療和免疫治療。參見schlesinger&dubensky(1999)curr.opin.biotechnol.5:434-439以及ying等(1999)nat.med.5(7):823-827。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移等方面，載體構(gòu)建物指包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或其部分以及治療性基因的多核苷酸。

如本文所述，“逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因”或“逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)”具有相同的意義，并且指基因或核酸序列憑借所述病毒進(jìn)入細(xì)胞且整合其基因組至宿主基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的過程。所述病毒可通過其正常的感染機(jī)制進(jìn)入宿主細(xì)胞，或通過使得其結(jié)合不同的宿主細(xì)胞表面受體或配體的修飾機(jī)制以進(jìn)入細(xì)胞。如本文所述，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體指能夠通過病毒或病毒進(jìn)入機(jī)制將外源核酸引入細(xì)胞的病毒顆粒。

逆轉(zhuǎn)錄病毒以rna形式攜帶其遺傳信息；然而，一旦病毒感染細(xì)胞，所述rna逆轉(zhuǎn)錄為能夠整合入所感染細(xì)胞基因組dna的dna形式。整合的dna形式稱為原病毒。

在dna病毒載體例如腺病毒(ad)或腺相關(guān)病毒(aav)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因等方面，載體構(gòu)建物指包含所述病毒基因組或其部分、以及轉(zhuǎn)基因的多核苷酸。腺病毒(ads)是一種相對完善的同質(zhì)組病毒，包括超過50種血清型。參見例如，pct國際申請wo95/27071。ads并不要求整合入所述宿主細(xì)胞基因組。還構(gòu)建了重組腺病毒衍生載體，特別是那些降低了野生型病毒的重組和生殖潛能的。參見pct國際申請wo95/00655和wo95/11984。野生型aav具有高傳染性和整合到宿主細(xì)胞基因組的高度特異性。參見hermonat&muzyczka(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:6466-6470以及l(fā)ebkowski等(1988)mol.cell.biol.8:3988-3996。

同時(shí)含有啟動(dòng)子以及多核苷酸能夠可操作地連接的克隆位點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域公知的。這樣的載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄rna，并可從例如(lajolla,ca)以及promegabiotech(madison,wi)的來源商購獲得。為優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，可能有必要去除、添加或改變所述克隆的5’和/或3’非翻譯部分，以消除額外的、潛在不恰當(dāng)?shù)奶娲g起始密碼子或可干擾或者在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平上降低表達(dá)的其它序列?；蛘?，可將共識核糖體結(jié)合位點(diǎn)緊鄰起始密碼子5’插入以增強(qiáng)表達(dá)。

基因遞送載體還包括dna/脂質(zhì)體復(fù)合物、膠束和靶病毒蛋白-dna復(fù)合物。還包含靶向抗體或其片段的脂質(zhì)體可用于本發(fā)明的方法。除了將多核苷酸遞送至細(xì)胞或細(xì)胞群，本文所述的蛋白質(zhì)進(jìn)入所述細(xì)胞或細(xì)胞群的直接引入可通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染的非限制性技術(shù)完成，或者，能夠增強(qiáng)本發(fā)明所述蛋白質(zhì)表達(dá)和/或促進(jìn)其活性的培養(yǎng)條件屬于其它的非限制性技術(shù)。

如本文所述，術(shù)語“抗體(單數(shù))”、“抗體(復(fù)數(shù))”和“免疫球蛋白”包括全抗體及其任意的抗原結(jié)合片段或單鏈。因此，術(shù)語“抗體”包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任意蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“抗體(單數(shù))”、“抗體(復(fù)數(shù))”和“免疫球蛋白”還包括任意同種型的免疫球蛋白、保留對抗原特異性結(jié)合的抗體的片段，包括但不限于fab、fab'、f(ab)2、fv、scfv、dsfv、fd片段、dab、vh、vl、vhh以及v-nar結(jié)構(gòu)域，小分子抗體、雙抗體、三抗體、四抗體以及kappa抗體，由一個(gè)或多個(gè)分離的抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體片段。這樣的例子包括但不限于重鏈或輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架(fr)區(qū)、或其任意部分、結(jié)合蛋白的至少一部分、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、以及包含抗體的抗原結(jié)合部分以及菲康體蛋白的融合蛋白。免疫球蛋白分子重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織的結(jié)合。當(dāng)術(shù)語“抗”用于蛋白質(zhì)名稱之前時(shí)，例如抗ihf、抗hu、抗ompp5，指代結(jié)合和/或具有對特定蛋白質(zhì)的親和力的單克隆抗體或多克隆抗體。例如，抗ihf是指結(jié)合ihf蛋白的抗體。所述特異性抗體可對其針對的蛋白以外的蛋白質(zhì)具有親和力或結(jié)合能力。例如，抗ihf，盡管特異性地抗ihf蛋白，還可以結(jié)合通過序列同源性或結(jié)構(gòu)同源性相關(guān)的其它蛋白。

所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性?？贵w可從任意合適的生物來源分離，例如小鼠、大鼠、綿羊和犬。

如本文所述，“單克隆抗體”指基本同質(zhì)的抗體群獲得的抗體。由于每個(gè)單克隆抗體針對抗原上的一種決定簇，單克隆抗體是高度特異的。所述抗體可以是被可檢測地標(biāo)記的，例如以放射性同位素、生成可檢測產(chǎn)物的酶、熒光蛋白等等。所述抗體可進(jìn)一步與其它基序結(jié)合，例如特異性的結(jié)合對成員如生物素(生物素-親和素特異性結(jié)合對成員)等等?？贵w還可以結(jié)合固相支持物，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等等。

單克隆抗體可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的雜交瘤技術(shù)或重組dna方法產(chǎn)生。雜交瘤是一種實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生的、由產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞和不產(chǎn)生抗體的腫瘤細(xì)胞(通常是多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤)融合而來的細(xì)胞。雜交瘤增殖并產(chǎn)生特異性單克隆抗體的連續(xù)性syple(continuoussyple)。生成或選擇抗體的可替代技術(shù)包括淋巴細(xì)胞對感興趣抗原的體外暴露，以及細(xì)胞、噬菌體或類似系統(tǒng)內(nèi)抗體展示文庫的篩選。

本文所用的術(shù)語“人類抗體”旨在包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人類抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，由體外隨機(jī)突變或位點(diǎn)特異性突變或者體內(nèi)的體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，本文所用的術(shù)語“人類抗體”不包括已移植到人類框架序列的來源于其它哺乳動(dòng)物品種(例如小鼠)cdr序列的抗體。因此，如本文所述，術(shù)語“人類抗體”指代基本上所述蛋白的每一部分(例如cdr，框架區(qū)，cl、ch結(jié)構(gòu)域(例如ch1、ch2、ch3)，鉸鏈區(qū)，(vl,vh))在人體內(nèi)基本無免疫原性的、僅具有極小序列改變或變化的抗體。相似地，指定靈長類(猴、狒狒、黑猩猩等等)、嚙齒動(dòng)物(小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、倉鼠等等)以及其它哺乳動(dòng)物的抗體命名為這些物種、亞屬、屬、亞家族、家族特異性抗體。進(jìn)一步地，嵌合抗體包含上述抗體的任意組合。這樣的改變或變化可選地并且優(yōu)選在人類或其它物種中相對于非修飾抗體保留或降低免疫原性。因此，人類抗體不同于嵌合抗體或人源化抗體。需要指出，人類抗體可通過非人動(dòng)物或能夠表達(dá)功能性重排的人免疫球蛋白(例如，重鏈和/或輕鏈)基因的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞產(chǎn)生。進(jìn)一步的，當(dāng)人類抗體是單鏈抗體時(shí)，其可包含在天然人類抗體中未發(fā)現(xiàn)的連接肽。例如，fv可包含如兩個(gè)到八個(gè)甘氨酸或其它氨基酸殘基的連接肽，其連接所述重鏈的可變區(qū)與所述輕鏈的可變區(qū)。這種連接肽被認(rèn)為是人類起源的。

如本文所述，人類抗體“來自”特定的種系序列，如果所述抗體自應(yīng)用人類免疫球蛋白序列的系統(tǒng)獲得，例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫。來自人種系免疫球蛋白序列的人類抗體可通過例如所述人類抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列相比較來鑒定。選擇的人類抗體通常與由人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且含有當(dāng)與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，小鼠種系序列)比較時(shí)鑒定所述人類抗體屬于人類的氨基酸殘基。在某些情況下，人類抗體與所述種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常地，來自特定人種系序列的人類抗體展示的與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列的差異不超過10個(gè)氨基酸。在某些情況下，所述人類抗體可展示與所述種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列的差異不超過5個(gè)、或甚至不超過4、3、2或者1個(gè)氨基酸。

“人單克隆抗體”指具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的、展示單一結(jié)合特異性的抗體。所述術(shù)語也意指重組人類抗體。制備這樣的抗體的方法如本文所述。

本文所述的術(shù)語“重組人類抗體”包括所有通過重組方式制備、表達(dá)、建立或分離的人類抗體，例如分離自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(transchromosomal)動(dòng)物(例如小鼠)或由此制得的雜交瘤的抗體，分離自轉(zhuǎn)化為表達(dá)所述抗體的宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)染瘤)的抗體，分離自重組、組合的人抗體文庫的抗體，以及通過其它涉及人免疫球蛋白基因序列與其它dna序列拼接的方式而制備、表達(dá)、建立或分離的抗體。這樣的重組人類抗體具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在某些具體實(shí)施方式中，盡管所述重組人類抗體可發(fā)生體外突變(或者當(dāng)應(yīng)用人ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞突變)，并且所述重組抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列是來自或與人種系vh和vl序列相關(guān)的序列時(shí)，其可能不會(huì)自然存在于體內(nèi)的人類抗體種系系統(tǒng)(repertoire)內(nèi)。制備這些抗體的方法如本文所述。

如本文所述，嵌合抗體是其輕鏈和重鏈基因通常已通過基因工程由屬于不同物種的抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因構(gòu)建的抗體。

如本文所述，術(shù)語“人源化抗體”或“人源化免疫球蛋白”指含有來自非人類免疫球蛋白的最小序列的人類/非人類嵌合抗體。大多數(shù)情況下，人源化抗體是受者可變區(qū)的殘基被非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、或具有所需特異性、親和性以及能力的非人靈長類)(供者抗體)可變區(qū)殘基取代的人類免疫球蛋白(受者抗體)。人源化抗體可包含在受者抗體或供者抗體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的殘基。所述人源化抗體可選地還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)、通常是人類免疫球蛋白的所述免疫球蛋白恒定區(qū)、含有框架區(qū)、恒定區(qū)或已被來自人類抗體相應(yīng)位置氨基酸替代的cdr的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的非人類抗體的至少一部分。一般說來，期望人源化抗體相比于相同抗體的非人源化版本在人類宿主內(nèi)產(chǎn)生降低的免疫反應(yīng)。人源化抗體可具有基本上不影響抗原結(jié)合或其它抗體功能的保守氨基酸替換。保守替換組合包括：甘氨酸-丙氨酸，纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，絲氨酸-蘇氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

本文所述的術(shù)語“多克隆抗體”或“多克隆抗體組合物”指來自不同b細(xì)胞系的抗體制劑。它們是分泌針對特定抗原的免疫球蛋白分子的混合物，每個(gè)識別不同的表位。

如本文所述，術(shù)語“抗體衍生物”包含全長抗體或抗體片段，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸通過烷基化、peg化、?；Ⅴバ纬苫蝓０沸纬傻鹊然瘜W(xué)修飾，例如用于連接抗體與第二分子?？贵w衍生物包括但不限于peg化抗體、半胱氨酸-peg化抗體及其變體。

如本文所述，術(shù)語“標(biāo)簽”指直接或間接結(jié)合待測組合物的可直接或間接檢測的化合物或組合物，例如n末端組氨酸標(biāo)簽(n-his)，磁活性同位素例如115sn、117sn以及119sn，非放射性同位素例如13c和15n，多核苷酸或蛋白質(zhì)例如抗體以產(chǎn)生標(biāo)記的組合物。所述術(shù)語還包括提供插入序列表達(dá)的信號的連接所述多核苷酸的序列，例如綠色熒光蛋白(gfp)等等。所述標(biāo)簽可通過自身可檢測(例如放射性同位素標(biāo)簽或熒光素標(biāo)簽)或者，在酶促標(biāo)簽的情況下，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)變化。因此，適宜的標(biāo)簽包括但不限于磁活性同位素、染料以及包括酶的蛋白質(zhì)。所述標(biāo)簽可被簡單地檢測或可被定量。簡單檢測的反應(yīng)通常包括僅僅是確認(rèn)其存在的反應(yīng)，而定量的反應(yīng)通常包括具有可定量(例如可數(shù)值式報(bào)告)值(例如強(qiáng)度、極化和/或其它特性)的反應(yīng)。在發(fā)光或熒光實(shí)驗(yàn)中，可以應(yīng)用與事實(shí)上涉及結(jié)合的實(shí)驗(yàn)成分相關(guān)的發(fā)光團(tuán)或熒光直接產(chǎn)生、或者間接應(yīng)用與另一成分(例如報(bào)告分子或指示分子)相關(guān)的發(fā)光團(tuán)或熒光產(chǎn)生可檢測反應(yīng)。產(chǎn)生信號的發(fā)光標(biāo)記的例子包括但不限于生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光?？蓹z測的發(fā)光反應(yīng)通常包含發(fā)光信號的改變或發(fā)生。適宜的方法以及用于發(fā)光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組分的發(fā)光團(tuán)是本領(lǐng)域已知的并且記載在例如haugland,richardp.(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(第6版)中。熒光探針的例子包括但不限于水母發(fā)光蛋白和熒光素酶。

如本文所述，術(shù)語“免疫偶聯(lián)”包括與第二試劑相關(guān)或連接的抗體或抗體衍生物，所述第二試劑例如細(xì)胞毒性劑、可檢測劑、放射性劑、靶向劑、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、合成抗體、半合成抗體或多特異性抗體。

合適的熒光標(biāo)記的例子包括但不限于熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、曙紅、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、芪、螢黃、cascadebluetm以及德克薩斯紅。其它合適的光學(xué)染料記載在haugland,richardp.(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(第6版)中。

另一方面，所述熒光標(biāo)記官能化地促進(jìn)與存在于所述細(xì)胞或組織內(nèi)或表面的細(xì)胞成分(例如細(xì)胞表面標(biāo)記)共價(jià)結(jié)合。合適的功能性基團(tuán)包括但不限于異硫氰酸酯基團(tuán)、氨基基團(tuán)、鹵代乙酰基、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基酯和磺酰鹵，所有這些可用于將所述熒光標(biāo)記連接到第二分子。熒光標(biāo)記的功能性基團(tuán)的選擇取決于連接或者是接頭、所述試劑、所述標(biāo)記，或者是第二標(biāo)記試劑的位點(diǎn)。

“真核細(xì)胞”包含除原核生物外的生命王國的所有生物。它們可通過膜結(jié)合核簡單區(qū)分。動(dòng)物、植物、真菌以及原生動(dòng)物是通過內(nèi)部膜和細(xì)胞骨架將其組織成復(fù)合結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞或有機(jī)體。膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的最主要特征是所述核。除非特別申明，術(shù)語“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。真核細(xì)胞或宿主的非限制性例子包括猴、牛、豬、小鼠、大鼠、鳥類、爬行動(dòng)物和人類。

“原核細(xì)胞”通常缺少核或任何其它的膜結(jié)合細(xì)胞器，并分為兩個(gè)領(lǐng)域，細(xì)菌和古細(xì)菌。除了染色體dna，這些細(xì)胞還可以包含稱為附加體的圓環(huán)內(nèi)的遺傳信息。細(xì)菌細(xì)胞非常小，差不多是動(dòng)物線粒體的大小(約1-2μm的直徑以及10μm長)。原核細(xì)胞以三種主要形狀為特征：桿形、球形和螺旋形。細(xì)菌細(xì)胞通過二分裂的方式分裂，代替了如真核細(xì)胞的復(fù)雜的復(fù)制過程。細(xì)菌的例子包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)菌，大腸桿菌的細(xì)菌，和沙門氏菌細(xì)菌。

“原生”或“天然”抗原是含有表位的多肽、蛋白質(zhì)或片段，其是從天然的生物源分離的，并能夠特異性結(jié)合抗原受體特別是受試者內(nèi)的t細(xì)胞抗原受體(tcr)。

術(shù)語“抗原”和“抗原性”指具有被抗體識別的能力或以其它方式充當(dāng)抗體-配體對成員的分子?！疤禺愋越Y(jié)合”指抗原與免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的相互作用?？贵w-抗原結(jié)合可發(fā)生在體內(nèi)或體外。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂肪酸、脂質(zhì)、脂多糖和多糖的大分子具有充當(dāng)抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)進(jìn)一步理解，編碼具有充當(dāng)抗體配體能力的蛋白質(zhì)的核酸一定是編碼抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)進(jìn)一步理解，抗原不限于全長分子，還可包括部分分子。術(shù)語“抗原性”是具有抗原特性的分子的形容詞性參考。所述術(shù)語涵蓋具有免疫原性的物質(zhì)例如免疫原，以及包括誘導(dǎo)免疫無應(yīng)答或無反應(yīng)性的物質(zhì)例如anergens。

“改變的抗原”是主要序列與相應(yīng)的野生型抗原不同的抗原。改變的抗原可通過合成或重組的方法制備，包括但不限于，翻譯時(shí)或翻譯后差異修飾(例如通過磷酸化，糖基化，交聯(lián)，酰化，蛋白水解裂解，連接抗體分子、膜分子或其它配體)的抗原性肽(ferguson等(1988)ann.rev.biochem.57:285-320)。本發(fā)明的合成肽或改變的抗原的目的是類似天然表位結(jié)合相同的tcr。

在此也指代天然或野生型抗原的“自身抗原”是一種在受試者中極少或不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原性肽，歸結(jié)于所述抗原的自身耐受性。自身抗原的例子是黑色素瘤特異性抗原gp100。

術(shù)語“主要組織相容復(fù)合物”或“mhc”指編碼抗原呈遞至t細(xì)胞以及快速移植排異所需的細(xì)胞表面分子的基因的復(fù)合物。在人類中，mhc也稱為“人白細(xì)胞抗原”或“hla”復(fù)合物。由mhc編碼的蛋白稱為“mhc分子”并分為mhci類分子和mhcii類分子。mhci類分子包括由mhc編碼的α鏈非共價(jià)結(jié)合β2微球蛋白組成的膜異源二聚體蛋白。mhci類分子幾乎為所有有核細(xì)胞所表達(dá)并顯示出在cd8+t細(xì)胞抗原呈遞中的功能。人類中的i類分子包括hla-a、b和c。mhcii類分子也包括由非共價(jià)結(jié)合的α鏈和β鏈組成的膜異源二聚體蛋白。已知mhcii類分子在cd4+細(xì)胞中起作用，并且在人類中包括hla-ap、-dq以及dr。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物和配體可以與任意hla型的mhc分子復(fù)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉hla的血清型和基因型。參見：bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hlacoefficientviewingpage.rammenseeh.g.,bachmannj和stevanovics.mhcligandsandpeptidemotifs(1997)chapman&hallpublishers；schreuderg.m.th等thehladictionary(1999)tissueantigens54:409-437。

本文所用的術(shù)語“抗原呈遞基質(zhì)”意指能夠以所述抗原被t細(xì)胞表面的t細(xì)胞抗原受體結(jié)合的方式遞呈抗原的分子或多個(gè)分子。所述抗原呈遞基質(zhì)可在apc微囊制劑中處于抗原呈遞細(xì)胞(apc)的表面，或以合成基質(zhì)的形式存在于類似珠或板的固相支持物上。合成的抗原呈遞基質(zhì)的例子有復(fù)合β2微球蛋白的純化的mhci類分子、此類純化mhci類分子的多聚體、純化的mhcii類分子、或其連接固相支持物的功能部分。

術(shù)語“抗原呈遞細(xì)胞”指能夠以被免疫系統(tǒng)中的特異性效應(yīng)細(xì)胞識別的抗原-mhc復(fù)合物形式呈遞一個(gè)或多個(gè)抗原，從而誘導(dǎo)針對所述抗原或所呈遞抗原的有效細(xì)胞免疫應(yīng)答的一類細(xì)胞。盡管很多類型的細(xì)胞能夠呈遞抗原至其細(xì)胞表面用于t細(xì)胞識別，但僅僅專職apcs具有呈遞有效量抗原并進(jìn)一步激活t細(xì)胞的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)應(yīng)答的能力。apcs可以是完整的全細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞核樹突狀細(xì)胞；或其它的天然產(chǎn)生或合成的分子例如復(fù)合β2微球蛋白的純化mhci類分子。

術(shù)語“樹突狀細(xì)胞(dcs)”指在各種淋巴和非淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的形態(tài)相似細(xì)胞類型的不同種群(steinman(1991)ann.rev.immunol.9:271-296)。樹突狀細(xì)胞構(gòu)成最有效及首選的哺乳動(dòng)物apcs。部分(如果不是全部)dc細(xì)胞來自骨髓前體細(xì)胞，外周血中有少量循環(huán)并且或者以不成熟的朗格漢斯細(xì)胞或者以終末分化成熟細(xì)胞出現(xiàn)。盡管dcs可從單核細(xì)胞衍生而來，但它們具有不同的表型。例如，在樹突狀細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)一種特定的分化標(biāo)記cd14抗原，但其在單核細(xì)胞中由單核細(xì)胞高表達(dá)。參見例如jersmann等,(2005)immunol.cellbiol.83:462。

此外，成熟的樹突狀細(xì)胞不是吞噬性的，而單核細(xì)胞是強(qiáng)吞噬細(xì)胞。成熟的單核細(xì)胞和dcs通過不同的機(jī)制內(nèi)吞物質(zhì)。單核細(xì)胞通過細(xì)胞吞噬的方式吞食，而dcs利用巨胞飲作用。因此，dcs相比于單核細(xì)胞通常吞食較小的物質(zhì)(參見例如conner和schmid,(2003)nature433:37-44)。已表明dcs與其它抗原呈遞細(xì)胞具有相同的內(nèi)生活性(endocyticallyactive)，并提供了t細(xì)胞激活與增殖所必需的所有信號(參見例如levine和chain,(1992)onas89(17):8342)。

術(shù)語“抗原呈遞細(xì)胞募集因子”或“apc募集因子”同時(shí)包括完整全細(xì)胞以及能夠募集抗原呈遞細(xì)胞的其它分子。合適的apc募集因子的例子包括例如白細(xì)胞介素4(il4)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、sepragel以及巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(mip3α)的分子。它們可從immunex,schering-ploughandr&dsystems(minneapolis,minn.)獲得。它們也可以應(yīng)用currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等主編(1987))所公開的方法重組生產(chǎn)。與上述提到因子具有相同生物活性的肽、蛋白質(zhì)以及化合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

術(shù)語“免疫效應(yīng)細(xì)胞”指能夠結(jié)合抗原并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括但不限于t細(xì)胞、b細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞和細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞ctls)例如ctl細(xì)胞系、ctl克隆以及來源于腫瘤、炎癥或其它浸潤的ctls。已確定某些疾病組織表達(dá)特異性抗原以及特異于這些抗原的ctls。

本文所述的術(shù)語“免疫效應(yīng)分子”指能夠抗原特異性結(jié)合的分子，并包括抗體、t細(xì)胞抗原受體、b細(xì)胞抗原受體以及mhci類和ii類分子。

“幼稚”免疫效應(yīng)細(xì)胞是一種從未暴露于可激活該細(xì)胞的抗原的免疫效應(yīng)細(xì)胞。幼稚免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活需要抗原:mhc復(fù)合物的識別以及經(jīng)專職apc的共刺激信號的同時(shí)傳遞，以增殖和分化為抗原特異性武裝的效應(yīng)t細(xì)胞?；罨膖細(xì)胞能夠通過提供共刺激信號經(jīng)免疫突觸再激活特異性b細(xì)胞?；罨腷細(xì)胞隨后產(chǎn)生針對特定抗原的抗體。幼稚b細(xì)胞也可以通過t細(xì)胞非依賴機(jī)制活化。這種情況發(fā)生在抗原能夠結(jié)合b細(xì)胞受體并產(chǎn)生共刺激信號時(shí)。

“免疫應(yīng)答”廣泛地指代淋巴細(xì)胞對外源物質(zhì)的抗原特異性應(yīng)答。術(shù)語“免疫原”和“免疫原性”指代具有引發(fā)免疫應(yīng)答能力的分子。所有的免疫原都是抗原，然而并非所有的抗原都是免疫原。本發(fā)明的免疫應(yīng)答可以是體液免疫(通過抗體活性)或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(通過t細(xì)胞活化)。所述應(yīng)答可發(fā)生在體內(nèi)或體外。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解各種大分子，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂肪酸、脂質(zhì)、脂多糖和多糖有可能是免疫原性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解編碼能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的分子的核酸必需編碼免疫原。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解免疫原不限于全長分子，還可包括部分分子。

術(shù)語“被動(dòng)免疫”指免疫力通過抗體的轉(zhuǎn)移從一個(gè)受試者轉(zhuǎn)移至另一個(gè)受試者。被動(dòng)免疫可自然發(fā)生，如當(dāng)母體抗體轉(zhuǎn)移到胎兒時(shí)。過繼免疫還可以人為發(fā)生，如當(dāng)抗體組合物施用給非免疫受試者時(shí)?？贵w供者和受者可以是人類或非人類受試者?？贵w可以是多克隆或單克隆的，可以在體外或體內(nèi)生成，并且根據(jù)環(huán)境可以是純化的、部分純化的或未純化的。在本文的某些具體實(shí)施方式中，過繼免疫通過特異性識別或結(jié)合特定抗原的抗體或抗原結(jié)合片段的給藥賦予給有此需要的受試者。在某些具體實(shí)施方式中，過繼免疫通過編碼特異性識別或結(jié)合特定抗原的抗體或抗原結(jié)合片段的分離或重組多核苷酸的給藥賦予。

在本發(fā)明的上下文中，“配體”是多肽。一方面，本文所用的術(shù)語“配體”指結(jié)合另一分子特定位點(diǎn)的任意分子。換句話說，配體將與免疫效應(yīng)細(xì)胞或抗體反應(yīng)的所述蛋白的特異性賦予蛋白質(zhì)或由dna賦予給蛋白質(zhì)。一方面，與免疫效應(yīng)細(xì)胞上互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合的是所述蛋白內(nèi)的配體位點(diǎn)。

一方面，本發(fā)明的肽或配體結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗原決定簇或表位，例如抗體或t細(xì)胞受體(tcr)。配體可以是本發(fā)明的抗原、肽、蛋白質(zhì)或表位。

另一方面，配體可結(jié)合抗體上的受體。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的配體為約4-約8個(gè)氨基酸長度。

在又一方面，配體可結(jié)合mhci類分子上的受體。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的配體為約7-約11個(gè)氨基酸長度。

在又一方面，配體可結(jié)合mhcii類分子上的受體。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的配體為約10-約20個(gè)氨基酸長度。

如本文所述，術(shù)語“受驅(qū)動(dòng)的抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞”是如上文所定義的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其曾經(jīng)遇到過抗原。與幼稚效應(yīng)細(xì)胞相比，受驅(qū)動(dòng)的抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化不需要共刺激信號。所述肽:mhc復(fù)合物的識別就足夠了。

當(dāng)“活化”與t細(xì)胞相關(guān)時(shí)，意味著所述細(xì)胞不再是g0期，并開始產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素、細(xì)胞因子以及其它膜相關(guān)蛋白。所述細(xì)胞類型(例如cd8⁺或cd4⁺)的特征是能夠識別和結(jié)合在其表面展示特定抗原的任意靶細(xì)胞，并釋放其效應(yīng)分子。

術(shù)語“交叉反應(yīng)”用于描述功能重疊的本發(fā)明的化合物。更特別地，通過變構(gòu)配體，天然配體和/或由此活化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的免疫原性特征在某種程度上是共享的，這樣，所述變構(gòu)配體與所述天然配體和/或由此活化的免疫效應(yīng)細(xì)胞是“交叉反應(yīng)”的。為了本發(fā)明的目的，交叉反應(yīng)是表現(xiàn)在多個(gè)級別上的：(i)配體級別，例如變構(gòu)配體可結(jié)合天然配體ctls的tcr并活化該ctls；(ii)t細(xì)胞級別，例如本發(fā)明的變構(gòu)配體結(jié)合一群t細(xì)胞(不同于天然配體ctls群體)的tcr并活化所述t細(xì)胞，所述t細(xì)胞可有效靶向并裂解展示所述天然配體的細(xì)胞；以及(iii)抗體級別，例如“抗”變構(gòu)配體的抗體可以檢測、識別和結(jié)合天然配體并起始免疫應(yīng)答中的效應(yīng)機(jī)制，其最終導(dǎo)致天然配體由宿主中清除。

如本文所述，術(shù)語“在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”是本領(lǐng)域很好理解的術(shù)語，并意指在將所述抗原(或表位)導(dǎo)入受試者后，相對于抗原(或表位)導(dǎo)入受試者之前的免疫反應(yīng)(如果有)，可檢測或測量到對抗原(或表位)的免疫應(yīng)答增加了至少約2倍、更優(yōu)選地至少約5倍、更優(yōu)選地至少約10倍、更優(yōu)選地至少約100倍、甚至更優(yōu)選地至少約500倍、甚至更優(yōu)選地至少約1000倍或更多。對抗原(或表位)的免疫應(yīng)答包括但不限于抗原特異性(或表位特異性)抗體的產(chǎn)生，以及其表面表達(dá)特異性結(jié)合抗原(或表位)的分子的免疫細(xì)胞的產(chǎn)生。確定對給定抗原(或表位)的免疫應(yīng)答是否已誘導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，抗原特異性抗體可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的各種免疫測試來檢測，包括但不限于elisa，其中，例如，通過可檢測標(biāo)記的第二抗體(例如酶標(biāo)小鼠抗人ig抗體)檢測樣品中抗體與固定抗原(或表位)的結(jié)合。

“共刺激分子”涉及表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞和t細(xì)胞表面的受體-配體對的相互作用。過去幾年的累計(jì)研究已信服地證明靜息t細(xì)胞至少需要兩種信號用于誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因表達(dá)與增殖(schwartz(1990)science248:1349-1356以及jenkins(1992)immunol.today13:69-73)。賦予特異性的一個(gè)信號可通過tcr/cd3復(fù)合物與合適的mhc/肽復(fù)合物的相互作用產(chǎn)生。第二信號不是抗原特異性的并被稱為“共刺激”信號。這種信號最初被定義為由骨髓源輔助細(xì)胞(例如被稱為“專職”apcs的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)提供的活性。已有數(shù)種分子顯示增強(qiáng)共刺激活性。這些是熱穩(wěn)定抗原(hsa)(liu等(1992)j.exp.med.175:437-445)、硫酸軟骨素改性的mhc不變鏈(ii-cs)(naujokas等(1993)cell74:257-268)、細(xì)胞間粘附分子1(icam-1)(van(1992)cell71:1065-1068)。這些分子各顯示出通過與其同源的t細(xì)胞上的配體的相互作用協(xié)助共同刺激。共刺激分子調(diào)節(jié)共刺激信號，其是在正常生理?xiàng)l件下獲得幼稚t細(xì)胞的完全活化所必需的。一個(gè)示范性的受體-配體對是，apcs表面的b7共刺激分子及其在t細(xì)胞上的對應(yīng)受體cd28或ctla-4(freeman等(1993)science262:909-911；young等(1992)j.clin.invest.90:229以及nabavi等(1992)nature360:266-268)。其它重要的共刺激分子是cd40、cd54、cd80以及cd86。術(shù)語“共刺激分子”涵蓋了當(dāng)與被t細(xì)胞表面的tcr結(jié)合時(shí)的肽/mhc復(fù)合物共同作用時(shí)，提供獲得結(jié)合所述肽的t細(xì)胞活化的共刺激效應(yīng)的分子或分子組合。該術(shù)語因而涵蓋了b7、或在抗原呈遞基質(zhì)(例如apc)上的其它共刺激分子、或當(dāng)t細(xì)胞表面的tcr特異性結(jié)合所述肽時(shí)與肽/mhc復(fù)合物一起結(jié)合同源配體并導(dǎo)致所述t細(xì)胞活化的片段(單獨(dú)的、與另一(些)分子復(fù)合、或作為融合蛋白的一部分)。共刺激分子可從各種來源商購獲得，包括例如beckmancoulter,inc.(fullerton,calif.)。雖然并不總是明確規(guī)定，與野生型或純化的共刺激分子(例如重組產(chǎn)生或其突變蛋白)具有相似生物學(xué)活性的分子意在用于本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。

如本文所述，可互換使用的“固相支持物”或“固體支持物”不限于特定類型的支持物。相當(dāng)多的支持物是可以獲得的并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。固相支持物包括硅膠、樹脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化鋁凝膠。如本文所述，“固體支持物”還包括合成的抗原呈遞基質(zhì)、細(xì)胞和脂質(zhì)體?？苫诓煌桨杆璧淖罱K應(yīng)用以及適合性選擇合適的固相支持物。例如用于肽合成，固相支持物可以指樹脂，例如聚苯乙烯(例如從bacheminc.,peninsulalaboratories等獲得的pam-樹脂)、polyhipe.rtm.樹脂(從aminotech,canada獲得)、聚酰胺樹脂(從peninsulalaboratories獲得)、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯樹脂(tentagel.rtm.,rapppolymere,tubingen,germany)或聚二甲基樹脂(從milligen/biosearch,calif獲得)。

固相支持物的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、葡聚糖、天然或改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖以及磁鐵。所述載體的性質(zhì)或者是一定程度可溶的或者是不溶的。支持物可具有幾乎任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要所偶聯(lián)分子能夠結(jié)合多核苷酸、多肽或抗體。因此，所述支持物構(gòu)型可以是像珠子的球形，或在試管內(nèi)表面的圓柱形，或是桿的外表面?；蛘撸霰砻婵梢允瞧降?，例如薄板、測試條等等，或者可選地聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多其它的適合抗體或抗原結(jié)合的載體，或能夠通過應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定這樣的載體。

本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的分子、大分子復(fù)合物或細(xì)胞，并涵蓋了僅有本發(fā)明的合成抗原肽或本發(fā)明所描述的各種制劑中的任何一個(gè)；包含本發(fā)明合成抗原肽的多肽；編碼本發(fā)明的肽或多肽的多核苷酸；結(jié)合抗原呈遞基質(zhì)上的mhci類或ii類分子的本發(fā)明的合成抗原肽，所述抗原呈遞基質(zhì)包括apc以及合成抗原呈遞基質(zhì)(共刺激分子存在或不存在)；與另一(些)分子或大分子結(jié)構(gòu)共價(jià)或非共價(jià)復(fù)合的本發(fā)明的合成抗原肽；以及特異于本發(fā)明肽的受驅(qū)動(dòng)的抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞。

術(shù)語“調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答”包括誘導(dǎo)(增加、引發(fā))免疫應(yīng)答；以及削弱(抑制)免疫應(yīng)答。免疫調(diào)節(jié)方法(或方案)是在調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的方法。

如本文所述，術(shù)語“細(xì)胞因子”指對細(xì)胞產(chǎn)生各種影響的許多因子中的任意一種，例如誘導(dǎo)生長或增殖?？稍诒景l(fā)明實(shí)踐中單獨(dú)或組合使用的細(xì)胞因子的非限制性例子包括，白細(xì)胞介素2(il-2)、干細(xì)胞因子(scf)、白細(xì)胞介素3(il-3)、白細(xì)胞介素6(il-6)、白細(xì)胞介素12(il-12)、g-csf、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、白細(xì)胞介素1α(il-1α)、白細(xì)胞介素11(il-11)、mip-11、白血病抑制因子(lif)、c-kit配體、血小板生成素(tpo)和flt3配體。本發(fā)明還包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子從培養(yǎng)基中明確排除的培養(yǎng)條件。細(xì)胞因子可從數(shù)家供應(yīng)商商購獲得，例如genzyme(framingham,mass.),genentech(southsanfrancisco,calif.),amgen(thousandoaks,calif.),r&dsystems(minneapolis,minn.)以及immunex(seattle,wash.)。盡管并不總是明確規(guī)定，與野生型或純化細(xì)胞因子(例如重組產(chǎn)生或其突變蛋白)具有相似生物學(xué)活性的分子意在用于本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。

診斷和治療方法

提供了一種用于抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna結(jié)合的方法，其通過所述dnabii多肽或蛋白質(zhì)或所述微生物dna與干擾劑相接觸，從而抑制、競爭或中和dnabii蛋白質(zhì)或多肽與微生物dna結(jié)合。另一方面，所述dnabii多肽與微生物dna是可檢測標(biāo)記的，例如以彼此緊密接觸時(shí)能夠發(fā)出信號的發(fā)光分子標(biāo)記。所述接觸可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

另一方面，通過生物膜與干擾劑的接觸提供了一種抑制、預(yù)防或分解微生物膜的方法，從而抑制、預(yù)防或分解所述微生物膜。另一方面，dnabii多肽與微生物dna是可檢測標(biāo)記的，例如以彼此緊密接觸時(shí)能夠發(fā)出信號的發(fā)光分子標(biāo)記。所述接觸可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

在體外實(shí)踐時(shí)，所述方法用于篩選或確認(rèn)與本發(fā)明的多肽、多核苷酸、抗體、宿主細(xì)胞、小分子以及組合物具有相同、相似或相反能力的干擾劑。或者，它們可用于鑒定哪一種干擾劑最適于治療微生物感染。例如，可以通過兩種含有例如dnabii多肽與微生物dna以及待測試劑的樣品篩選新試劑或治療組合。第二樣品含有dnabii多肽與微生物dna以及已知作用的試劑，例如抗ihf-抗體或作為陽性對照的小分子。另一方面，將所提供的數(shù)種樣品和所述干擾劑加入到稀釋度增加的系統(tǒng)中以確定臨床上有效治療受試者的最佳劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，可提供含有dnabii多肽與微生物dna的陰性對照。另一方面，所述dnabii多肽與微生物dna是可檢測標(biāo)記的，例如以彼此緊密接觸時(shí)能夠發(fā)出信號的發(fā)光分子標(biāo)記。在類似的條件下將所述樣品包含所述試劑有效時(shí)間量，以抑制、競爭或中和dnabii多肽與微生物dna間的相互作用，繼而檢測所述樣品中由所述發(fā)光分子發(fā)射的信號。如果所述樣品發(fā)射信號，那么所述試劑不能有效抑制結(jié)合。

另一方面，在小型化室玻片系統(tǒng)中實(shí)施所述體外方法，其中引發(fā)感染的微生物(例如細(xì)菌)分離物可從人類/動(dòng)物分離，隨后培養(yǎng)以允許其作為生物膜在體外生長，參見例如下述的實(shí)施例1。所述干擾劑(例如抗ihf抗體)或潛在干擾劑生物膜單獨(dú)或與另一試劑組合加入至培養(yǎng)基，所述潛在干擾劑或干擾劑如抗ihf(或其它抗體、小分子、試劑等等)具有或不具有增加的稀釋度，用以找到將其遞送至所述感染存在的受試者時(shí)能有效治療患者的最佳劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，陽性對照和陰性對照可同時(shí)進(jìn)行。

另一方面，所述方法可在流通池內(nèi)具有干擾劑(例如抗ihf抗體)和/或潛在干擾劑(單獨(dú)或與另一試劑組合)的高通量平臺實(shí)施。所述干擾劑(例如抗ihf抗體)或潛在干擾劑生物膜單獨(dú)或與另一試劑組合加入至培養(yǎng)基，所述潛在干擾劑或干擾劑如抗ihf(或其它抗體、小分子、試劑等等)具有或不具有增加的稀釋度，用以找到將其遞送至所述感染存在的受試者時(shí)能有效治療患者的最佳劑量。生物膜分離物是從dnabii多肽(例如結(jié)合微生物dna的ihf)超聲分離的生物膜細(xì)菌。所述dnabii多肽-dna復(fù)合物憑借所述平臺上的抗ihf抗體分離。然后所述微生物dna以例如鹽洗滌釋放，并用于鑒定所添加的生物膜細(xì)菌。然后游離的dna通過例如pcr測序鑒定。如果dna不是游離的，則所述干擾劑成功進(jìn)行或結(jié)合所述微生物dna。如果樣品中發(fā)現(xiàn)了dna，則所述試劑不干擾dnabii多肽-微生物dna結(jié)合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，陽性對照和陰性對照可同時(shí)進(jìn)行。

上述的方法也可以用做診斷測試，因?yàn)榻o定細(xì)菌種類通過一個(gè)試劑比另一試劑更好地應(yīng)答其生物膜逆轉(zhuǎn)是可能的，這種快速高通量檢測系統(tǒng)允許本領(lǐng)域技術(shù)人員檢測一組可能的抗ihf樣試劑以鑒定該組中最有效的。

這些方法的優(yōu)勢在于，大多數(shù)醫(yī)院內(nèi)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室已配備應(yīng)用生長在液體培養(yǎng)基中(或浮游地)的細(xì)菌進(jìn)行這些各種各樣測試(例如，測定mic、mbc值)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，當(dāng)細(xì)菌引起疾病時(shí)通常不浮游生長。取而代之的是，它們作為穩(wěn)定的生物膜生長并且這些生物膜更顯著地耐受抗生素、抗體治療或其它療法。這種耐受性是為什么大多數(shù)mic/mbc值不能準(zhǔn)確預(yù)測體內(nèi)療效的原因。因此，通過確定何種“劑量”試劑能在體外逆轉(zhuǎn)細(xì)菌微生物膜(如上所述)，申請人的臨床前檢測將是臨床療效、甚至作為個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用的一個(gè)更可靠的預(yù)測。

除了臨床環(huán)境，所述方法可用于鑒定引起所述感染的微生物和/或確定工業(yè)環(huán)境下的有效干擾劑。

在上述方法的又一方面，順序或同時(shí)添加已知抑制潛在感染生長的抗生素或抗菌劑，以鑒定所述感染是否被抑制。另外，還可以在加入所述缺失復(fù)合物之前加入所述微生物dna或dnabii多肽的干擾劑以檢測生物膜抑制。

當(dāng)在非人動(dòng)物例如南美栗鼠體內(nèi)實(shí)踐時(shí)，所述方法提供了鑒定可單獨(dú)或與其它試劑組合以分解生物膜的干擾劑的臨床前篩選。這種方法的例子如下述的實(shí)施例2-7所述。

另一方面，本文提供了一種抑制、預(yù)防或分解受試者體內(nèi)生物膜的方法，其通過給受試者施用有效量的干擾劑，從而抑制、預(yù)防或分解所述微生物生物膜。這種方法的例子如下述的實(shí)施例2-7所述。

為了上述提到的體外和體內(nèi)方法的目的，所述干擾劑是下述組內(nèi)的：

(a)分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或其片段或等價(jià)物；

(b)分離或重組的來源于e.coli株系u93的組蛋白樣蛋白(hu)多肽或其片段或等價(jià)物；

(c)分離或重組的表8、表9a、表9b、表10所確定的蛋白或多肽或圖6所確定的dna結(jié)合肽，或其片段或等價(jià)物；

(d)分離或重組的seqidno.1至340的多肽，或其片段或等價(jià)物；

(e)分離或重組的seqidno.6-11、28、29、42-100、表8的c末端多肽或表10所確定的那些c末端多肽或其片段或等價(jià)物；

(f)與整合宿主因子競爭性結(jié)合微生物dna的多肽或多核苷酸；

(g)類似holliday交叉的四路交叉多核苷酸，類似復(fù)制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或彎曲的多核苷酸；

(h)編碼(a)至(f)中任意一種的分離或重組的多核苷酸，或seqidno.36的分離或重組的多核苷酸或其等價(jià)物，或在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸、其等價(jià)物或互補(bǔ)分子；

(i)特異性識別或結(jié)合(a)至(f)中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，或其每種抗體或抗原結(jié)合片段的等價(jià)物或片段；

(j)編碼(i)中所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離或重組的多核苷酸或其互補(bǔ)分子；或

(k)與dnabii蛋白或多肽競爭性結(jié)合微生物dna的小分子。

本發(fā)明還提供了一種在有此需要的受試者上誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或賦予被動(dòng)免疫的方法，包括或者可選地主要包括，或者還進(jìn)一步包括給所述受試者施用有效劑量的一種或多種選自下述組的試劑：

(a)分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或其片段或等價(jià)物；

(b)分離或重組的來源于e.coli株系u93的組蛋白樣蛋白(hu)多肽或其片段或等價(jià)物；

(c)分離或重組的表8、表9a、表9b、表10所確定的蛋白或多肽或圖6所確定的dna結(jié)合肽，或其片段或等價(jià)物；

(d)分離或重組的seqidno.1至340的多肽，或其片段或等價(jià)物；

(e)分離或重組的seqidno.6-11、28、29、42-100、表8的c末端多肽或表10所確定的那些c末端多肽或其片段或等價(jià)物；

(f)編碼(a)至(f)中任意一種的分離或重組的多核苷酸，或seqidno.36的分離或重組的多核苷酸或其等價(jià)物，或在嚴(yán)格條件下與所述多核苷酸雜交的多核苷酸、其等價(jià)物或互補(bǔ)分子；

(g)特異性識別或結(jié)合(a)至(e)中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，或其等價(jià)物或片段；

(h)編碼(g)中所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離或重組的多核苷酸。

(i)負(fù)載(a)至(e)中任意一項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞；以及

(j)以編碼(a)至(e)中任意一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)化的抗原呈遞細(xì)胞。

在一個(gè)特定的方面，所述干擾劑是分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或其片段、ihf多肽的c末端片段、或其各自的等價(jià)物。在另一特定的方面，所述干擾劑是分離或重組的hu多肽或其片段、hu多肽的c末端片段、或其各自的等價(jià)物。非限制性的例子是ihf或huα或β多肽；ihf多肽；卡他莫拉菌hu；e.colihupa、hupb、hima、himd；糞腸球菌hu(例如v583)、hmgb1(高遷移率族b1蛋白，一種具有與dnabii家族蛋白質(zhì)相似的dna結(jié)合及dna底物特異性、但主要氨基酸序列不同的蛋白質(zhì)；功能同源基因)以及表8或表10所確定的那些。

在又一方面，所述方法進(jìn)一步包括或可選地主要包括，或者還進(jìn)一步包括給所述受試者施用有效量的一種或多種抗菌劑、抗原肽或佐劑。

抗菌劑的一個(gè)非限制性例子是另一疫苗組分，諸如表面抗原例如ompp5、rspila、omp26、ompp2或iv型菌毛蛋白(參見jurcisek和bakaletz(2007)j.ofbacteriology189(10):3868-3875以及murphy,tf,bakaletz,lo和smeesters,pr(2009)thepediatricinfectiousdiseasejournal,28:s121-s126)。

本發(fā)明的試劑和組合物可與其它抗菌劑和/或表面抗原同時(shí)或順序給藥。在一個(gè)特定的方面，通過直接注射或例如吸入在感染部位局部給藥。給藥的其它非限制性例子包括，包含透皮、尿道、舌下、直腸、陰道、眼部、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、通過吸入或口服的一種或多種方法。

可通過本發(fā)明方法治療的微生物感染和疾病包括由實(shí)施例1和表8所確定的生物體導(dǎo)致的感染，例如無乳鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、密螺旋體、齒密螺旋體、梅毒螺旋體、洋蔥伯克氏菌或類鼻疽伯克氏菌。一方面，所述微生物感染是流感嗜血桿菌(不分型)、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌。這些微生物感染可存在于氣道的上部、中部和下部(中耳炎、鼻竇炎、氣管炎)以及慢性阻塞性肺病加重(copd)、慢性咳嗽、囊性纖維化(cf)的并發(fā)癥和/或主要原因、以及社區(qū)獲得性肺炎(cap)。因此，通過實(shí)施本發(fā)明所述體內(nèi)方法，還可以預(yù)防或治療這些感染的疾病和并發(fā)癥。

感染還可發(fā)生在口腔內(nèi)(齲齒、牙周炎)并且由變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、aggregatibacteractinomycetemcomitansi引發(fā)。還可以是局部皮膚感染(膿腫、金黃色葡萄球菌感染、膿皰病、燒傷的二次感染、萊姆病)并且由金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌和伯氏螺旋體)引發(fā)。尿路感染(uti)也可以治療并且通常由大腸桿菌引起。胃腸道(gi)感染(腹瀉、霍亂、膽結(jié)石、胃潰瘍)通常由傷寒沙門菌、霍亂弧菌和幽門螺旋桿菌引起。生殖道感染包括在內(nèi)并通常由淋病奈瑟氏菌引起。感染可以是由糞腸球菌引起的膀胱感染或留置設(shè)備感染。通常由多種細(xì)菌引起的與植入假體設(shè)備(例如人工髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換物、或牙科植入物、或諸如泵、導(dǎo)管、支架或監(jiān)測系統(tǒng)的醫(yī)療設(shè)備)相關(guān)的感染可通過本發(fā)明的方法治療。這些設(shè)備可包被或偶合本文所述的試劑。因此，通過實(shí)施本發(fā)明所述體內(nèi)方法，還可以預(yù)防或治療這些感染的疾病和并發(fā)癥。

由無乳鏈球菌引起的感染也可以通過本發(fā)明的方法治療，并且其是新生兒細(xì)菌性敗血癥的主要原因。還可以治療由可導(dǎo)致腦膜炎的腦膜炎奈瑟氏菌引起的感染。

因此，可應(yīng)用本發(fā)明方法的給藥途徑包括鼻內(nèi)、肌內(nèi)、尿路、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部給藥、靜脈內(nèi)、直腸、鼻腔、口服、吸入以及其它腸內(nèi)或胃腸外給藥途徑。如果需要，給藥途徑可以根據(jù)所述試劑和/或所需效果組合或調(diào)節(jié)?；钚栽噭┛梢砸詥蝿┗蚨鄤┙o藥。這些適于遞送的方法和途徑的具體實(shí)施方式包括全身和局部途徑。通常地，適于本發(fā)明方法的給藥途徑包括但不限于：直接注射、腸內(nèi)、胃腸外或吸入途徑。

吸入給藥以外的非胃腸道給藥途徑包括但不限于：局部、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、眼窩內(nèi)、囊內(nèi)、椎管內(nèi)、胸骨內(nèi)以及靜脈途徑，即通過消化道以外的任何給藥途徑。非胃腸道給藥可以有效進(jìn)行所述抑制劑的全身或局部遞送。需要全身性遞送時(shí)，給藥通常涉及藥物制劑的介入性或全身性局部吸收或粘膜給藥。

本發(fā)明的干擾劑還可以通過腸內(nèi)給藥遞送給所述受試者。腸內(nèi)給藥途徑包括但不限于：口服和直腸(例如，使用栓劑)遞送。

通過皮膚或粘膜施用所述活性物質(zhì)的方法包括但不限于：合適藥物制劑的局部給藥，經(jīng)皮傳輸，透皮傳輸，注射以及表皮給藥。對于透皮傳輸，吸收促進(jìn)劑或離子導(dǎo)入是適宜的方法?？梢詰?yīng)用商購獲得的“貼劑”完成等離子體透皮傳輸，其通過電脈沖經(jīng)完整的皮膚持續(xù)遞送其產(chǎn)品數(shù)天時(shí)間或更久。

在本發(fā)明方法的各種具體實(shí)施方式中，所述干擾劑可通過吸入、注射或口服持續(xù)地、每天、每天至少一次(qd)、以及在各種具體實(shí)施方式中兩次(bid)、三次(tid)或者甚至一天四次給藥。通常地，每日治療有效劑量至少約1mg，或至少約10mg，或至少約100mg，或約200-約500mg，并且有時(shí)候根據(jù)所述化合物，多達(dá)約1g至約2.5g。

劑量可以與本發(fā)明的方法相一致地通過應(yīng)用膠囊、片劑、口服懸浮劑、肌內(nèi)注射懸浮劑、靜脈滴注懸浮劑、局部給藥的凝膠或霜?jiǎng)?、或者關(guān)節(jié)內(nèi)注射用懸浮劑完成。

本文所述組合物的劑量、毒性和治療效果可通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)制藥程序確定，例如，確定ld50(半數(shù)致死劑量)和ed50(半數(shù)治療有效劑量)。毒性效果和治療效果之間的劑量比為治療指數(shù)并可表示為ld50/ed50比例。優(yōu)選顯示高治療療指數(shù)的組合物。盡管可應(yīng)用顯示毒副作用的化合物，應(yīng)當(dāng)小心設(shè)計(jì)靶向此類化合物至感染組織位置的遞送系統(tǒng)，以減少對未感染細(xì)胞的潛在損害并從而降低副作用。

由細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于制定在人體內(nèi)應(yīng)用的劑量范圍。這些化合物的劑量優(yōu)選在包括具有很少或沒有毒性的ed50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可根據(jù)所采用的劑型以及應(yīng)用的給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。對于所述方法中應(yīng)用的任何化合物，治療有效劑量可從細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)開始估計(jì)?？稍趧?dòng)物模型中制定劑量以獲得包括如在細(xì)胞培養(yǎng)物中確定的ic50(即獲得癥狀半數(shù)最大抑制的最優(yōu)化合物的濃度)的循環(huán)血藥濃度范圍。這些信息可用于更準(zhǔn)確確定人類的有用劑量。血漿中的水平可通過例如高效液相色譜法測量。

在某些具體實(shí)施方式中，足以獲得治療或預(yù)防效果的組合物有效量范圍為約0.000001mg每千克體重每次給藥至約10,000mg每千克體重每次給藥。適宜地，劑量范圍為約0.0001mg每千克體重每次給藥至約100mg每千克體重每次給藥。給藥可以以初始劑量、后隨一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量提供。加強(qiáng)劑量可以在初始劑量一天、兩天、三天、一周、兩周、三周、一、二、三、六或十二個(gè)月后提供。在某些具體實(shí)施方式中，加強(qiáng)劑量可以在評估所述受試者對之前給藥的應(yīng)答之后給藥。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，某些因素可以影響有效治療受試者所要求的劑量和時(shí)間，包括但不限于，所述疾病或紊亂的嚴(yán)重程度、以往的治療、所述受試者的一般健康狀況和/或年齡以及存在的其它疾病。而且，以治療有效劑量的本文所述治療組合物治療受試者可以包括單一治療或一系列治療。

多肽

本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的干擾劑和組合物，其中所述干擾劑是下述組內(nèi)的：

(a)分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或其片段或等價(jià)物；

(b)分離或重組的來源于e.coli株系u93的組蛋白樣蛋白(hu)多肽或其片段或等價(jià)物；

(c)分離或重組的表8、表9a、表9b、表10所確定的蛋白或多肽或圖6所確定的dna結(jié)合肽，或其片段或等價(jià)物；

(d)分離或重組的seqidno.1至340的多肽，或其片段或等價(jià)物；

(e)分離或重組的seqidno.6-11、28、29、42-100、表8的c末端多肽或表10所確定的那些c末端多肽或其片段或等價(jià)物；

(f)與整合宿主因子競爭性結(jié)合微生物dna的多肽或多核苷酸；

在一個(gè)特定的方面，所述干擾劑是分離或重組的dnabii多肽或其片段或等價(jià)物。這樣的干擾劑的非限制性例子是ihf或huα或β多肽；ihfα多肽；卡他莫拉菌hu；e.colihupa、hupb、hima、himd；糞腸球菌hu(例如v583)、hmgb1以及表8所確定的那些。

另一方面，所述干擾劑是主要由選自seqidno.1-5或12-27、30-35、101-340的氨基酸序列或圖6所確定的dna結(jié)合肽組成的分離或重組多肽。

另一方面，所述分離或重組的多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.1或2，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

另一方面，所述分離或重組的多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.3、4或5，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

另一方面，所述分離或重組的多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.12、14、16、18、20、22、24、26、30或32，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

另一方面，所述分離或重組的多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.13、15、17、19、21、23、25、27、31、33、34或35，條件是所述多肽不是seqidno.6-11、28、29或42-100。

另一方面，所述分離或重組的多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括下述組內(nèi)的分離或重組的多肽：

具有seqidno.12和13的多肽；

具有seqidno.14和15的多肽；

具有seqidno.16和17的多肽；

具有seqidno.18和19的多肽；

具有seqidno.20和21的多肽；

具有seqidno.23和24的多肽；

具有seqidno.25和26的多肽；

具有seqidno.30和31的多肽；

具有seqidno.32和33的多肽；

具有seqidno.34和35的多肽；

具有seqidno.337和338的多肽；或

具有seqidno.339和340的多肽；

條件是所述多肽不是ihfα、ihfβ或seqidno.6至11、28、29，或42至100中任意一個(gè)的野生型。

另一方面，所述分離或重組的多肽是下述組內(nèi)的：

基本由seqidno.12和13組成的多肽；

基本由seqidno.14和15組成的多肽；

基本由seqidno.16和17組成的多肽；

基本由seqidno.18和19組成的多肽；

基本由seqidno.20和21組成的多肽；

基本由seqidno.23和24組成的多肽；

基本由seqidno.25和26組成的多肽；

基本由seqidno.30和31組成的多肽；

基本由seqidno.32和33組成的多肽；

基本由seqidno.34和35組成的多肽；

基本由seqidno.337和338組成的多肽；或

基本由seqidno.339和340組成的多肽；

條件是所述多肽不是ihfα、ihfβ或seqidno.6至11、28、29，或42至100中任意一個(gè)的野生型。

進(jìn)一步提供的作為用于本發(fā)明方法的試劑是上述的分離或重組多肽的片段或等價(jià)物。片段的例子是c末端多肽。又一方面，所述分離或重組多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括兩個(gè)或多個(gè)上述的分離或分離的多肽。

例如，所述分離或重組多肽包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqid.no.1-6、12-27或30-33中的任意一種，或者片段或等價(jià)物多肽，其例子如表8所確定的或如表9a、表9b或表10所示。一方面，排除了分離的野生型肽，即所述多肽不是seqidno.6至11、28、29，或者表8所確定或表9a所示的野生型序列。

一方面，本發(fā)明提供了主要由seqid.no.1-6、12-27或30或35、1-6以及13-35的氨基酸序列組成的分離或重組的多肽，或者包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相應(yīng)于流感嗜血桿菌ihfα或ihfβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽，其非限制性的例子包括seqidno.12-27，或其片段或等價(jià)物。又一方面，本發(fā)明提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.1-4或其片段或等價(jià)物的氨基酸序列的分離或重組的多肽，或者包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相應(yīng)于流感嗜血桿菌ihfα或ihfβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽，其非限制性的例子包括seqidno.12-27或其片段或生物學(xué)等價(jià)物，其進(jìn)一步獨(dú)立地包含至少2個(gè)、或可選地至少3個(gè)、或可選地至少4個(gè)、或可選地至少5個(gè)、或至少6個(gè)、或可選地至少7個(gè)、或可選地至少8個(gè)、或可選地至少9個(gè)或可選地至少10個(gè)所述多肽的氨基和/或羧基末端的氨基酸。一方面，排除了分離的野生型dna結(jié)合多肽，即所述多肽不是seqidno.6至11、28、29或42至100，或表8所列舉的或表9a所示的分離的野生型多肽序列。

另一方面，本發(fā)明提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括單獨(dú)的seqid.no1或2的分離或重組的多肽，或與包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相應(yīng)于流感嗜血桿菌ihfα或ihfβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽組合，其非限制性的例子包括seqidno.12-27或其片段或生物學(xué)等價(jià)物。一方面，排除了分離的野生型dna結(jié)合多肽，即所述多肽不是seqidno.6至11、28、29或42至100，或表8所列舉的或表9a所示的分離的野生型多肽序列。

又一方面，本發(fā)明提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqid.no3或4或其片段或等價(jià)物的分離或重組的多肽，單獨(dú)地或與包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括相應(yīng)于流感嗜血桿菌ihfα或ihfβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽組合，其非限制性的例子包括seqidno.12-27、以及34-35或其生物學(xué)等價(jià)物。一方面，排除了分離的野生型dna結(jié)合多肽，即所述多肽不是seqidno.6至11、28、29或42至100，或表8所列舉的或表9a所示的分離的野生型多肽序列。

本發(fā)明還提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括所有十四個(gè)分離或重組多肽中的兩個(gè)或多個(gè)、或三個(gè)或多個(gè)、四個(gè)或多個(gè)、五個(gè)或多個(gè)、六個(gè)或多個(gè)、七個(gè)或多個(gè)、八個(gè)或多個(gè)、九個(gè)或多個(gè)、十個(gè)或多個(gè)、十一個(gè)或多個(gè)、十二個(gè)或多個(gè)、十三個(gè)或多個(gè)或其片段或等價(jià)物的分離或重組的多肽。這樣的例子包括包含seqidno.1-4的分離或重組的多肽，例如seqidno.1和2，或可選地1和3或可選地1和4，或可選地2和3，或可選地1、2和3或可選地2、3和4，或可選地1、3和4。所述多肽可以是任意方向的，例如seqidno.1、2和3或seqidno.3、2和1或可選地2、1和3、或可選地3、1和2。這些多肽的生物學(xué)等價(jià)物進(jìn)一步包含于本發(fā)明，條件是所述序列不包括分離的野生型序列，例如表8和9中所確定的那些。

另一方面，本發(fā)明提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括seqidno.1或2以及3或4或其片段或等價(jià)物的分離或野生型多肽，條件是所述多肽不是seqidno.5-10，并且它們可進(jìn)一步包括seqidnos.11-26中的任何一個(gè)或多個(gè)，例如11和12，或可選地1和11，或可選地2和11，或可選地1和12，或可選地2和12，或可選地11、12和1，或可選地2、11和12。在這個(gè)具體實(shí)施方式中，seqidno.1或2位于seqidno.3或4的上游或氨基末端，條件是所述氨基酸序列不是分離野生型多肽，例如沒有seqidno.6-11、28和29。另一方面，所述分離多肽包含位于seqid.no.1或2上游或氨基末端的seqidno.3或4。這些多肽的生物學(xué)等價(jià)物進(jìn)一步包含于本發(fā)明，條件是所述序列不包括分離的野生型多肽。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，與所述野生型多肽或pedulla等(1996)pnas93:15411-15416所公開的具有序列同源性的任意多肽或蛋白質(zhì)被排除出本發(fā)明。

在上述具體實(shí)施方式的任意一個(gè)中，可添加肽接頭至所述多肽的n末端或c末端。“接頭”或“肽接頭”指連接多肽序列的或者是n末端或者是c末端的肽序列。一方面，所述接頭為約1至約20個(gè)氨基酸殘基長度或可選地2至約10個(gè)、約3至約5個(gè)氨基酸殘基長度。肽接頭的一個(gè)例子是gly-pro-ser-leu-lys-leu(seqidno:37)。其它的例子包括gly-gly-gly；gly-pro-ser-leu(seqidno:38)；gly-pro-ser；pro-ser-leu-lys(seqidno:39)；gly-pro-ser-leu-lys(seqidno:40)以及ser-leu-lys-leu(seqidno:41)。

本發(fā)明的分離多肽意在包括分離的野生型以及由原核和真核宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)，以及其突變蛋白、類似物和片段，這些細(xì)胞的例子如上所述。在某些具體實(shí)施方式中，該術(shù)語還包括本文所述的抗體以及抗獨(dú)特型抗體。這樣的多肽可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的以及本文簡要記載的方法分離或產(chǎn)生。

據(jù)了解，所述野生型多肽或蛋白質(zhì)的功能性等價(jià)物或變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如那些具有氨基酸的保守氨基酸替換的，參見例如表9。其它的類似物包括融合蛋白，所述融合蛋白包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，其可包括連接到抗原呈遞基質(zhì)的多肽。

又一方面，所述多肽可耦合或連接可檢測標(biāo)記。適宜的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并如本文所述。

又一方面，所述具有或不具有可檢測標(biāo)記的多肽可包含于或表達(dá)在原核宿主或真核宿主細(xì)胞的表面，例如樹突狀細(xì)胞。

所述蛋白質(zhì)和多肽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些方法獲得，其包括純化、化學(xué)合成以及重組方法。多肽可通過諸如以抗體免疫沉淀以及諸如凝膠過濾、離子交換、反向以及親和層析的方法從諸如宿主細(xì)胞系統(tǒng)的制劑中分離。對于這樣的方法，參見例如deutscher等(1999)guidetoproteinpurification:methodsinenzymology(vol.182,academicpress)。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了獲得這些多肽的方法以及通過這些方法可獲得的以及獲得的產(chǎn)品。

所述多肽還可應(yīng)用商購獲得的自動(dòng)肽合成機(jī)通過化學(xué)合成獲得，所述自動(dòng)肽合成機(jī)例如perkin/elmer/appliedbiosystems,inc.,model430aor43la,fostercity,ca,usa所制造的。所述合成多肽可沉淀并進(jìn)一步純化，例如通過高效液相色譜(hplc)。相應(yīng)地，本發(fā)明也通過提供所述蛋白質(zhì)的序列及試劑提供了化學(xué)合成本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的方法，例如氨基酸和酶以及以正確方向和線性序列將所述氨基酸連接在一起。

或者，所述蛋白質(zhì)和多肽可通過本文所述的公知的重組方法獲得，例如，sambrook等(1989)supra中的，應(yīng)用本文所述的宿主細(xì)胞和載體系統(tǒng)。

本申請還提供了用于診斷方法應(yīng)用的偶聯(lián)可檢測試劑的多肽。例如，可檢測標(biāo)記的多肽可結(jié)合色譜柱并用于抗體的檢測和純化。它們還可在下述的抗體生產(chǎn)中用作免疫原。本發(fā)明的所述多肽在用于篩選調(diào)節(jié)細(xì)胞過程的試劑或藥物的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中是有用的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，可對本發(fā)明的肽進(jìn)行修飾以提供改變特性的肽。本文所用的術(shù)語“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d或l的光學(xué)異構(gòu)體、以及氨基酸類似物及模擬肽。具有三個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽通常稱為寡肽，如果所述肽鏈短的話。如果所述肽鏈長，所述肽通常稱為多肽或蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的肽可修飾以包含非天然氨基酸。因此，所述肽可包含d氨基酸、d氨基酸和l氨基酸的組合、以及各種“設(shè)計(jì)師”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、c-α.-甲基氨基酸、以及n-α-甲基氨基酸，等等)以傳遞特定屬性給肽。另外，通過在特定的偶聯(lián)步驟分配特定的氨基酸，可生產(chǎn)具有α螺旋、β轉(zhuǎn)折、β片層、γ轉(zhuǎn)折的肽以及環(huán)形肽。通常地，據(jù)信，優(yōu)選α螺旋二級結(jié)構(gòu)或隨機(jī)二級結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的多肽也可以與各種固相載體組合，例如植入物、支架、糊劑、凝膠、牙科植入物、或醫(yī)療植入物、或液相載體例如珠子、無菌或水溶液、藥學(xué)上可接受的載體、藥學(xué)上可接受的多聚物、脂質(zhì)體、膠束、懸浮液和乳液。非水溶劑的例子包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。當(dāng)用于制備抗體或在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答時(shí)，所述載體還可以包括可用于非特異性增強(qiáng)特定免疫應(yīng)答的佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地確定是否需要佐劑并選擇一種。然而，只是為了說明的目的，適宜的佐劑包括但不限于弗氏完全佐劑和不完全佐劑、礦物鹽和多核苷酸。其它適宜的佐劑包括單磷酸脂質(zhì)a(mpl)、e.coli熱不穩(wěn)定腸毒素的突變衍生物、霍亂毒素的突變衍生物、cpg寡核苷酸以及來自角鯊烯的佐劑。

本發(fā)明還提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括任意一種本發(fā)明的多肽、類似物、突變體或片段的藥物組合物，單獨(dú)或互相組合或與其它試劑例如抗生素或可接受的載體或固體支持物組合。這些組合物對于本文所述的各種診斷及治療方法是有用的。

多核苷酸

本發(fā)明還提供了編碼一種或多種上述確定的分離或重組的多肽及其相應(yīng)互補(bǔ)片段的分離或重組的多核苷酸。進(jìn)一步提供了包含所述分離或重組的多核苷酸的載體，其例子是本領(lǐng)域公知的并且在本文有簡要介紹。一方面，當(dāng)超過一個(gè)分離或重組的多核苷酸作為一個(gè)單元表達(dá)時(shí)，所述分離或重組的多核苷酸可包含在多順反子載體內(nèi)。所述多核苷酸可以是dna、rna、mrna或干擾rna，例如sirna、mirna或dsrna。

另一方面，本發(fā)明提供了一種干擾劑，其是一種干擾微生物生物膜內(nèi)所述dna與多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的多核苷酸，或類似holliday交叉的四路交叉多核苷酸、類似復(fù)制叉的三路交叉多核苷酸、具有固有柔性的多核苷酸或彎曲的多核苷酸，其可治療或抑制dnabii多核苷酸與微生物dna結(jié)合以及治療、預(yù)防或抑制微生物膜形成及相關(guān)的感染或紊亂。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本文提供的信息以及本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識制造這樣的多核苷酸。參見goodman和kay(1999)j.biologicalchem.274(52):37004-37011以及kamashev和rouviere-yaniv(2000)emboj.19(23):6527-6535。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了可操作地連接rna轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子以及dna或rna復(fù)制和/或短暫或穩(wěn)定表達(dá)的其它調(diào)節(jié)序列的分離或重組的多核苷酸。如本文所應(yīng)用的，術(shù)語“可操作地連接”指以所述啟動(dòng)子可引導(dǎo)rna從dna分子轉(zhuǎn)錄出來的方式定位。所述啟動(dòng)子的例子是sp6、t4和t7。在某些具體實(shí)施方式中，細(xì)胞特異性啟動(dòng)子被用于所插入多核苷酸的細(xì)胞特異性表達(dá)。含有啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、具有終止密碼子和選擇標(biāo)記的序列以及dna片段插入的多克隆位點(diǎn)的載體可以可操作地連接本領(lǐng)域已知的以及可商購獲得的啟動(dòng)子。對于一般的方法和克隆策略，參見geneexpressiontechnology(goeddel主編，academicpress,inc.(1991))及其引用文獻(xiàn)，以及vectors:essentialdataseries(gacesa和ramji主編,johnwiley&sons,n.y.(1994))，其含有各種適宜載體的圖譜、功能特性、商業(yè)供應(yīng)商以及genembl登錄號參考。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，來自本發(fā)明所述多核苷酸的多核苷酸編碼具有本文所述診斷和治療用途的多肽或蛋白質(zhì)，以及鑒定所述蛋白的轉(zhuǎn)錄是否存在的探針。這些核酸片段可通過例如通過較大多核苷酸的限制性內(nèi)切酶消化制備，繼而以可檢測標(biāo)志標(biāo)記。或者，可應(yīng)用所述分子的缺口翻譯產(chǎn)生隨機(jī)片段。這些片段的制備和標(biāo)記方法參見sambrook等，(1989)supra。

含有這些核酸的表達(dá)載體對獲得宿主載體系統(tǒng)以生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽是有用的。這暗示這些表達(dá)載體必須可在宿主生物體內(nèi)或者作為附加體或者作為染色體dna不可分割的一部分復(fù)制。適宜表達(dá)載體的非限制性例子包括質(zhì)粒、酵母載體、病毒載體和脂質(zhì)體。因?yàn)橄俨《据d體的高水平表達(dá)以及體外和體內(nèi)的高效細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其在將基因?qū)塍w內(nèi)組織時(shí)特別有用。當(dāng)核酸插入到適宜宿主細(xì)胞時(shí)，例如原核或真核細(xì)胞以及所述宿主細(xì)胞復(fù)制體，所述蛋白可以重組產(chǎn)生。適宜的宿主細(xì)胞取決于所述載體并可包括應(yīng)用已知方法構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、人類細(xì)胞、猴細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞以及細(xì)菌細(xì)胞。參見sambrook等，(1989)supra。除了病毒載體用于插入外源核酸進(jìn)入細(xì)胞的應(yīng)用外，所述核酸可通過本領(lǐng)域已知的方法例如細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的應(yīng)用磷酸鈣沉淀的轉(zhuǎn)染、或deae-葡聚糖、電穿孔或顯微注射插入所述宿主細(xì)胞。方法參見sambrook等，(1989)supra。因此，本發(fā)明還提供了一種含有編碼蛋白質(zhì)或多肽或抗體的多核苷酸的宿主細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞(大鼠或小鼠)、人類細(xì)胞或原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞。

多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果有，核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在多核苷酸組裝之前或之后給予。核苷酸的序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾，例如通過以標(biāo)簽成分耦合。所述術(shù)語還指雙鏈和單鏈分子。除非另有說明或要求，本發(fā)明的任一具體實(shí)施方式中，多核苷酸涵蓋雙鏈形式以及每一個(gè)已知或預(yù)測構(gòu)成雙鏈形式的兩條互補(bǔ)單鏈形式。

當(dāng)所述載體用于體內(nèi)或離體的基因治療時(shí)，優(yōu)選藥學(xué)上可接受的載體，例如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體。含有本發(fā)明所述核酸的藥學(xué)上可接受載體為了所插入多核苷酸的暫時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)可進(jìn)一步地修飾。如本文所用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括但不限于具有選擇性靶向以及將所述核酸導(dǎo)入分裂細(xì)胞能力的載體或遞送工具。這樣的載體的例子是依據(jù)其不能產(chǎn)生病毒蛋白而定義的“復(fù)制缺陷型”載體，防范了所述載體在感染的宿主細(xì)胞中的傳播。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子是lnl6(miller等，(1989)biotechniques7:980-990)。已經(jīng)建立了應(yīng)用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的、用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)移方法。(bordignon(1989)pnasusa86:8912-8952；culver(1991)pnasusa88:3155；以及rill(1991)blood79(10):2694-2700)。

本發(fā)明還提供了含有和/或表達(dá)本發(fā)明所述多核苷酸的遺傳修飾細(xì)胞。所述遺傳修飾細(xì)胞可通過上游調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子或基因活化劑)的插入產(chǎn)生(參見美國專利5,733,761)。

所述多核苷酸可偶聯(lián)一個(gè)可檢測標(biāo)志，例如用于核酸檢測和/或所述基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的酶標(biāo)簽或放射性同位素。各種各樣的可檢測標(biāo)志是本領(lǐng)域已知的，包括熒光、放射性、酶或其它配體，例如抗生物素蛋白/生物素，其能夠給予可檢測信號。一方面，人們可能會(huì)希望應(yīng)用熒光素標(biāo)簽或酶標(biāo)簽例如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶代替放射性或其它對環(huán)境不良的試劑。就酶標(biāo)簽而言，可應(yīng)用熱量指示底物提供人眼可見或分光光度法的方式，以確定與互補(bǔ)核酸含有樣品的特異性雜交。因此，通過靶單鏈多核苷酸與本發(fā)明所述多核苷酸一部分的標(biāo)記單鏈多核苷酸(探針)在允許互補(bǔ)單鏈多核苷酸雜交條件(優(yōu)選中等嚴(yán)格雜交條件)下接觸，或更優(yōu)選地在高嚴(yán)格雜交條件下，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測單鏈多核苷酸或其互補(bǔ)核酸的方法。雜交的多核苷酸對從未雜交的單鏈多核苷酸分離出來。所述雜交的多核苷酸對應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測并闡述于例如sambrook等,(1989)supra。

體現(xiàn)在本發(fā)明的多核苷酸可應(yīng)用化學(xué)合成、重組克隆方法、pcr或其任意組合獲得。多核苷酸化學(xué)合成的方法是本領(lǐng)域已知的并且不需要在此詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用本文所提供的序列數(shù)據(jù)，通過應(yīng)用dna合成儀或從商業(yè)服務(wù)訂購獲得所需的多核苷酸。

本發(fā)明的多核苷酸可以應(yīng)用pcr分離或復(fù)制。所述pcr技術(shù)是美國專利4,683,195、4,800,159、4,754,065以及4,683,202的主題，并記載在pcr:thepolymerasechainreaction(mullis等主編,birkhauserpress,boston(1994))或者macpherson等.(1991)以及(1995)supra、及其引用文獻(xiàn)中。或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用本文提供的序列以及商業(yè)dna合成儀復(fù)制所述dna。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了獲得本發(fā)明的多核苷酸的方法，其通過提供所述多核苷酸的線性序列、核苷酸、合適的引物分子、化學(xué)制品例如酶以及用于其復(fù)制和化學(xué)復(fù)制或以正確方向連接核苷酸以獲得所述多核苷酸的說明書。在一個(gè)單獨(dú)的具體實(shí)施方式中，這些多核苷酸進(jìn)一步分離。更進(jìn)一步，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在適宜的復(fù)制載體內(nèi)插入所述多核苷酸并將所述載體插入適宜的宿主細(xì)胞(原核或真核)用于復(fù)制和擴(kuò)增。本文進(jìn)一步提供了通過該方法獲得多核苷酸的方法以及如此獲得的多核苷酸。

rna可通過在適宜宿主細(xì)胞首次插入dna多核苷酸獲得。所述dna可通過任意適宜的方法遞送，例如通過適宜基因遞送工具(例如脂質(zhì)體、質(zhì)?；蜉d體)的應(yīng)用或通過電穿孔。當(dāng)所述細(xì)胞復(fù)制及所述dna轉(zhuǎn)錄為rna時(shí)，所述rna然后可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離，例如sambrook等,(1989)supra闡述的。例如，mrna可應(yīng)用各種裂解酶或根據(jù)sambrook等,(1989)supra闡述步驟的化學(xué)溶液分離，或通過核酸結(jié)合樹脂按照廠商提供的附帶說明提取。

顯示與本發(fā)明多核苷酸序列互補(bǔ)或同源性的多核苷酸可用作雜交探針或作為本文所確定的特異性多核苷酸的等價(jià)物。由于轉(zhuǎn)錄的完整編碼序列是已知的，該序列的任意部分或同源性序列可用于本發(fā)明的方法。

本領(lǐng)域已知“完全匹配”的探針不是特異性雜交必須的。通過少量堿基的取代、缺失或插入獲得的探針序列微小變化并不影響雜交特異性。通常情況下，可容許20％的堿基對錯(cuò)配(最佳排列時(shí))。優(yōu)選用于檢測上述mrna的探針與所述同源區(qū)至少具有約80％同一性。更有選地，在同源區(qū)對齊后，所述探針與相應(yīng)的基因序列具有85％同一性，甚至更優(yōu)選地，其展示90％同一性。

這些探針可用于放射性分析(例如southernblot及northernblot分析)以檢測、預(yù)后、診斷或檢測各種細(xì)胞或含有這些細(xì)胞的組織。所述探針還可以附著于固體支持物或陣列例如用于檢測對應(yīng)本發(fā)明多核苷酸的基因表達(dá)的高通量篩選分析的芯片。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了包含或?qū)?yīng)本發(fā)明多核苷酸或其等價(jià)物或其互補(bǔ)核酸或其片段的探針，其附著在固體支持物上用于高通量篩選。

片段的總體大小以及互補(bǔ)延伸的大小取決于所述特定核酸片段的預(yù)期用途或應(yīng)用。通常發(fā)現(xiàn)較小的分子用于雜交實(shí)施方式，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度可變化，例如在至少5至10至約100個(gè)核苷酸之間，或甚至是根據(jù)人們希望檢測的互補(bǔ)序列的全長。

通常優(yōu)選具有過度延伸大于5-10個(gè)核苷酸長度的互補(bǔ)序列的核苷酸探針，以便增加所述雜交的穩(wěn)定性和選擇性，并從而提高獲得的特定雜交份子的特異性。更有選地，人們可設(shè)計(jì)具有10個(gè)或多個(gè)或超過50個(gè)核苷酸長度或需要時(shí)甚至更長的基因互補(bǔ)延伸的多核苷酸。這樣的片段可容易地制備，通過例如，通過化學(xué)方法直接合成所述片段，通過核酸復(fù)制技術(shù)、例如美國專利4,603,102所述的具有兩個(gè)啟動(dòng)寡核苷酸的pcr技術(shù)或通過引導(dǎo)所選擇序列進(jìn)入重組載體而重組產(chǎn)生。一方面，探針為約50-75或可選地50-100個(gè)核苷酸長度。

本發(fā)明的多核苷酸可作為本文所述的表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的基因或基因轉(zhuǎn)錄子檢測的引物。在本發(fā)明的上下文中，擴(kuò)增意味著采用引物依賴的聚合酶、能夠以合理的保真度復(fù)制靶序列的任意方法。擴(kuò)增可通過天然或重組的dna聚合酶(例如t7dna聚合酶、e.colidna聚合酶的klenow片段)以及逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行。僅作說明用途，引物與所確定的探針長度等長。

擴(kuò)增多核苷酸的一種方法是pcr，并且pcr擴(kuò)增的試劑盒是可商購獲得的。擴(kuò)增后，獲得的dna片段可通過本領(lǐng)域已知的任意適宜方法檢測，例如通過瓊脂糖凝膠電泳后以溴化乙錠染色以及紫外線照射的可視化。

已經(jīng)開發(fā)了施用有效量的基因遞送載體或工具至細(xì)胞的方法，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知以及本文所述的。用于檢測基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的，并包括例如與dna微陣列雜交、原位雜交、pcr、rn酶保護(hù)分析以及northernblot分析的技術(shù)。這些方法可用于檢測和定量細(xì)胞內(nèi)所述基因的表達(dá)?；蛘咚鼍幋a多肽的表達(dá)可通過各種方法檢測。尤其是，它可用于制備與所述靶多肽特異性反應(yīng)的多克隆或單克隆抗體。此類抗體可應(yīng)用例如免疫組化、elisa以及westernblotting的技術(shù)用于可視化表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。這些技術(shù)可用于確定所表達(dá)多核苷酸的表達(dá)水平。

抗體及其衍生物

本發(fā)明還提供了結(jié)合和/或特異性識別并且結(jié)合用于本發(fā)明所述方法的分離多肽的抗體。所述抗體可以是本文所述的各種抗體，其非限制性例子包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人類抗體、鑲嵌抗體、雙抗體、人源化抗體、抗體衍生物、重組人源化抗體、或其衍生物或片段。一方面，所述片段包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步所述抗體的cdr。一方面，所述抗體是被可檢測標(biāo)記的或進(jìn)一步包含偶聯(lián)的可檢測標(biāo)志。還提供了產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本文還進(jìn)一步提供了包括或可選地主要包括或者還進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)上述具體實(shí)施方式的組合物。進(jìn)一步提供了編碼所述抗體氨基酸序列的多核苷酸以及重組生產(chǎn)或化學(xué)合成所述抗體多肽及其片段的方法。所述抗體多肽可以再真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中生產(chǎn)，或通過本領(lǐng)域已知的其它方法以及本文所述的方法。

抗體可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)技術(shù)產(chǎn)生并且在所述文獻(xiàn)中有很好的記載。存在數(shù)種生產(chǎn)多克隆抗體的方法。例如，多克隆抗體通常通過適宜動(dòng)物例如但不限于雞、山羊、豚鼠、倉鼠、馬、小鼠、大鼠以及兔子的免疫而產(chǎn)生。給所述哺乳動(dòng)物注射抗原，其誘導(dǎo)b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異于所述抗原的免疫球蛋白。免疫球蛋白可從哺乳動(dòng)物的血清中純化出來。特異于ihfα和ihfβ的抗體可通過相應(yīng)于ihfα和ihfβ不同表位的多肽的注射而產(chǎn)生。例如，可應(yīng)用每個(gè)亞單位的20個(gè)氨基酸例如ihfα的tfrpgqklksrvenaspkde(seqidno.34)以及ihfβ的kyvphfkpgkelrdraniyg(seqidno.35)產(chǎn)生抗體。這種方法的變化包括為了優(yōu)化生產(chǎn)以及動(dòng)物人道待遇的佐劑、給藥途徑和位點(diǎn)、每個(gè)位點(diǎn)的注射體積以及每一動(dòng)物位點(diǎn)數(shù)的修改。例如，佐劑通?？捎糜诟纳苹蛟鰪?qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答。大多數(shù)佐劑提供用于注射位點(diǎn)抗原儲存，其允許抗原緩慢釋放進(jìn)入引流淋巴結(jié)。其它的佐劑包括在大的表面積上提高蛋白質(zhì)抗原濃度的表面活性劑以及免疫調(diào)節(jié)分子。用于多克隆抗體產(chǎn)生的佐劑的非限制性例子包括弗氏佐劑、ribi佐劑系統(tǒng)以及titermax。多克隆抗體可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，其記載于美國專利7,279,559、7,119,179、7,060,800、6,709,659、6,656,746、6,322,788、5,686,073以及5,670,153。

單克隆抗體可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)以及文獻(xiàn)中很好描述了的方法產(chǎn)生。例如，雜交瘤可通過適宜永生化細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系例如但不限于sp2/0、sp2/0-ag14、nso、ns1、ns2、ae-1、l.5、p3x63ag8.653、sp2sa3、sp2mai、sp2ss1、sp2sa5、u397、mla144、activ、molt4、da-1、jurkat、wehi、k-562、cos、raji、nih3t3、hl-60、mla144、namaiwa、neuro2a、cho、perc.6、yb2/o)或等等、或異質(zhì)骨髓瘤及其融合產(chǎn)物、或由其衍生的任意細(xì)胞或融合細(xì)胞、或本領(lǐng)域已知的任意其它適宜細(xì)胞系(參見，下述網(wǎng)址的那些，例如atcc.org,lifetech.com，2007年11月26日最后登錄)與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的融合產(chǎn)生，所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞例如但不限于，分離或克隆的脾、外周血、淋巴結(jié)、扁桃體或其它免疫或b細(xì)胞包含細(xì)胞，或表達(dá)重鏈或輕鏈恒定區(qū)或可變區(qū)或框架結(jié)構(gòu)或cdr序列的任意其它細(xì)胞，或者是內(nèi)源性或外源性核酸或者是重組或內(nèi)源性的，病毒、細(xì)菌、藻類、原核、兩棲類、昆蟲、爬行類、魚類、哺乳動(dòng)物、嚙齒類、馬、綿羊、山羊、綿羊、靈長類、真核、基因組dna、cdna、rnda、線粒體dna或rna、葉綠體dna或rna、hnrna、mrna、rrna、單鏈、雙鏈或三鏈、雜交的等等或者其任意組合。抗體產(chǎn)生細(xì)胞還可以由已經(jīng)過目標(biāo)抗原免疫的人類或其它適宜動(dòng)物的外周血、或優(yōu)選脾臟或淋巴結(jié)獲得。任何其它適宜的宿主細(xì)胞也可用于編碼本發(fā)明的抗體、特定片段或其變體的外源性或內(nèi)源性核酸的表達(dá)?？蓱?yīng)用選擇性培養(yǎng)條件或其它已知的適宜方法分離所述融合細(xì)胞(雜交瘤)或重組細(xì)胞，并通過有限稀釋或細(xì)胞分選或其它已知方法克隆。

可應(yīng)用其它適宜的方法生產(chǎn)或分離具有所需特異性的抗體，包括但不限于，由肽或蛋白質(zhì)文庫選擇重組抗體的方法(例如但不限于，噬菌體、核糖體、寡核苷酸、rna、cdna等等展示文庫，例如可從各個(gè)商業(yè)供應(yīng)商如morphosys(martinsreid/planegg,del.)、bioinvent(lund,sweden)、affitech(oslo,norway)應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法獲得。本領(lǐng)域已知的方法記載于專利文獻(xiàn)，其中一些包括美國專利,704,692、5,723,323、5,763,192、5,814,476、5,817,483、5,824,514、5,976,862。替代方法依賴于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如scid小鼠，nguyen等(1977)microbiol.immunol.41:901-907(1997)；sandhu等(1996)crit.rev.biotechnol.16:95-118；eren等(1998)immunol.93:154-161)的免疫接種，其能夠產(chǎn)生人類抗體產(chǎn)品，如本領(lǐng)域已知的和/或本文所述。這些技術(shù)包括但不限于，核糖體展示(hanes等(1997)proc.natl.acad.sci.usa,94:4937-4942；hanes等(1998)proc.natl.acad.sci.usa95:14130-14135)，單細(xì)胞抗體生產(chǎn)技術(shù)(例如選擇淋巴細(xì)胞抗體方法("slam")(美國專利5,627,052,wen等(1987)j.immunol.17:887-892；babcook等(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:7843-7848))，凝膠微滴和流式細(xì)胞儀(powell等(1990)biotechnol.8:333-337；onecellsystems,(cambridge,mass).；gray等(1995)j.imm.meth.182:155-163；以及kenny等(1995)bio.technol.13:787-790)，b細(xì)胞選擇(steenbakkers等(1994)molec.biol.reports19:125-134)。

本發(fā)明的抗體衍生物還可以通過編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸遞送至適宜宿主而制備，以至于提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，例如山羊、奶牛、馬、綿羊等等，其在乳液中生產(chǎn)這種抗體。這些方法是本領(lǐng)域已知的，并記載于例如美國專利5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362以及5,304,489。

術(shù)語“抗體衍生物”包括所述抗體或片段的線性多肽序列的翻譯后修飾。例如美國專利6,602,684b1描述了乙二醇形式修飾抗體的產(chǎn)生，包括全抗體分子，抗體片段，或包括免疫球蛋白fc區(qū)的等價(jià)區(qū)域、具有增強(qiáng)的fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的融合蛋白，以及由此產(chǎn)生的糖蛋白。

本發(fā)明的抗體還包括任意類型分子通過共價(jià)結(jié)合修飾所述抗體、使得所述共價(jià)結(jié)合不阻止所述抗體產(chǎn)生抗獨(dú)特性應(yīng)答的衍生物?？贵w衍生物包括但不限于，通過糖基化、乙?；?、peg化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)性/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白水解裂解、與細(xì)胞內(nèi)配體或其它蛋白質(zhì)連接等修飾的抗體。另外，所述衍生物可含有一個(gè)或多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。

抗體衍生物還可通過遞送本發(fā)明的多核苷酸以提供轉(zhuǎn)基因植物和產(chǎn)生所述抗體、植物器官或由此培養(yǎng)的植物細(xì)胞內(nèi)的特定部分或變體的培養(yǎng)植物細(xì)胞(例如但不限于煙草、玉米以及浮萍)而制備。例如，cramer等(1999)curr.top.microbol.immunol.240:95-118及其引用的參考文獻(xiàn)記載了表達(dá)大量重組蛋白的轉(zhuǎn)基因煙葉的產(chǎn)生，例如用于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)基因玉米已被用于商業(yè)生產(chǎn)水平表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白，其具有與在其它重組系統(tǒng)生產(chǎn)或由天然來源純化的相等生物活性。參見例如hood等(1999)adv.exp.med.biol.464:127-147及其引用的參考文獻(xiàn)?？贵w衍生物包括抗體片段例如單鏈抗體(scfv's)還可以從轉(zhuǎn)基因植物種子大量生產(chǎn)，包括煙草種子和馬鈴薯塊莖。參見例如conrad等(1998)plantmol.biol.38:101-109及其引用的參考文獻(xiàn)。因此，抗體還可根據(jù)已知的方法應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)。

抗體衍生物還可以通過例如添加外源序列以修飾免疫原性或降低、增強(qiáng)或修飾結(jié)合、親和、打開率、離解率、親和力、特異性、半衰期或任意其它適宜特性。保留了非人類或人類cdr序列的全部或一般部分，但可變區(qū)和恒定區(qū)的非人類序列被人類的或其它的氨基酸置換。

通常，所述cdr殘基直接并最顯著地影響抗原結(jié)合?？贵w的人源化或工程化可應(yīng)用任意的本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，例如但不限于美國專利5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539以及4,816,567所記載的那些。

本發(fā)明的嵌合、人源化或靈長類抗體可基于應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備的參照單克隆抗體的序列制備。編碼免疫球蛋白所述重鏈和輕鏈的dna可從感興趣的雜交瘤獲得并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)改造以含有非參考(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為制造嵌合抗體，小鼠的可變區(qū)可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法連接人類的恒定區(qū)(美國專利4,816,567)。為制造人源化抗體，小鼠cdr區(qū)可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法插入到人源框架區(qū)(美國專利5,225,539和5,530,101、5,585,089、5,693,762以及6,180,370)。相似地，為制造靈長類抗體，小鼠cdr區(qū)可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法插入到靈長類的框架區(qū)(wo93/02108以及wo99/55369)。

用于制備部分或完全的人源抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并可應(yīng)用任何此類的技術(shù)。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，完全人源抗體序列在轉(zhuǎn)基因小鼠中制備，所述小鼠已被改造表達(dá)人重鏈和輕鏈抗體基因。已制得多個(gè)品系的此類轉(zhuǎn)基因小鼠，其可生產(chǎn)不同類別的抗體?？僧a(chǎn)生所需抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的b細(xì)胞可融合制備雜交瘤細(xì)胞系以持續(xù)生產(chǎn)所需抗體。(參加例如，russel等(2000)infectionandimmunityapril2000:1820-1826；gallo等(2000)europeanj.ofimmun.30:534-540；green(1999)j.ofimmun.methods231:11-23；yang等(1999a)j.ofleukocytebiology66:401-410；yang(1999b)cancerresearch59(6):1236-1243；jakobovits(1998)advanceddrugdeliveryreviews31:33-42；green和jakobovits(1998)j.exp.med.188(3):483-495；jakobovits(1998)exp.opin.invest.drugs7(4):607-614；tsuda等(1997)genomics42:413-421；sherman-gold(1997)geneticengineeringnews17(14)；mendez等(1997)naturegenetics15:146-156；jakobovits(1996)weir’shandbookofexperimentalimmunology,theintegratedimmunesystemvol.iv,194.1-194.7；jakobovits(1995)currentopinioninbiotechnology6:561-566；mendez等(1995)genomics26:294-307；jakobovits(1994)currentbiology4(8):761-763；arbones等(1994)immunity1(4):247-260；jakobovits(1993)nature362(6417):255-258；jakobovits等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(6):2551-2555；以及美國專利6,075,181.)。

本發(fā)明的抗體還可被修飾以制造嵌合抗體。嵌合抗體是由超過一個(gè)物種的dna編碼抗體的重鏈及輕鏈各個(gè)域的抗體。參見例如美國專利4,816,567。

或者，本發(fā)明的抗體還可以修飾以制造鑲嵌抗體。鑲嵌抗體是一個(gè)物種的抗體的外部氨基酸殘基被另一物種合理取代或鑲嵌，使得第一物種的抗體在第二物種中不具有免疫原性，從而降低了所述抗體的免疫原性。由于蛋白質(zhì)的抗原性主要取決于其表面性質(zhì)，抗體的免疫原性可通過取代暴露殘基而降低，其與在另一哺乳動(dòng)物物種抗體中通常所發(fā)現(xiàn)的不同。外部殘基的合理替換應(yīng)當(dāng)極少或不影響內(nèi)部結(jié)構(gòu)域或域間接觸。因此，作為限于可變區(qū)框架殘基改變的結(jié)果，配體結(jié)合特性應(yīng)當(dāng)不受影響。這種方法被稱為“鑲嵌”是因?yàn)閮H僅抗體的外表或皮膚被改變，支持殘基不受干擾。

“鑲嵌”過程使用了kabat等(1987)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,4thed.,bethesda,md.,nationalinstitutesofhealth匯編的人源抗體可變區(qū)可獲得的序列數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫的更新，以及其它可獲得的美國及外國數(shù)據(jù)庫(核酸和蛋白質(zhì))。用于產(chǎn)生鑲嵌抗體的方法的非限制性例子包括ep519596、美國專利6,797,492、以及padlan等(1991)mol.immunol.28(4-5):489-498所記載的。

術(shù)語“抗體衍生物”還包括“雙抗體”，其是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，其中所述片段包含一個(gè)連接至同一肽鏈的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)。(參見例如ep404,097、wo93/11161以及hollinger等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。通過在同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間應(yīng)用足夠短而不能配對的接頭，所述結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并造成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(也參見美國專利6,632,926至chen等人，其公開了具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入親本抗體的高變區(qū)并且對靶抗原的結(jié)合親和力比親本抗體對靶抗原的結(jié)合親和力至少強(qiáng)約2倍的抗體)。

術(shù)語“抗體衍生物”進(jìn)一步包括工程抗體分子、片段及單個(gè)結(jié)構(gòu)域例如scfv、dabs、納米抗體、小分子抗體、unibodies以及affibodies(holliger&hudson(2005)naturebiotech23(9):1126-36；美國專利公開us2006/0211088；pct公開w02007/059782；美國專利5,831,012)。

術(shù)語“抗體衍生物”進(jìn)一步包括“線性抗體”。用于制備線性抗體的過程是本領(lǐng)域已知的并描述于zapata等(1995)proteineng.8(10):1057-1062。簡要地，這些抗體包含形成一對抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一對隨機(jī)fd片段(vh-ch1-vh-ch1)。線性抗體可以是雙特異或單特異的。

本發(fā)明的抗體可以通過已知方法包括但不限于蛋白質(zhì)a純化、硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析以及凝集素層析來回收和純化。高效液相色譜("hplc")也可用于純化。

本發(fā)明的抗體包括天然純化的產(chǎn)品、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)品、以及通過重組技術(shù)從真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或可選地從上述的原核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)品。許多的抗體生產(chǎn)系統(tǒng)記載于birch&radner(2006)adv.drugdeliveryrev.58:671-685。

如果待測抗體與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合，則待測抗體和本發(fā)明所提供的抗體是等價(jià)的。還可以不經(jīng)過過度實(shí)驗(yàn)，通過檢測待測抗體是否阻止本發(fā)明的抗體結(jié)合與所述抗體通常是反應(yīng)性的蛋白質(zhì)或多肽，確定抗體是否具有與本發(fā)明所述抗體相同的特異性。如果如本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合降低所示，所述待測抗體與本發(fā)明的抗體競爭，則很可能這兩種抗體結(jié)合相同或密切相關(guān)的抗原表位?；蛘?，人們可將本發(fā)明的抗體與其通常是反應(yīng)性的蛋白質(zhì)預(yù)孵育，并檢測所述待測抗體結(jié)合抗原的能力是否被抑制。如果所述待測抗體被抑制，則在所有可能性中，其與本發(fā)明的抗體具有相同或密切相關(guān)的表位特異性。

術(shù)語“抗體”還旨在包括所有免疫球蛋白同種型和子類的抗體。單克隆抗體的特定同種型可通過或者從起始融合的選擇直接制備，或通過應(yīng)用近親選擇技術(shù)應(yīng)用steplewski等(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:8653orspiraetal.(1984)j.immunol.methods74:307所記載的步驟分離類別轉(zhuǎn)換變體、從分泌不同同種型單克隆抗體的親本雜交瘤次級制備?；蛘?，可以應(yīng)用重組dna技術(shù)。

具有本文所述單克隆抗體特異性的其它單克隆抗體的分離，也可以經(jīng)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過抗獨(dú)特型抗體的產(chǎn)生來完成。herlyn等(1986)science232:100?？躬?dú)特型抗體是能夠識別感興趣的單克隆抗體所呈現(xiàn)的獨(dú)特決定簇的抗體。

在本發(fā)明的某些方面，可檢測地或治療性地標(biāo)記所述抗體是有用的。適宜的標(biāo)記如supra所述。偶聯(lián)抗體至這些試劑的方法是本領(lǐng)域已知的。僅為了說明的目的，抗體可應(yīng)用可檢測基團(tuán)例如放射性原子、發(fā)色團(tuán)、熒光基團(tuán)等標(biāo)記。此類標(biāo)記的抗體可用于診斷技術(shù)，或者在體內(nèi)，或者在分離測試樣品中。

抗體與低分子量半抗原的耦合可增加所述抗體在測試中的敏感度。所述半抗原隨后可以通過第二反應(yīng)的方式被特異性地檢測。例如，常見應(yīng)用例如生物素(其與抗生物素蛋白反應(yīng))、或二硝基苯酚、吡哆醛以及熒光素(其可與特異性康半抗原抗體反應(yīng))的半抗原。參見harlow以及l(fā)ane(1988)supra。

本發(fā)明所述抗體的可變區(qū)可通過突變vh和/或vlcdr1、cdr2和/或cdr3區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基而修飾以提高所述抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和性)。突變可通過位點(diǎn)定向誘變或pcr介導(dǎo)的誘變引入，并且其在抗體結(jié)合上的效果或其它感興趣的功能特性可在體外或體內(nèi)試驗(yàn)適當(dāng)評價(jià)。優(yōu)選導(dǎo)入保守氨基酸修飾并通常在一個(gè)cdr域內(nèi)改變不超過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基。所述突變可以是氨基酸取代、添加或缺失。

可對所述抗體進(jìn)行框架修飾以降低免疫原性，例如通過“回復(fù)突變”一個(gè)或多個(gè)框架殘基至相應(yīng)的種系序列。

此外，本發(fā)明的抗體可被設(shè)計(jì)在fc域內(nèi)包含修飾以改變所述抗體的一種或多種特性，例如血清半衰期、補(bǔ)體固定、fc受體結(jié)合、和/或抗原依賴型細(xì)胞的細(xì)胞毒。此類修飾包括但不限于，鉸鏈區(qū)半胱氨酸殘基數(shù)量的改變以協(xié)助輕鏈和重鏈的裝配或提高或降低所述抗體的穩(wěn)定性(美國專利5,677,425)，以及fc鉸鏈區(qū)的氨基酸突變以降低所述抗體的生物半衰期(美國專利6,165,745)。

此外，本發(fā)明的抗體可被化學(xué)修飾。抗體的糖基化可被改變，例如通過修飾所述抗體序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)以增加所述抗體對抗原的親和力(美國專利5,714,350和6,350,861)?；蛘?，為增加抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，可通過改變的糖基化機(jī)制在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述抗體，獲得具有降低巖藻糖殘基數(shù)量的低巖藻糖基化抗體或具有增加的平分葡萄糖結(jié)構(gòu)的抗體(shields,r.l.等2002j.biol.chem.277:26733-26740；umana等1999nat.biotech.17:176-180)。

本發(fā)明的抗體可通過所述抗體或其片段與聚乙二醇(peg)或peg的活性酯或醛衍生物，在一個(gè)或多個(gè)peg基團(tuán)開始連接所述抗體或抗體片段的條件下反應(yīng)而被peg化以增加生物半衰期?？贵w的peg化可通過與反應(yīng)性peg分子(或反應(yīng)性水溶性多聚物的類似物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行。如本文所述，術(shù)語“聚乙二醇”旨在包括已用于衍生化其它蛋白質(zhì)的任意形式的peg，例如單(c1-c10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇馬來酰亞胺。待聚乙二醇化的抗體可以是糖基化抗體。聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的并可應(yīng)用于本發(fā)明的所述抗體(ep0154316以及ep0401384)。

此外，抗體可通過偶聯(lián)或融合所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)至血清蛋白例如人血清白蛋白而化學(xué)修飾，以增加結(jié)果分子的半衰期。這樣的方法是，例如記載于ep0322094以及ep0486525。

本發(fā)明的抗體或其片段可偶聯(lián)診斷試劑并用于診斷，例如監(jiān)測疾病的發(fā)展或進(jìn)程并確定給定治療方案的效果。診斷試劑的效果包括酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、應(yīng)用不同的正電子發(fā)射斷層掃描的正電子發(fā)射金屬、以及非放射性的順磁金屬離子。可檢測物質(zhì)或者可直接耦合或偶聯(lián)所述抗體或其片段，或者應(yīng)用本領(lǐng)域已知技術(shù)通過接頭間接地耦合或偶聯(lián)。適宜的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶。適宜的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉親和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。適宜的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三唑嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或棗紅蛋白。發(fā)光材料的例子包括魯米諾。生物發(fā)光材料的例子包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白。適宜的放射性材料的例子包括¹²⁵i、¹³¹i、銦-111、镥-171、鉍-212、鉍-213、砹-211、銅-62、銅-64、銅-67、釔-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、鈧-47、銀-111、鎵-67、鐠-142、釤-153、鋱-161、鏑-166、鈥-166、錸-186、錸-188、錸-189、鉛-212、鐳-223、錒-225、鐵-59、硒-75、砷-77、鍶-89、鉬-99、銠-105、鈀-109、鐠-143、钷-149、鉺-169、銥-194、金-198、金-199以及鉛-211。單克隆抗體可通過與所述抗體共價(jià)結(jié)合的雙官能螯合劑的應(yīng)用間接與放射性金屬例子偶聯(lián)。螯合劑可通過胺(meares等,1984anal.biochem.142:68-78)、氨基酸殘基的巰基(koyama1994chem.abstr.120:217262t)以及糖基(rodwell等.1986pnasusa83:2632-2636；quadri等.1993nucl.med.biol.20:559-570)連接。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的所述抗體或其片段可偶聯(lián)治療劑。適宜的治療劑包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素b、短桿菌肽d、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素d、睪丸素、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘諾爾、以及嘌呤霉素、抗代謝物(如氨甲喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，阿糖胞苷，氟達(dá)拉濱，5-氟尿嘧啶，氮烯咪胺，羥基脲，天冬酰胺酶，吉西他濱，克拉屈濱)、烷基化劑(如氮芥，thioepa，苯丁酸氮芥，美法侖，卡氮芥(bsnu)，洛莫司汀(ccnu)，環(huán)磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲佐菌素，達(dá)卡巴嗪(dtic)，丙卡巴肼，絲裂霉素c，順鉑及其它鉑衍生物，如卡鉑)、抗生素(如放線菌素d(前身為放線菌素)，博來霉素，柔紅霉素(原柔紅霉素)，多柔比星，伊達(dá)比星，普卡霉素，絲裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素，氨茴霉素(amc))、白喉毒素和相關(guān)的分子(如白喉a鏈及其活性片段和雜交分子)、蓖麻毒素(如蓖麻毒蛋白a或去糖基化的蓖麻蛋白a鏈毒素)、霍亂毒素、志賀樣毒素(slt-i，slt-ii，slt-iiv)、lt毒素、c3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素、大豆包曼-畢爾克蛋白酶抑制劑、綠膿桿菌外毒素、alorin、皂草、莫迪素、gelanin、相思豆毒素a鏈、莫迪素a鏈、α-次黃嘌呤、油桐蛋白、二蒽蛋白、美洲商陸蛋白(papi，papii，以及pap-s)、苦瓜抑制劑、核糖體失活蛋白、巴豆毒素、sapaonaria地榆抑制劑、白樹種子儲藏蛋白、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、伊洛霉素以及混合的毒素。

其它適宜的偶聯(lián)分子包括核糖核酸酶(rnase)、dnasei、反義核酸、抑制性rna分子例如sirna分子、免疫刺激核酸、適體、核酶、三鏈形成分子以及外部引導(dǎo)序列。適體是15-50堿基長度變化的小核酸，其折疊進(jìn)入確定的二級和三級結(jié)構(gòu)，例如莖-環(huán)或者四g堿基體，并且可結(jié)合小分子例如atp(美國專利5,631,146)和茶堿(美國專利5,580,737)，以及大分子例如逆轉(zhuǎn)錄酶(美國專利5,786,462)和凝血酶(美國專利5,543,293)。核酶是能夠催化或者是分子外或者是分子內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)的核酸分子。核酶通常經(jīng)過與隨后裂解的靶分子底物的識別和結(jié)合裂解核酸底物。三鏈形成功能核酸分子可以通過形成三鏈分子與雙鏈或單鏈核酸相互作用，其中dna的三條鏈形成依賴watson-crick以及hoogsteen堿基配對的復(fù)合物。三鏈分子可以以高親和力和特異性結(jié)合靶區(qū)域。

功能性核酸分子可用作效應(yīng)子、抑制子、調(diào)節(jié)子以及靶分子所具有的特異活性的刺激劑，或者功能性核酸分子可具有從頭獨(dú)立于其它任何分子的活性。所述治療劑可應(yīng)用許多可用的方法直接或間接連接所述抗體。例如，試劑可通過二硫鍵形成在還原抗體成分的鉸鏈區(qū)應(yīng)用交聯(lián)劑例如n-琥珀酰3-(2-吡啶基)丙酸(spdp)、或通過抗體fc區(qū)域的碳水化合物基序(yu等1994int.j.cancer56:244；upeslacis等,"modificationofantibodiesbychemicalmethods,"inmonoclonalantibodies:principlesandapplications,birch等主編,頁碼187-230(wiley-liss,inc.1995)；price,"productionandcharacterizationofsyntheticpeptide-derivedantibodies,"inmonoclonalantibodies:production,engineeringandclinicalapplication,ritter等主編,頁碼60-84(cambridgeuniversitypress1995))連接。

偶聯(lián)所述治療性試劑至抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(amon等,"monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy",在monoclonalantibodiesandcancertherapy內(nèi),reisfeld等主編,pp.243-56(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等，"antibodiesfordrugdelivery",在controlleddrugdelivery內(nèi)(第二版),robinson等主編,pp.623-53(marceldekker,inc.1987)；thorpe,"antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview",在monoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications內(nèi),pinchera等主編,pp.475-506(1985)；"analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy",在monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy內(nèi),baldwin等主編,pp.303-16(academicpress1985),以及thorpe等,"thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates"1982immunol.rev.62:119-58)。

本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)域可連接另一功能分子例如受體的另一抗體或配體，以生成結(jié)合至少兩個(gè)或多個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)或靶分子的雙特異性或多特異性分子。所述抗體與一個(gè)或多個(gè)其它結(jié)合分子例如另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物的連接，可通過例如化學(xué)耦合、基因融合或非共價(jià)結(jié)合完成。多特異性分子可進(jìn)一步包含除第一和第二靶表位外的第三結(jié)合特異性。

雙特異性和多特異性分子可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，雙特異性分子的每個(gè)結(jié)合單元可分別生成繼而彼此偶聯(lián)。當(dāng)所述結(jié)合分子是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可應(yīng)用各種耦合或交聯(lián)劑以共價(jià)偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白a，碳化二亞胺，n-琥珀酰亞胺基-s-乙?；虼宜狨?sata)，5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，鄰-亞苯基(opdm)，n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(spdp)，以及磺基琥珀酰亞胺基4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)以正己烷-i-羧酸酯(磺基-smcc)(karpovsky等,1984j.exp.med.160:1686；liu等,1985proc.natl.acad.sci.usa82:8648)。當(dāng)所述結(jié)合分子是抗體時(shí)，它們可通過兩條重鏈c末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵偶聯(lián)。

本發(fā)明所述的抗體或其片段可連接對細(xì)胞有毒的基序至結(jié)合形成“消耗”抗體的所述抗體。當(dāng)本申請需要耗盡nk細(xì)胞時(shí)，這些抗體是特別有用的。

本發(fā)明的抗體還可連接固體支持物，其特別有用于所述靶抗原的免疫檢測或純化。這樣的固體支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

所述抗體還可以結(jié)合許多不同的載體。因此，本發(fā)明還提供了含有所述抗體和另一活性或惰性物質(zhì)的組合物。公知的載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然或改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖以及磁鐵。載體的性質(zhì)根據(jù)本發(fā)明的目的或者是可溶性的或者是不溶性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于結(jié)合單克隆抗體的其它適宜載體，或能夠應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定此類載體。

apcs的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增(包括樹突狀細(xì)胞)

本發(fā)明還提供了包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離多肽或分離多核苷酸或所述載體的分離的宿主細(xì)胞。一方面，所述分離的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞(apc)，例如樹突狀細(xì)胞。另一方面，所述分離宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。一方面，本發(fā)明是在促進(jìn)所述多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)的分離的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了所述宿主細(xì)胞、表達(dá)系統(tǒng)以及由該表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的多肽。

下面是apc分離的兩個(gè)基本途徑的簡要說明。這些途徑涉及(1)由血液分離骨髓前體細(xì)胞(cd34+)并刺激他們分化為apc，或者(2)由外周血收集前定向的(precommitted)apc。在第一個(gè)途徑中，所述患者必須以諸如gm-csf的細(xì)胞因子治療以增加外周血中循環(huán)的cd34+干細(xì)胞的數(shù)量。

用于分離apcs的第二個(gè)途徑是收集已在血液中循環(huán)的相對大量的前定向apcs。以前用于由人外周血分離定向apcs的技術(shù)涉及物理過程如甲泛影酰胺梯度以及粘附/非粘附步驟(freudenthal等.(1990)pnas87:7698-7702)，percoll梯度分離(mehta-damani等.(1994)j.immunol.153:996-1003)，以及熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(thomas等.(1993)j.immunol.151:6840-52)。

一種用于將大量細(xì)胞彼此分離的技術(shù)被稱為對流離心淘析法(cce)。細(xì)胞樣品置于特定的淘析轉(zhuǎn)子上。所述轉(zhuǎn)子然后以恒定速率例如3000rpm旋轉(zhuǎn)。一旦所述轉(zhuǎn)子到達(dá)所需速率，加壓空氣用于控制細(xì)胞的流速。淘析器中的細(xì)胞同時(shí)經(jīng)受離心以及流速持續(xù)增加的緩沖液洗出水流。這產(chǎn)生了主要根據(jù)但不完全根據(jù)細(xì)胞大小的級分細(xì)胞分離。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述apc是前定向的或者是能夠由哺乳動(dòng)物例如小鼠、類人猿或人類的白血細(xì)胞級分中分離成熟樹突狀細(xì)胞(參見例如,wo96/23060)。所述白血細(xì)胞級分可從哺乳動(dòng)物的外周血獲得。這種方法包括以下步驟：(a)提供通過本領(lǐng)域已知的方法例如白細(xì)胞分離術(shù)由哺乳動(dòng)物來源獲得的白血細(xì)胞級分；(b)將步驟(a)中的白血細(xì)胞級分通過對流離心淘析分為四小份或更多份，(c)通過所述細(xì)胞與鈣離子載體、gm-csf和il-13或者gm-csf和il-4接觸，刺激步驟(b)來源的一個(gè)或多個(gè)級分的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闃渫粻罴?xì)胞，(d)確定步驟(c)來源的樹突狀細(xì)胞富集級分，以及(e)收集步驟(d)所述的富集級分，優(yōu)選在約4℃。確定所述樹突狀細(xì)胞富集級分的一個(gè)方法是通過熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)。所述白血細(xì)胞級分可以在其它細(xì)胞因子例如重組(rh)rhil-12、rhgm-csf或rhil-4存在下以鈣離子載體處理。所述白血細(xì)胞級分的細(xì)胞在分離步驟前可在緩沖液中沖洗并懸浮于無ca⁺⁺/mg⁺⁺的培養(yǎng)基。所述白血細(xì)胞級分可通過白細(xì)胞分離術(shù)獲得。所述樹突狀細(xì)胞可通過至少一個(gè)下述標(biāo)志的存在確定：hla-dr、hla-dq或b7.2，同時(shí)沒有下述標(biāo)志：cd3、cd16、cd56、cd57以及cd19、cd20。特異于這些細(xì)胞表面標(biāo)志的單克隆抗體是可商購獲得的。

更特別地，所述方法要求由白細(xì)胞分離術(shù)收集富集的白細(xì)胞和血小板，從而通過對流離心淘析(cce)進(jìn)一步級分(abrahamsen等.(1991)j.clin.apheresis.6:48-53)。在這種技術(shù)中，細(xì)胞同時(shí)經(jīng)受離心和流速持續(xù)增加的緩沖液洗出水流。這產(chǎn)生了主要根據(jù)但不完全根據(jù)細(xì)胞大小的級分細(xì)胞分離。

apc以及更特異性dc集合的質(zhì)量控制及其在培養(yǎng)中的成功活化的確定，依賴于檢測單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞亞群以及可能的污染t淋巴細(xì)胞的同時(shí)多色facs分析技術(shù)。細(xì)胞分選是基于細(xì)胞表面標(biāo)志的差異表達(dá)，包括cd3(t細(xì)胞)、cd16/cd56/cd57(nk/lak細(xì)胞)以及cd19/cd20(b細(xì)胞)。dcs有別于單核細(xì)胞部分基于cd14的水平，相對于dcs其在單核細(xì)胞上以極高的水平表達(dá)。dcs在血液中循環(huán)時(shí)顯示出高水平表達(dá)的hla-dr、顯著的hla-dq和b7.2(但很少或沒有b7.1)(此外，它們表達(dá)leum7和m9，其也是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)的髓系標(biāo)記)。

當(dāng)與用于分析死亡細(xì)胞的第三種顯色劑組合時(shí)，碘化丙啶(pi)，有可能正確識別所有的細(xì)胞亞群。

收集時(shí)的facs分析的目標(biāo)是確認(rèn)所述dcs在期望的級分中富集、檢測中性粒細(xì)胞污染以及確保適當(dāng)?shù)臉?biāo)記表達(dá)。適合于臨床應(yīng)用的、由人類外周血快速批量收集富集的dcs，完全依賴于上述用于質(zhì)量控制的分析性facs技術(shù)。如果有必要，成熟dcs可在這一點(diǎn)通過用于“雞尾酒陰性”細(xì)胞的熒光分選立即從單核細(xì)胞分離?？赡軟]有必要從單核細(xì)胞常規(guī)分離dcs，因?yàn)樗鰡魏思?xì)胞本身仍然能夠培養(yǎng)分化為dcs或功能性dc樣細(xì)胞。

一旦收集，所述dc富集/單核細(xì)胞apc級分(通常是150-190)能夠匯集并被凍存以備將來使用，或立即置于短期培養(yǎng)。

或者，他人已報(bào)道了用于上調(diào)(激活)樹突狀細(xì)胞并將單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活化的樹突狀細(xì)胞表型的方法。該方法涉及鈣離子載體加入到培養(yǎng)基，將單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活化的樹突狀細(xì)胞。鈣離子載體a23187的添加，例如在24-48小時(shí)培養(yǎng)期的開始，導(dǎo)致一致活化以及所匯集的“單核細(xì)胞+dc”級分的樹突狀細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化：典型地，所述活化群體稱為統(tǒng)一的cd14(leum3)陰性，并且上調(diào)了hla-dr、hla-dq、icam-1、b7.1以及b7.2。此外，這種活化的混合群體像以進(jìn)一步純化的少量群體為基礎(chǔ)的一樣功能良好。

細(xì)胞因子的特定組合已成功用于放大(或部分代替)以鈣離子載體獲得的所述活化/轉(zhuǎn)化：這些細(xì)胞因子包括但不限于純化或重組的("rh")rhgm-csf、rhil-2以及rhil-4。每種細(xì)胞因子單獨(dú)給予時(shí)不足以最優(yōu)化上調(diào)。

抗原呈遞至apc

為了免疫的目的，所述多肽(例如,seqidno.1至33)可作為蛋白質(zhì)/肽或者以編碼所述蛋白質(zhì)/肽的cdna的形式遞送給抗原呈遞細(xì)胞。抗原呈遞細(xì)胞(apcs)可包括樹突狀細(xì)胞(dcs)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞或表達(dá)必需的mhc/共刺激分子的其它細(xì)胞。下述的方法主要集中于dcs，其是最有效力的、優(yōu)選的apcs。

通過在體外/離體將apcs暴露于本發(fā)明的抗原蛋白或多肽完成沖擊。所述蛋白或多肽以1-10μm的濃度添加至apcs約3小時(shí)。應(yīng)用編碼抗原或抗原多肽的多核苷酸的apc轉(zhuǎn)染，通過apcs在本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染試劑(包括但不限于陽離子脂質(zhì))存在時(shí)暴露于所述核酸而實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)染的或沖擊的apcs可隨即經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)的遞送途徑給藥所述宿主。

蛋白質(zhì)/肽抗原還可以和佐劑一起經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)的遞送途徑體內(nèi)遞送。

培養(yǎng)的抗原呈遞細(xì)胞

foster抗原呈遞細(xì)胞是特別有用的靶細(xì)胞。fosterapcs是從人源細(xì)胞系174xcem.t2(稱為t2)分離的，其具有在抗原加工過程中限制內(nèi)源性肽與細(xì)胞表面mhci類分子結(jié)合的突變(zweerink等.(1993)j.immunol.150:1763-1771)。這歸結(jié)于涵蓋tap1、tap2、lmp1以及l(fā)mp2基因的mhcii區(qū)域大量的純合性缺失，其是抗原呈遞給mhci類限制性cd8+ctls所需的。實(shí)際上，僅有“空載”mhci類分子存在于這些細(xì)胞的表面。添加至培養(yǎng)基的外源肽結(jié)合這些mhc分子，表明所述肽含有等位基因特異的結(jié)合基序。這些t2細(xì)胞在本文中稱為"foster"apcs。它們可用于配合本發(fā)明呈遞抗原。

以特異性重組mhc等位基因轉(zhuǎn)導(dǎo)t2細(xì)胞，容許mhc限制性分布重新定向。所述重組等位基因的定制文庫將優(yōu)選由其呈遞，因?yàn)樗鲥^定殘基將有效阻止結(jié)合所述內(nèi)源性等位基因。

mhc分子的高表達(dá)使得apc更容易被ctls識別。在t2細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用強(qiáng)力轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(例如cmv啟動(dòng)子)表達(dá)感興趣的mhc等位基因，產(chǎn)生了更具活性的apc(最可能是由于所述細(xì)胞表面更高濃度的活性mhc-肽復(fù)合物)。

免疫效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)展

本發(fā)明應(yīng)用這些apcs以刺激抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞富集群體的產(chǎn)生。所述抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞消耗所述apcs(死亡于培養(yǎng)物中)而擴(kuò)增。所述幼稚免疫細(xì)胞由其它細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的方法主要描述于coulie(1997)molec.med.today3:261-268。

如上所述制備的apcs與幼稚免疫效應(yīng)細(xì)胞混合。優(yōu)選地，所述細(xì)胞在細(xì)胞因子例如il2存在下培養(yǎng)。因而樹突狀細(xì)胞分泌強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，例如il-12，因而可能不需要在擴(kuò)增第一輪和連續(xù)兩輪添加補(bǔ)充細(xì)胞因子。在任何情況下，所述培養(yǎng)條件是，抗原呈遞細(xì)胞的擴(kuò)展(即增殖)速率比apcs高得多?？蛇M(jìn)行apcs以及可選的細(xì)胞因子的多重輸注以進(jìn)一步擴(kuò)展抗原特異性細(xì)胞群體。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所示免疫效應(yīng)細(xì)胞是t細(xì)胞。在一個(gè)單獨(dú)的具體實(shí)施方式中，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可通過編碼例如il-2、il-11或il-13的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而基因修飾。體外、離體以及體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的方法是本領(lǐng)域已知的。

抗體功能分析

本發(fā)明的抗體可用于純化本發(fā)明的多肽以及鑒定抗體和/或多核苷酸的生物學(xué)等價(jià)物。它們還可用于鑒定修飾本發(fā)明所述多肽功能的試劑。這些抗體包括多克隆抗血清、單克隆抗體，以及來自本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的以及前述的這些制劑的各種試劑。

中和由所鑒定基因編碼蛋白的活性的抗體還可在體內(nèi)或體外應(yīng)用，以證明在體內(nèi)及體外測試系統(tǒng)加入所述中和抗體的功能。它們還可用作藥劑以調(diào)節(jié)本發(fā)明所述多肽的活性。

各種抗體制劑還可用于諸如elisa實(shí)驗(yàn)或westernblots的分析方法以證明由所鑒定基因編碼的蛋白質(zhì)通過測試細(xì)胞在體外或體內(nèi)的表達(dá)。代謝期間通過蛋白酶降解產(chǎn)生的此類蛋白質(zhì)的片段還可以通過應(yīng)用適當(dāng)?shù)亩嗫寺】寡逡约皝碜栽囼?yàn)樣品的樣本確定。

本發(fā)明的抗體可用于免疫或增強(qiáng)免疫，單獨(dú)或與多肽或蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗或樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗組合。

組合物

進(jìn)一步提供了組合物。所述組合物包含載體以及一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離多肽、本發(fā)明的分離的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的分離的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的小分子或抗體。所述載體可以是一個(gè)或多個(gè)固體支持物或藥學(xué)上可接受的載體。所述組合物可進(jìn)一步包含佐劑或其它適合作為疫苗給藥的其它成分。一方面，所述組合物配制有一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、載體和/或佐劑。此外，本發(fā)明所述組合物的具體實(shí)施方式包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離多肽、本發(fā)明的分離的多核苷酸、本發(fā)明的載體、小分子、本發(fā)明的分離的宿主細(xì)胞、或本發(fā)明的抗體，配制有一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的輔料。

對于口服制劑，任意一種或多種本文所述的分離或重組的多肽、本文所述的分離或重組的多核苷酸、本文所述的載體、本文所述的分離的宿主細(xì)胞、本文所述的小分子或抗體，可單獨(dú)或以本發(fā)明的藥物制劑的形式使用，包括或主要包括，所述化合物與適當(dāng)?shù)奶砑觿┙M合以制備片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑，例如，與傳統(tǒng)的添加劑如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與粘合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與分解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂；并且如果需要，與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調(diào)味劑。藥學(xué)相容的結(jié)合劑和/或輔助材料可作為組合物的一部分包括在內(nèi)。所述片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等等可含有任意的下述成分或具有相似性質(zhì)的化合物：結(jié)合劑例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑例如淀粉或乳糖；分解試劑例如藻酸、普里莫凝膠或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑例如膠體二氧化硅；增甜劑例如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。

適于口服給藥的藥物制劑及單位劑量形式在慢性疾病、感染的治療以及患者自施用藥物的治療中特別有用。一方面，所述制劑特別用于小兒給藥。

本發(fā)明提供了藥物制劑，其中一種或多種本發(fā)明的分離多肽、本發(fā)明的分離多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的分離的宿主細(xì)胞或本發(fā)明的抗體可通過其在水溶劑或非水溶劑中溶解、懸浮或乳化配制入與符合本發(fā)明的用于注射的配方，所述非水溶劑例如植物油或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇；并且如果需要，具有常用的添加劑例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑或其它抗微生物劑。此類物質(zhì)的非限制性例子是抗微生物劑例如其它疫苗組分如表面抗原例如ompp5、rspila、omp26、ompp2、iv型菌毛蛋白(參見jurcisek和bakaletz(2007)j.ofbacteriology189(10):3868-3875以及murphy,tf,bakaletz,lo和smeesters,pr(2009)thepediatricinfectiousdiseasejournal,28:s121-s126)以及抗菌劑。對于靜脈給藥，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、cremophorel^tm(basf,parsippany,n.j.)、或磷酸鹽緩沖液(pbs)。在所有情況下，用于胃腸外給藥的組合物必須是無菌的并且應(yīng)該是易于注射的流體。

本發(fā)明所提供的氣霧劑可通過吸入給藥并可以是基于推進(jìn)劑的或非基于推進(jìn)劑的。例如，本發(fā)明的藥物制劑的具體實(shí)施方式包括配制入壓力可接受推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾鹊鹊谋景l(fā)明的化合物。對于吸入給藥，所述化合物可以以來自壓力容器或含有合適推進(jìn)劑例如一種諸如二氧化碳的氣體分配器或噴霧器的噴霧形式遞送。非推進(jìn)劑的非限制性例子是通過機(jī)械力方式(即以手指往下推活塞或通過容器的壓縮，例如通過施加給容器壁的壓縮力或由容器壁自身的彈力(例如通過彈性囊))從封閉容器噴射的噴霧泵。

本發(fā)明的栓劑可通過本發(fā)明化合物與任何各種的堿例如乳化劑堿或水溶性堿混合而制備。本發(fā)明化合物的這種藥物制劑的具體實(shí)施方式可通過栓劑直腸給藥。所述栓劑可包括運(yùn)載工具例如可可脂、碳氮化蠟和聚乙二醇，其在體溫下熔解但在室溫下固化。

可提供口服或直腸給藥的單位劑量形式例如糖漿劑、酏劑和懸浮液，其中每一劑量單元例如茶匙、湯匙、片劑或栓劑包含預(yù)設(shè)量的含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明化合物的組合物。相似地，注射或靜脈給藥的單位劑量形式可包含組合物如無菌水、生理鹽水或另一藥學(xué)上可接受載體中的溶液中的本發(fā)明的化合物。

本發(fā)明的藥物制劑的具體實(shí)施方式包括一個(gè)或多個(gè)的本發(fā)明的分離的多肽、本發(fā)明的分離的多核苷酸、本發(fā)明的載體、用于本發(fā)明的小分子、本發(fā)明的分離的宿主細(xì)胞或本發(fā)明的抗體配制在可注射組合物內(nèi)的那些藥物制劑。本發(fā)明的可注射藥物制劑制備成液體溶液或懸浮液，或適合于溶解、懸浮或注射前液體運(yùn)輸?shù)墓腆w形式。所述制劑還可被乳化或者所述活性成分被封裝在符合本發(fā)明所述藥物制劑的其它實(shí)施方式的脂質(zhì)體內(nèi)。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，配制一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的分離的多肽、本發(fā)明的分離的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的分離的宿主細(xì)胞、或本發(fā)明的抗體用于通過連續(xù)遞送系統(tǒng)的遞送。術(shù)語“連續(xù)遞送系統(tǒng)”在本文可與“受控遞送系統(tǒng)”互換使用并且涵蓋了連續(xù)(或受控)遞送設(shè)備(例如泵)與導(dǎo)管、注射設(shè)備等等本領(lǐng)域已知的各種物質(zhì)相組合。

機(jī)械或機(jī)電式輸液泵也適于本公開的應(yīng)用。此類設(shè)備的例子包括那些描述于，例如美國專利4,692,147、4,360,019、4,487,603、4,360,019、4,725,852、5,820,589、5,643,207、6,198,966等等。通常，本發(fā)明所述化合物的遞送可應(yīng)用任意各種可重復(fù)灌裝的泵系統(tǒng)來完成。泵提供了隨時(shí)間推移連續(xù)地受控釋放。某些具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物是藥物防滲容器內(nèi)的液體制劑，并以連續(xù)的方式遞送給個(gè)體。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述藥物遞送系統(tǒng)是一種至少部分可植入的裝置。所述可植入裝置可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的方法和裝置在任意適宜植入位點(diǎn)植入。植入位點(diǎn)是藥物遞送裝置導(dǎo)入并定位在受試者身體內(nèi)的位點(diǎn)。植入位點(diǎn)包括但不必要限于真皮下、皮下、肌內(nèi)或患者身體內(nèi)的其它適宜位點(diǎn)。由于其植入以及從所述藥物遞送裝置移除的便捷性，真皮下植入位點(diǎn)用于某些具體實(shí)施方式。

適于本公開應(yīng)用的藥物釋放裝置可基于任意各種操作模式。例如，所述藥物釋放裝置可基于擴(kuò)散系統(tǒng)、對流系統(tǒng)或侵蝕系統(tǒng)(例如一種以侵蝕為基礎(chǔ)的系統(tǒng))。例如，所述藥物釋放裝置可以是電化學(xué)泵、滲透泵、電滲泵、蒸汽壓泵、或滲透破裂基質(zhì)，例如，當(dāng)所述藥物整合入多聚物，所述多聚物提供了伴隨藥物浸漬聚合材料(例如，可生物降解的藥物浸漬聚合材料)降解的藥物制劑釋放。在其它具體實(shí)施方式中，所述藥物釋放裝置基于電擴(kuò)散系統(tǒng)、電解泵、泡騰泵、壓電泵、水解系統(tǒng)等等。

基于機(jī)械或機(jī)電輸液泵的藥物釋放裝置還可適用于本公開的應(yīng)用。此類裝置的例子包括那些描述于，例如美國專利4,692,147、4,360,019、4,487,603、4,360,019、4,725,852等等。通常，受試者治療方法可應(yīng)用任意各種可重復(fù)灌裝的、非可交換泵系統(tǒng)完成。通常優(yōu)選泵及其它對流系統(tǒng)，歸結(jié)于它們通常隨時(shí)間推移更連續(xù)地受控釋放。滲透泵應(yīng)用于某些具體實(shí)施方式，歸結(jié)于它們更連續(xù)地受控釋放與相對小尺寸的組合優(yōu)勢(參見例如，pct申請公開wo97/27840以及美國專利5,985,305和5,728,396)。示例性的適于本公開應(yīng)用的滲透驅(qū)動(dòng)裝置包括但不必要限于美國專利3,760,984、3,845,770、3,916,899、3,923,426、3,987,790、3,995,631、3,916,899、4,016,880、4,036,228、4,111,202、4,111,203、4,203,440、4,203,442、4,210,139、4,327,725、4,627,850、4,865,845、5,057,318、5,059,423、5,112,614、5,137,727、5,234,692、5,234,693、5,728,396等等所描述的。適于本公開的進(jìn)一步示例性裝置是synchromed輸液泵(medtronic)。

在某些具體實(shí)施方式中，所述藥物遞送裝置是可植入裝置。所述藥物遞送裝置可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的方法和裝置在任意適宜植入位點(diǎn)植入。正如文中提到的，植入位點(diǎn)是藥物遞送裝置導(dǎo)入并定位在受試者身體內(nèi)的位點(diǎn)。植入位點(diǎn)包括但不必要限于皮下、真皮下肌內(nèi)或患者身體內(nèi)的其它適宜位點(diǎn)。

本發(fā)明化合物的適宜賦形劑載體是，例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其組合。此外，如果需要，所述載體可含有少量輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳化試劑或ph緩沖劑。制備此類劑型的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，或在考慮本公開后是顯而易見的。參見例如，remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easton,pennsylvania,第17版,1985。任何情況下，待施用所述組合物或制劑含有足以在接受治療的受試者內(nèi)獲得所需狀態(tài)的化合物的量。

本發(fā)明的組合物包括包含了持續(xù)釋放或受控釋放基質(zhì)的那些組合物。此外，本發(fā)明的具體實(shí)施方式可用于與應(yīng)用持續(xù)釋放試劑的其它治療配合。如本文所述，持續(xù)釋放基質(zhì)是由通常是可通過酶或基于酸的水解或通過溶解降解的聚合物物料制備的基質(zhì)。一旦插入體內(nèi)，所述基質(zhì)被酶和體液作用。所需的持續(xù)釋放基質(zhì)選自生物相容性物質(zhì)例如脂質(zhì)體、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原)酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂類、多糖類、核酸、聚氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、多核苷酸、聚丙烯、聚乙烯基吡咯烷酮和聚硅氧烷。示范性生物降解基質(zhì)包括聚丙交酯基質(zhì)、聚乙交酯基質(zhì)、以及聚丙交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)基質(zhì)。

另一具體實(shí)施方式中，所述干擾劑(以及組合的組合物)在受控釋放系統(tǒng)中遞送。例如，本發(fā)明的化合物可應(yīng)用靜脈輸液、可植入的滲透泵、透皮貼劑、脂質(zhì)體或其它給藥模式給藥。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，可應(yīng)用泵(sefton(1987)crccrit.ref.biomed.eng.14:201；buchwald等.(1980)surgery88:507；saudek等.(1989)n.engl.j.med.321:574)。在另一具體實(shí)施方式中，應(yīng)用聚合物物質(zhì)。在又一具體實(shí)施方式中，受控釋放系統(tǒng)置于所述治療靶點(diǎn)(即肝臟)的附近，因此僅需要全身性劑量的一部分。在又一具體實(shí)施方式中，受控釋放系統(tǒng)置于所述治療靶點(diǎn)附近，因此僅需要全身性劑量的一部分。其它受控釋放系統(tǒng)在langer的綜述(1990)science249:1527-1533中有討論。

在另一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述組合物(以及單獨(dú)地或組合在一起的組合物)包括通過在吸收性材料中注入本文所述抑制劑而形成的例如縫合線、繃帶以及紗布，或包被在固相材料表面的，例如手術(shù)縫合釘、拉鏈和導(dǎo)管以遞送所述組合物。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這種類型的其它遞送系統(tǒng)在考慮本即時(shí)公開后是顯而易見的。

本發(fā)明提供了給藥宿主(例如人類)一個(gè)或多個(gè)干擾劑用于微生物感染的治療的方法和組合物。在各種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的這些方法橫跨適于藥物遞送的幾乎任意可用方法以及途徑，包括體外和離體方法，以及全身性和局部給藥途徑。

篩選實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明提供了用于篩選等價(jià)試劑的方法，例如本文所述多克隆抗體的等價(jià)單克隆抗體，以及調(diào)節(jié)本發(fā)明所述活性試劑和藥物組合物活性或者本發(fā)明所述多核苷酸編碼的多肽或肽產(chǎn)品功能的各種試劑。為了本發(fā)明的目的，“試劑”旨在包括但不限于生物或化學(xué)類化合物例如簡單或復(fù)雜的有機(jī)或非有機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)(例如抗體)、多核苷酸(例如反義)或核酶?？梢院铣纱罅康幕衔?，例如多聚物如多肽和多核苷酸，以及基于各種核心結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物，并且這些也包括在術(shù)語“試劑”中。此外，各種天然來源可提供用于篩選的化合物，例如植物或動(dòng)物提取物等等。應(yīng)當(dāng)理解，盡管并不總是明確說明，所述試劑單獨(dú)或與另一與本發(fā)明篩選鑒定的試劑具有相同或不同生物活性的試劑組合應(yīng)用。

一個(gè)具體實(shí)施方式是用于篩選能夠與所述dna-dnabii(例如ihf)相互作用、結(jié)合或抑制dna-dnabii相互作用的試劑的方法。本發(fā)明在圖6b中提供了所述微生物dna和ihf的立體結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，本公開允許應(yīng)用虛擬設(shè)計(jì)技術(shù)也稱為計(jì)算機(jī)輔助、在硅片上設(shè)計(jì)或模擬以設(shè)計(jì)、選擇并合成能夠與所述dna-dnabii(例如ihf)相互作用、結(jié)合或抑制dna-dnabii相互作用的試劑。反過來，候選試劑可有效用于治療生物膜和本文所述的相關(guān)疾病或狀態(tài)(醫(yī)療、工業(yè)或獸醫(yī)用)。因此，本公開也提供了由硅片上方法鑒定或設(shè)計(jì)的試劑。

ihf-dna復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)在圖6b中有說明，并且proteindatabank提供了一種具有x、y、z坐標(biāo)的代表結(jié)構(gòu)，登錄號1ihf，rice等.cell87:1295-1306(1996)提供了相關(guān)細(xì)節(jié)。ihf-dna復(fù)合物中ihf蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)可用于所述篩選方法。適宜試劑是人們相對于ihf-dna復(fù)合物中相互作用的ihf蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)定位的、鑒定為涉及與dna相互作用的至少1個(gè)、或可選地2個(gè)、或3個(gè)、或4個(gè)、或5個(gè)、或6個(gè)、或7個(gè)、或8個(gè)、或9個(gè)或至少10個(gè)氨基酸殘基。

圖6a應(yīng)用e.coliihf序列(seqidno:42)作為例子，說明了涉及ihf-dna相互作用的氨基酸殘基。圖6a中由較低水平箭頭標(biāo)明的氨基酸殘基在下面以粗體和下劃線的字母進(jìn)一步描述。亦即，對于e.coliihf，所述涉及dna結(jié)合的氨基酸是t4、k5、a6、e28、q43、k45、s47、g48、n51、r55、k57、r60、r63、n64、p65、k66、r76、t80、r82或q85。

maltkaemseylfdklglskrdakelvelffeeirralengeqvklsgfgnfdlrdknqrpgrnpktgedipitarrvvtfrpgqklksrvenaspkde(seqidno:42)

因此，本公開的一個(gè)具體實(shí)施方式提供了用于鑒定抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna結(jié)合的試劑，抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜，抑制、預(yù)防或分解受試者中生物膜，或抑制、預(yù)防或治療在受試者體內(nèi)產(chǎn)生生物膜的微生物感染的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法，包括針對整合宿主因子(ihf)蛋白的候選試劑的立體結(jié)構(gòu)定位，其中ihf蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是基于ihf和dna復(fù)合物的晶體形式確定的x、y、z原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，其中所述試劑與ihf在兩個(gè)或多個(gè)選自如seqidno:42所示的t4、k5、a6、e28、q43、k45、s47、g48、n51、r55、k57、r60、r63、n64、p65、k66、r76、t80、r82或q85的ihf氨基酸或其等價(jià)物相互作用，鑒定所述試劑抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna的結(jié)合，抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜，抑制、預(yù)防或分解生物膜，或抑制、預(yù)防或治療產(chǎn)生生物膜的微生物感染。

一方面，候選試劑在氨基酸63、64、65或66中的一個(gè)、或兩個(gè)或三個(gè)與ihf蛋白質(zhì)作用。一方面，候選試劑在氨基酸r63、n64、p65、k66中的一個(gè)、或兩個(gè)或三個(gè)與ihf蛋白質(zhì)作用。另一方面，候選試劑在63或66中的至少一個(gè)與ihf蛋白質(zhì)作用。另一方面，候選試劑在r63或k66中的至少一個(gè)與ihf蛋白質(zhì)作用。

本領(lǐng)域中應(yīng)當(dāng)理解，確切的位置及氨基酸殘基根據(jù)所述ihf序列變化。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于所述序列容易確定此類位置和氨基酸殘基。例如，ihf序列可以與如表9中示出的e.coliihf序列(seqidno:42)對準(zhǔn)，以揭示對應(yīng)于與dna作用的e.coliihf氨基酸的那些氨基酸。同樣，ihf-dna復(fù)合物中的此類ihf序列的立體結(jié)構(gòu)可用于所述篩選。

除了本發(fā)明提供的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法，本公開還提供了訂制的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包括例如處理器、存儲器和/或用于執(zhí)行所述方法的程序，以及計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)例如儲存執(zhí)行所述方法的適當(dāng)計(jì)算機(jī)程序或代碼的非暫時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。

相應(yīng)地，另一具體實(shí)施方式提供了定制的計(jì)算設(shè)備，包括：

至少一個(gè)處理器；

偶聯(lián)所述至少一個(gè)處理器的存儲器；

與所述存儲器和至少一個(gè)處理器通訊的存儲介質(zhì)，所述存儲介質(zhì)含有一套處理器可執(zhí)行指令，當(dāng)其被配置處理器的定制計(jì)算設(shè)備執(zhí)行以鑒定抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna結(jié)合，抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜，抑制、預(yù)防或分解受試者體內(nèi)的生物膜，或抑制、預(yù)防或治療在受試者體內(nèi)產(chǎn)生生物膜的微生物感染的試劑，其中所述配置包括：

定位抗整合宿主因子(ihf)蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的候選試劑的立體結(jié)構(gòu)，其中ihf蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是基于ihf和dna復(fù)合物的晶體形式確定的x、y、z原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，其中所述試劑與ihf在兩個(gè)或多個(gè)選自如seqidno:42所示的t4、k5、a6、e28、q43、k45、s47、g48、n51、r55、k57、r60、r63、n64、p65、k66、r76、t80、r82或q85的ihf氨基酸或其等價(jià)物相互作用，鑒定所述試劑抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna的結(jié)合，抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜，抑制、預(yù)防或分解生物膜，或抑制、預(yù)防或治療產(chǎn)生生物膜的微生物感染。

又一具體實(shí)施方式提供了包含一套處理器可執(zhí)行指令的非暫時(shí)計(jì)算機(jī)介質(zhì)，當(dāng)其被處理器執(zhí)行時(shí)，鑒定抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna結(jié)合，抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜，抑制、預(yù)防或分解受試者體內(nèi)的生物膜，或抑制、預(yù)防或治療在受試者體內(nèi)產(chǎn)生生物膜的微生物感染的試劑，包括針對整合宿主因子(ihf)蛋白的候選試劑的立體結(jié)構(gòu)定位，其中ihf蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是基于ihf和dna復(fù)合物的晶體形式確定的x、y、z原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，其中所述試劑與ihf在兩個(gè)或多個(gè)選自如seqidno:42所示的t4、k5、a6、e28、q43、k45、s47、g48、n51、r55、k57、r60、r63、n64、p65、k66、r76、t80、r82或q85的ihf氨基酸或其等價(jià)物相互作用，鑒定所述試劑抑制、競爭或中和dnabii多肽或蛋白質(zhì)與微生物dna的結(jié)合，抑制、預(yù)防或分解微生物生物膜，抑制、預(yù)防或分解生物膜，或抑制、預(yù)防或治療產(chǎn)生生物膜的微生物感染。

硅片分子上的或藥物設(shè)計(jì)的方法是本領(lǐng)域公知的，通常參見kapetanovic(2008)chembiol.interact.,171(2):165-76。簡要地，所述立體結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)被輸入計(jì)算機(jī)使得所述結(jié)構(gòu)的圖像和各種參數(shù)在屏幕上顯示。該設(shè)計(jì)通常涉及立體結(jié)構(gòu)至所述靶分子的立體結(jié)構(gòu)的定位。所述定位可通過使用者及計(jì)算機(jī)圖形界面的輔助控制，并可通過搜尋潛在良好匹配的計(jì)算機(jī)算法進(jìn)一步引導(dǎo)。定位還涉及所述立體結(jié)構(gòu)之一或兩者圍繞任意尺寸的移動(dòng)。

然后，將所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)輸入虛擬的化合物庫和/或試劑庫。由于虛擬庫被包含在虛擬篩選軟件例如dock-4(kuntz,ucsf)內(nèi)，上述的數(shù)據(jù)可輸入這樣的軟件內(nèi)?？蓱?yīng)用虛擬或非虛擬藥物候選化合物立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫例如mddr(prousscience,西班牙)搜索候選試劑。

發(fā)現(xiàn)候選試劑能夠結(jié)合dna和/或dnabii蛋白質(zhì)，如果在所述候選試劑與一方或兩方之間發(fā)現(xiàn)所需的相互作用。所述相互作用可定量，例如相互作用的強(qiáng)度和/或作用位點(diǎn)的數(shù)量，或定性例如相互作用或缺乏相互作用。相應(yīng)地，該方法的輸出可定量或定性。因此，一方面，本公開還提供了用于鑒定不能抑制所述相互作用或可選地增強(qiáng)dna和蛋白質(zhì)之間相互作用的試劑的方法。

試劑例如小分子化合物的潛在抑制或結(jié)合效應(yīng)(即相互作用或關(guān)聯(lián))可在其實(shí)際合成前分析并通過應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)測試。如果給定化合物的理論結(jié)構(gòu)提示其與生物膜內(nèi)的微生物dna和/或dnabii蛋白之間不足以相互作用及關(guān)聯(lián)，所述試劑的合成和測試可以省卻。然而，如果計(jì)算機(jī)模擬提示強(qiáng)烈的相互作用，然后可以合成所述試劑并應(yīng)用各種方法例如體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來測試其結(jié)合或抑制所述相互作用的能力。測試試劑單獨(dú)或與另一試劑連接而抑制或中和生物膜的方法如本文所述。以這種方式，可避免失效試劑及化合物的合成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用幾種方法中的任一種篩選化學(xué)或生物學(xué)實(shí)體或片段，為了它們與dnabii或微生物dna以及更特異地與特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的能力。所選擇的片段或化學(xué)實(shí)體然后可以在各種方向定位，或停駐在dna或dnabii多肽的個(gè)體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。停駐可通過應(yīng)用軟件例如quanta、sybyl，后隨以標(biāo)準(zhǔn)的分子力學(xué)力場例如charmm和amber的能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)來完成。

商用計(jì)算機(jī)程序也可用于硅片上的設(shè)計(jì)。例子包括但不限于grid(oxforduniversity,oxford,uk)、mcss(molecularsimulations,burlington,mass.)、autodock(scrippsresearchinstitute,lajolla,calif.)、dock(universityofcalifornia,sanfrancisco,calif.)、glide(schrodingerinc.)、flexx(triposinc.)以及gold(cambridgecrystallographicdatacentre)。

一旦通過上述方法設(shè)計(jì)或選擇了一個(gè)試劑或化合物，可以測試所述試劑或化合物相互結(jié)合的效率并通過計(jì)算機(jī)評估優(yōu)化。例如，一種有效的dnabii片段或優(yōu)選證明在其結(jié)合狀態(tài)及自由狀態(tài)之間能量差異相對較小(即，小的結(jié)合形變能)。

設(shè)計(jì)或選擇的化合物可進(jìn)一步計(jì)算機(jī)優(yōu)化使得在其結(jié)合狀態(tài)下，其優(yōu)選與所述靶蛋白缺乏靜電斥力作用。此類非互補(bǔ)作用(例如，靜電的)包括電荷-電荷、偶極-偶極、以及電荷-偶極的斥力作用。特異地，當(dāng)所述試劑或化合物結(jié)合dnabii或生物膜內(nèi)微生物dna之間的一種試劑時(shí)，優(yōu)選所述試劑與dnabii和/或生物膜內(nèi)微生物dna之間的靜電作用總和對結(jié)合焓作出中性或正面的貢獻(xiàn)。

計(jì)算機(jī)軟件也可用于本領(lǐng)域以評估化合物形變能以及靜電相互作用。例子包括但不限于gaussian92[gaussian,inc.,pittsburgh,pa.]，amber[universityofcaliforniaatsanfrancisco]，quanta/charmm[molecularsimulations,inc.,burlington,mass.]，以及insightii/discover[biosysmtechnologiesinc.,sandiego,calif.]。

一旦結(jié)合試劑如上所述最佳選擇或設(shè)計(jì)，然后可取代其某些原子或支鏈基團(tuán)以提高或修飾其結(jié)合特性。通常，最初的取代是保守的，即，取代基團(tuán)與原始基團(tuán)具有幾乎相同的大小、形狀、疏水性和電荷。應(yīng)當(dāng)理解，應(yīng)當(dāng)避免本領(lǐng)域已知的改變構(gòu)型的成分。然后可以通過與上文詳述相同的計(jì)算機(jī)方法分析此類取代化學(xué)化合物適于所述dnabii蛋白質(zhì)和/或生物膜內(nèi)微生物dna的效率。

一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式是一種篩選能與本發(fā)明所述蛋白質(zhì)或多核苷酸作用的小分子的方法。為了本發(fā)明的目的，“小分子”是具有低分子量(mw)的分子，其在一個(gè)具體實(shí)施方式中能夠結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)從而改變所述蛋白的功能。優(yōu)選，小分子的mw不超過1000。篩選可改變蛋白質(zhì)功能的小分子的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，you等.(1997)chem.biol.4:961-968所討論的用于檢測細(xì)胞內(nèi)小分子-蛋白質(zhì)作用的小型化陣列分析。

為在體外實(shí)踐所述篩選方法，首先提供了以待治療的微生物感染的適宜細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。所述細(xì)胞條件培養(yǎng)(溫度、生長或培養(yǎng)基質(zhì)以及氣體(co2))適宜時(shí)間量以獲得沒有密度依賴限制的指數(shù)增殖。保留作為對照的不被感染的額外獨(dú)立細(xì)胞培養(yǎng)物也是可取的。

正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，適宜細(xì)胞可在微量滴定板中培養(yǎng)，并且通過標(biāo)明微量滴定板中的基因型變化、表型變化或衰減同時(shí)分析數(shù)種試劑。

當(dāng)所述試劑是dna或rna以外的組合物時(shí)，例如上述的小分子，所述試劑可直接添加至細(xì)胞培養(yǎng)物或添加至用于添加的培養(yǎng)基。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，必須添加能夠憑經(jīng)驗(yàn)確定的有效量。

當(dāng)所述試劑是抗體或抗原結(jié)合片段時(shí)，所述試劑可與本文所述的靶抗原及多克隆抗體在實(shí)行競爭性elisa的條件下接觸或孵育。此類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

還可以在受試者體內(nèi)實(shí)行所述方法。當(dāng)所述受試者是例如大鼠、南美栗鼠、小鼠或類人猿的動(dòng)物時(shí)，所述方法提供了可用于人類患者的試劑臨床測試之前的合適動(dòng)物模型系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，如果與未治療的具有相同感染的動(dòng)物相比較，所述疾病或微生物感染的癥狀減少或消除，候選試劑是強(qiáng)效藥物。具有一個(gè)健康且未經(jīng)治療的獨(dú)立陰性對照細(xì)胞組或動(dòng)物組也是有用的，其提供了用于比較的基礎(chǔ)。

所述試劑和組合物可用于藥物生產(chǎn)，以及用于通過與常規(guī)步驟相符的給藥例如藥物組合物中的活性成分的人類及其它動(dòng)物的治療。

聯(lián)合治療

本發(fā)明的組合物及相關(guān)方法可用于與其它療法的給藥相組合。這包括但不限于dn酶、抗生素、抗菌劑或其它抗體的給藥。

在某些具體實(shí)施方式中，所述方法和組合物包括與抗dnabii抗體協(xié)同作用的脫氧核糖核酸酶(dnase)。dnase是催化dna骨架內(nèi)磷酸二酯鍵裂解的酶。已知不僅靶向十字型結(jié)構(gòu)，而且靶向dna各種二級結(jié)構(gòu)的dnase的三個(gè)非限制例子包括dnasei、t4endovii以及t7endoi。在某些具體實(shí)施方式中，當(dāng)與dnase組合時(shí)，破壞所述生物膜所需的抗dnabii抗體有效量降低。當(dāng)體外給藥時(shí)，所述dnase可直接添加至所述實(shí)驗(yàn)或已知穩(wěn)定所述酶的適宜緩沖液中。dnase的有效單位劑量及實(shí)驗(yàn)條件可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法改變及優(yōu)化。

在其它具體實(shí)施方式中，所述方法和組合物可與抗生素和/或抗菌劑組合?？咕鷦┦菤⑺阑蛞阎⑸锶缂?xì)菌、真菌或原生動(dòng)物生長的物質(zhì)。盡管生物膜通常耐受抗生素的作用，本文所述的組合物和方法可用于使涉及生物膜的感染對用于治療感染的傳統(tǒng)治療方法敏感。在其它具體實(shí)施方式中，抗生素或抗菌劑與本文所述方法和組合物的組合應(yīng)用使得抗菌劑和/或生物膜還原劑的有效量減小。用于與本發(fā)明所述方法組合的抗菌劑和抗生素的一些非限制性例子包括阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢地尼、阿奇霉素以及磺胺甲噁唑-甲氧芐氨嘧啶。與生物膜還原劑組合的抗菌劑和/或抗生素的治療有效劑量可以很容易地通過傳統(tǒng)方法確定。在某些具體實(shí)施方式中，與生物膜還原劑組合的抗菌劑劑量是已顯示在其它細(xì)菌感染中有效的平均有效劑量，例如細(xì)菌感染其中所述感染的病因不包括生物膜。在其它具體實(shí)施方式中，所述劑量是平均有效劑量的0.1、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0或5倍。所述抗生素或抗菌劑可在添加抗dnabii抗體之前、同時(shí)或之后添加。

在其它具體實(shí)施方式中，所述方法和組合物可與治療細(xì)菌感染的抗體組合?？捎糜谂c本文所述的方法和組合物組合的抗體的例子是，抗不相關(guān)外膜蛋白的抗體(即ompp5)。單獨(dú)以該抗體處理不能壓實(shí)體外的生物膜。以該抗體和生物膜還原劑組合治療產(chǎn)生了比兩種中任一試劑在相同濃度下單獨(dú)使用所能獲得的效果更大的效果。當(dāng)與生物膜還原劑或減少生物膜的方法組合時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的其它抗體包括抗rspila、抗omp26、抗ompp2以及抗完整omp制劑。

本文所述的組合物和方法可用于使涉及生物膜的細(xì)菌感染對治療不具有生物膜的細(xì)菌感染有效、但在治療涉及生物膜的細(xì)菌感染方面無效的常規(guī)治療方法致敏。在其它具體實(shí)施方式中，本文所述的組合物和方法可用于與有效治療涉及生物膜的細(xì)菌感染的治療方法組合，但此類附加治療劑與生物膜還原劑或方法的組合產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，使得所述生物膜還原劑或附加治療劑的有效劑量可以減小。在其它情況下，此類附加治療劑和生物膜還原劑或方法的組合產(chǎn)生了使治療增強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。治療的增強(qiáng)可通過治療感染所需時(shí)間更短來證實(shí)。

附加治療可在用于減少所述生物膜的方法或組合物之前、同時(shí)或之后添加，并可包含在相同的劑型內(nèi)或作為獨(dú)立的劑型。

試劑盒

還要求了含有體外及體內(nèi)實(shí)施本文所述方法所必需的試劑及說明書的試劑盒。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于實(shí)施這些方法的試劑盒，其可包含本發(fā)明的干擾劑以及用于執(zhí)行本發(fā)明方法例如收集組織和/或?qū)嵤┖Y選、和/或分析結(jié)果、和/或使用本文規(guī)定的有效劑量干擾劑的說明書。這些可以單獨(dú)使用或與其它適宜的抗菌劑組合。

例如，試劑盒可包括或可選地主要包括或進(jìn)一步包含一種或多種的分離或重組的整合宿主因子(ihf)多肽或者其片段或等價(jià)物；分離或重組的表8、表9、表10所確定的蛋白或多肽或圖6所確定的dna結(jié)合肽或者其片段或等價(jià)物；分離或重組的seqidno.1-33的多肽或者其片段或等價(jià)物；分離或重組的seqidno.5-11、28、29或表8或表10所確定的c末端多肽或者其片段或等價(jià)物；與整合宿主因子競爭結(jié)合微生物dna的多肽；類似holliday交叉的四路交叉多核苷酸，類似復(fù)制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或彎曲的多核苷酸；編碼上面所提到的任一種多肽的分離或重組的多核苷酸；特異性識別或結(jié)合上面所提到的任一種多肽的抗體或者其等價(jià)物或抗體，或與dnabii蛋白或多肽競爭性結(jié)合微生物dna小分子，以及使用說明書。所述試劑盒可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)佐劑、抗原肽或抗菌劑。載體的例子包括液體載體、藥學(xué)上可接受的載體、固相載體、藥學(xué)上可接受的載體、藥學(xué)上可接受的多聚物、脂質(zhì)體、膠束、植入物、支架、糊劑、凝膠劑、牙科植入物或醫(yī)用植入物。

下述實(shí)施例旨在解釋并且不限制本文所公開的發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)1

ihf抗體、蛋白質(zhì)和多肽由nash慷慨贈(zèng)予。生產(chǎn)它們的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如granston和nash,(1993)j.mol.biol.,234:45-59；nash等,(1987)journalofbacteriology,169(9):4124-4127；以及rice等,(1996)cell,87:1295-1306所記載的。簡要地，為過量生產(chǎn)ihf-α，hima基因被插入到細(xì)菌質(zhì)粒pad284的pl啟動(dòng)子上游。已接受所需質(zhì)粒的k5607株系轉(zhuǎn)化體、c600hima42株系λ溶源體通過能夠生長噬菌體mu(13)的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體而鑒定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)dna分離技術(shù)由hima+轉(zhuǎn)化體制備dna，并且所述hima基因的起始通過限制性酶切確定。hima基因在正確起始通過pl啟動(dòng)子表達(dá)的pplhima-1質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進(jìn)入n5271株系，其含有表達(dá)ci857熱誘導(dǎo)抑制子的隱蔽λ噬菌體以產(chǎn)生k5770株系。

為過度生產(chǎn)ihf-β，應(yīng)用了含有ihf-、噬菌體λpl啟動(dòng)子編碼序列融合的pkt23-hip323質(zhì)粒。pkt23-hip323被導(dǎo)入n5271以產(chǎn)生e443株系。為便于另一質(zhì)粒存在下pkt23-hip323的選擇，其可選擇標(biāo)志由氨芐青霉素抗性(bla+)轉(zhuǎn)為氯霉素抗性(cat+)。含有cat的片段根據(jù)flamm和weisberg所述由pbr325質(zhì)粒分離并插入bla內(nèi)的獨(dú)特的scai位點(diǎn)。連接的dna被導(dǎo)入e403株系，其攜帶hip突變并合成溫度敏感x抑制子，并在低溫下選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體。一個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體(e735)是hip+并且氨芐青霉素敏感的，因而其似乎攜帶pkt23-hip323的blacat+衍生物(pe735)。

為產(chǎn)生過度生產(chǎn)ihf的兩個(gè)亞單位的株系，以pplhima-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e735，選擇已成為氨芐青霉素抗性以及保留氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體(e738)。過度表達(dá)ihf兩個(gè)亞單位的第二株系的生成依賴于pplhiphima-5質(zhì)粒的構(gòu)建，其通過連接含有phet和hima基因的鈍(sstii限制性酶切位點(diǎn))進(jìn)入pkt23-hip323質(zhì)粒制備。這進(jìn)一步詳細(xì)記載于nash等,(1987)j.ofbacteriology,169(9):4124-4127。k5607株系的hima+轉(zhuǎn)化體通過hima+篩選鑒定，并且所述質(zhì)粒dna通過限制性消化分析。在所有質(zhì)粒結(jié)構(gòu)明顯的情況下，兩個(gè)拷貝的hima被連接作為進(jìn)入載體的串聯(lián)重復(fù)。不清楚該質(zhì)粒上兩個(gè)拷貝hima基因的存在是否是所述選擇所要求的，但應(yīng)該指出的是，質(zhì)粒pplhima-1內(nèi)的單拷貝hima基因足以補(bǔ)充hima突變。pplhiphima-5質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化n5271株系以產(chǎn)生k5746株系。

細(xì)胞在tby培養(yǎng)基(每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物以及5g氯化鈉)內(nèi)31℃振蕩水浴生長。在對數(shù)中期(在650nm的光密度，ca.0.6)，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至42℃水浴并繼續(xù)振蕩。通常，離心300ml培養(yǎng)物并以含有20mmnacl的0.6-0.9mlteg(20mmtris鹽酸(ph7.4),1mmedta鈉,10％甘油)懸浮。所述細(xì)胞以6個(gè)20s的超聲脈沖破碎，每次脈沖之間間隔40s。超聲提取物的一部分在sorvallss34轉(zhuǎn)子中15,000rpm離心20分鐘。

所述超聲提取物的樣品按照標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)通過十二烷基硫酸鈉(sds)凝膠電泳進(jìn)行分析。

ihf純化按照下述完成：3.6升一批次的細(xì)胞誘導(dǎo)3小時(shí)。所有后續(xù)步驟在0-4℃進(jìn)行。來自3.3升的細(xì)胞沉淀以10ml含有20mmnacl的teg懸浮得到29ml的總體積；該懸浮液分為兩批，每批接受通過90s間隔的6次脈沖的3分鐘超聲。所述超聲提取物在15,000rpm離心20分鐘，產(chǎn)生16.9ml的澄清提取物。10％(體積/體積)的聚乙烯亞胺(polyminp,bdhchemicalsltd.)溶液(1.1ml)被緩慢加入所述澄清提取物；在攪拌20分鐘后，所述混合物在10,000rpm離心30分鐘。獲得的沉淀以10ml含有500mmnacl的teg懸浮；在攪拌15分鐘后，所述混合物在12,000rpm離心20分鐘。通過添加3.2g硫酸胺，所述上清(10.3ml)被調(diào)節(jié)至50％飽和，攪拌20分鐘，并在15,000rpm離心15分鐘。獲得的上清通過添加1.64g硫酸銨調(diào)節(jié)至70％飽和，攪拌20分鐘，并在15,000rpm離心15分鐘。獲得的沉淀以1mltg(含有10％甘油的50mmtris鹽酸(ph7.4))懸浮并透析兩份變化的tg。上樣所述透析物質(zhì)(2.0ml)至1-ml(0.5×5.8cm)的以tg平衡的磷酸纖維素層析柱(p11；whatman,inc.)。所述層析柱以3ml的tg洗滌并以20ml的kcl線性梯度(0-1.2m)tg沖洗。收集0.5ml的分?jǐn)?shù)，儲存在-20℃，并分析ihf活性。

抗ihf多克隆抗體按如下方法制備。以250μg純化ihf和完全弗氏佐劑注射兔子。250μgihf和不完全弗氏佐劑的加強(qiáng)免疫在1、7以及12周后給予。如通過ihf免疫印跡法確定的，在初始注射13周后收集的血清具有高滴度的ihf反應(yīng)性物質(zhì)。所述動(dòng)物保留數(shù)年，并且必要時(shí)給予進(jìn)一步的加強(qiáng)免疫以保持其血清內(nèi)的高滴度抗ihf。所述抗體不進(jìn)一步純化。原始血清在-70℃儲存。

特異于每個(gè)亞單位的抗體通過應(yīng)用相應(yīng)于每個(gè)亞單位(seqidnos.34和35)的c末端最末20個(gè)氨基酸殘基的合成多肽產(chǎn)生，以依據(jù)ditto等,(1994)j.ofbacteriology,176(12):3738-3748免疫兔子。

實(shí)驗(yàn)2

該實(shí)驗(yàn)描述了8孔室玻片內(nèi)已建立生物膜逆轉(zhuǎn)的體外模型。用于該實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)是：巧克力瓊脂；sbhi(具有2mgheme/ml以及2mgb-nad/ml的bhi)；8孔室玻片(nunc*lab-tek*fishercatalog#12-565-18)；0.9％無菌生理鹽水；live/deadbaclight細(xì)菌存活試劑盒(fishercatalog#nc9439023)以及福爾馬林。

第一天，在巧克力瓊脂上敲擊(struck)nthi用于分離。然后其在37℃及5％co2孵育20小時(shí)。次日，細(xì)菌以5ml平衡(37℃,5％co2)的sbhi懸浮，并在sbhi中調(diào)節(jié)光密度至od490＝0.65。細(xì)菌在平衡的sbhi中1:6稀釋(1ml細(xì)菌懸液+5mlsbhi)。然后細(xì)菌在37℃5％co2下靜止孵育3小時(shí)(od490約為0.65)。接下來，所述細(xì)菌在平衡sbhi中1:2500重新稀釋，并且將200ml的細(xì)菌稀釋液添加至所述室玻片的每個(gè)孔。對于稀釋，10μl細(xì)菌被添加至eppendorf管(ep管)內(nèi)的990μlsbhi，以及8μl稀釋液被添加至每個(gè)室內(nèi)的192μlsbhi，并在37℃,5％co2靜態(tài)孵育。

第三天，在孵育16小時(shí)后，為了不干擾生物膜，通過從所述孔的角落吸取培養(yǎng)基而將培養(yǎng)基從室內(nèi)吸走。然后200ml的平衡sbhi被添加至每個(gè)室并在37℃,5％co2靜態(tài)孵育8小時(shí)。8小時(shí)后，吸取所述培養(yǎng)基并給每個(gè)未處理室添加200ml平衡sbhi；并添加200ml以1:50sbhi稀釋的干擾劑例如兔抗rspila以及200ml以1:50sbhi稀釋的幼稚兔血清(或其它適宜的血清參照)。然后它們在37℃及5％co2靜態(tài)孵育。

第四天，在大約孵育16小時(shí)后，吸取sbhi并且以200ml無菌生理鹽水洗滌所述生物膜兩次。吸取所述生理鹽水并添加200ml活/死細(xì)胞(live/dead)染料。接下來，添加1ml含有3ml組分a加3ml組分b的10mm磷酸鹽緩沖液。然后在室溫靜態(tài)避光孵育15分鐘。吸取染料并且以200ml無菌生理鹽水洗滌生物膜兩次。吸取生理鹽水并添加200ml福爾馬林以固定生物膜。然后在室溫靜態(tài)避光孵育15分鐘。吸取福爾馬林并以200ml無菌生理鹽水洗滌生物膜兩次。移除墊片并且將蓋玻片放置在載玻片上；蓋玻片以指甲油密封并且在通過激光共聚焦顯微鏡觀看前干燥。

應(yīng)用這種方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于鼻竇炎、支氣管炎、中耳炎和慢性阻塞性肺疾病加重(copd)的由流感嗜血桿菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有11.68μm平均厚度的4.24μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有1.31μm平均厚度的0.53μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度88.8％的減小以及生物量87.5％的減少。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)應(yīng)用純化的整合宿主因子(ihf)在兔子中制備抗e.coliihf的多克隆抗血清。實(shí)驗(yàn)1記載了來自e.coli的ihf的表達(dá)和純化。

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于齲齒的由變形鏈球菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有5.43μm平均厚度的1.17μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有0.47μm平均厚度的0.1μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度91.3％的減小以及生物量91.6％的減少。體外生物膜測定在不同的日子重復(fù)3次。最大高度、平均厚度以及生物量的減小百分?jǐn)?shù)如下表1所述。

表1

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于局限性和彌漫性皮膚感染、慢性鼻竇炎以及院內(nèi)感染的由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有2.2μm平均厚度和17.5μm生物膜高度的0.3μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有1.1μm平均厚度和8μm生物膜高度的0.3μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度48.8％的減小以及生物量2.7％的減少(圖7)。

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于copd加重以及中耳炎的由卡他莫拉菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有1.48μm平均厚度的0.72μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有0.65μm平均厚度的0.13μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度55.8％的減小以及生物量82.1％的減少。體外生物膜測定在不同的日子重復(fù)3次。最大高度、平均厚度以及生物量的減小百分?jǐn)?shù)如下表2所述。

表2

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于鼻竇炎、肺炎和中耳炎的由肺炎鏈球菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有3.99μm平均厚度的0.64μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有0.82μm平均厚度的0.14μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度79.5％的減小以及生物量78.6％的減少。體外生物膜測定在不同的日子重復(fù)3次。最大高度、平均厚度以及生物量的減小百分?jǐn)?shù)如下表3所述。

表3

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于囊性纖維化、肺炎、皮膚和軟組織感染以及醫(yī)療設(shè)備上的由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有25.70μm平均厚度和40μm生物膜高度的7.0μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有10.3μm平均厚度和27.5μm生物膜高度的3.4μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度60.1％的減小以及生物量50.8％的減少(圖7)。

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了由淋病中的淋病奈瑟氏菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有22.02μm平均厚度和40μm生物膜高度的9.5μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有3.4μm平均厚度和27.5μm生物膜高度的0.8μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度84.5％的減小以及生物量92.1％的減少(圖7)。

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于尿路感染的由尿路致病性大腸桿菌產(chǎn)生的生物膜。未經(jīng)治療的生物膜塊測量為具有31.73μm平均厚度的1.75μm³/μm²。治療后，所述生物膜塊減小為具有1.62μm平均厚度的0.75μm³/μm²。因此，這顯示了平均厚度94.9％的減小以及生物量56.9％的減少。體外生物膜測定在不同的日子重復(fù)3次。最大高度、平均厚度以及生物量的減小百分?jǐn)?shù)如下表4所述。

表4

應(yīng)用該方法和抗ihf抗體，申請人減小了多見于皮膚感染的由表皮葡萄球菌產(chǎn)生的生物膜。體外生物膜測定在不同的日子重復(fù)3次。最大高度、平均厚度以及生物量的減小百分?jǐn)?shù)如下表5所述。

表5

實(shí)驗(yàn)3

中耳感染(或中耳炎，om)是一種全球普遍流行的疾病，每年困擾全球0.5-3.3億兒童。om的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也很大，單在美國每年耗費(fèi)估計(jì)50-60億美元。已知om的所有三種主要的細(xì)菌性病原體在體外和體內(nèi)均形成生物膜，并且最近，臨床醫(yī)生們開始意識到om的慢性及復(fù)發(fā)歸結(jié)于(至少部分地)中耳腔內(nèi)細(xì)菌生物膜的形成。在om的南美栗鼠模型中，幼年南美栗鼠首先被給予病毒性“感冒”，一周后它們接受活細(xì)菌接種的滴鼻攻擊。類似于人類的“我孩子患了感冒并且一周后得了耳部感染”的狀況，南美栗鼠也在攻擊后大約一周發(fā)展為細(xì)菌性om，并在經(jīng)歷病毒性上呼吸道感染。一旦細(xì)菌獲得進(jìn)入中耳的途徑(或者通過耳咽管的提升，或者隨直接攻擊至中耳空間)，它們將形成強(qiáng)大的生物膜。申請人因而考慮并的確使用了本文所報(bào)告的南美栗鼠模型以證明快速地解決已存在生物膜的ihf免疫的保護(hù)性效果。該模型還可用于通過抗dnabii抗體的被動(dòng)遞送或通過已知結(jié)合ihf或其它dnabii家族成員的小分子或其它試劑的遞送用于治療途徑。

因?yàn)槟厦览跏竽Ｐ陀糜谌祟愐呙绲拈_發(fā)和臨床前測試，與人類宿主特別是兒童建立有意義的免疫相似之處十分重要。申請人已顯示，因?yàn)閚thi，積液在具有aom的兒童中恢復(fù)，并且具有實(shí)驗(yàn)性nthi誘導(dǎo)om的南美栗鼠中耳液在相似分層方式下識別ompp5的免疫顯性區(qū)域(參見例如.novotnyla,等,(2000)infectimmun.68(4):2119-28；novotnyla,等,(2007)第九屆分泌性中耳炎研究進(jìn)展國際研討會(huì)；st.petebeach,fl；novotnyla,等,(2002)vaccine20(29-30):3590-97)。申請人還顯示了具有實(shí)驗(yàn)性om的南美栗鼠、具有自然om的兒童以及具有copd加重的成年人，均以高度類似的方式識別代表pila的肽(參見例如.adamsld,等,(2007)107thgeneralmeeting,americansocietyformicrobiology；2007；toronto,on；adamsld,等,(2007)第九屆分泌性中耳炎研究進(jìn)展國際研討會(huì)；st.petebeach,fl.)。因此，具有實(shí)驗(yàn)性om的南美栗鼠以及具有自然疫源性疾病的兒童相似地免疫響應(yīng)至少兩種不相關(guān)的nthi蛋白粘附分子。最近進(jìn)行了這種對比的最終測試，其中南美栗鼠av-nthi超感染模型用于進(jìn)行新的11價(jià)肺炎球菌多糖蛋白d綴合疫苗的臨床藥效試驗(yàn)。從南美栗鼠獲得的數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)為34％的療效，而在兒童中測試時(shí)，獲得的針對流感嗜血桿菌誘導(dǎo)的om的療效為35.6％(參見例如.novotnyla,等,(2006)vaccine24(22):4804-11和prymular,等,(2006)lancet.367(9512):740-8)，因而大力支持這個(gè)模型用于om疫苗候選物的開發(fā)和測試的相關(guān)性。

申請人已顯示在接受以ihf和粘膜/全身性佐劑遞送的2周tc免疫后，南美栗鼠中耳內(nèi)殘留的預(yù)先形成的生物膜顯著減少。

由rauscher’schinchillaranch(larue,ohio)訂購了48只成年鼠，并在開始研究前適應(yīng)所述生態(tài)飼養(yǎng)場7-10天。在tb(聽泡或在中耳腔內(nèi)直接攻擊)攻擊之前，進(jìn)行基準(zhǔn)耳鏡檢查和鼓室導(dǎo)抗，以及有限體積的前出血以收集血清。麻醉南美栗鼠，并且300μl含有約1000cfu的nthi(株系#86-028np)懸液通過聽泡攻擊導(dǎo)入中耳腔。使動(dòng)物恢復(fù)，然后按iacuc接受的動(dòng)物應(yīng)用協(xié)議每天監(jiān)測副反應(yīng)。整個(gè)研究期間每2-3天進(jìn)行常規(guī)的耳鏡檢查和鼓室導(dǎo)抗。

攻擊之后四天(+4天)，麻醉南美栗鼠并進(jìn)行ct掃描以顯現(xiàn)存在于所述中耳內(nèi)的生物膜并獲得免疫前圖像。清潔耳廓表面并通過以無菌無熱原生理鹽水潤濕的無菌紗布墊擦拭而水化。2分鐘后(以允許耳廓干燥)，將50μl的dmlt,ihf(根據(jù)實(shí)驗(yàn)1純化的e.coliihf)+dmlt、或者ihf+rspila+dmlt溶液添加至所述耳廓并輕輕按摩。每隊(duì)南美栗鼠處死三只，并收集組織/樣品(在+4天，以及+11天)以開始檢測作用機(jī)制。

攻擊之后十一天(+11天)，如上文所述進(jìn)行第二次免疫，其中所述耳廓被清潔/水化并且局部給藥免疫原。每隊(duì)南美栗鼠處死三只，并收集組織/樣品以開始檢測作用機(jī)制。

攻擊之后十八天(+18天)，麻醉南美栗鼠并進(jìn)行ct掃描以確定任意生物膜的存在，以及與免疫前ct掃描相比較。然后所述動(dòng)物放血以收集血清并安樂死。解剖聽泡并且無菌收集所存在的任何液體，然后打開所述聽泡以顯現(xiàn)內(nèi)聽泡以及存在的任意生物膜。收集圖像并且所述聽泡以1ml無菌生理鹽水洗滌并重影像。從左聽泡收集任意生物膜隨之存在的粘膜并置于預(yù)稱重管內(nèi)。勻漿所述組織，連續(xù)稀釋并制成平板以檢測cfunthi/mg濕重組織。所述左聽泡以oct包埋并快速冷凍用于組化分析。

具有殘留生物膜的左右中耳腔圖像是無序的，并且每一動(dòng)物的兩幅圖匯成了一個(gè)文件用于盲評排序。每個(gè)動(dòng)物中耳內(nèi)保留的生物質(zhì)相對量通過雙盲評審應(yīng)用下表6所示的規(guī)格從0至4+級別排序。滴度elisa、細(xì)胞因子陣列以及biacore在血清和所收集的中耳積液上進(jìn)行。oct包埋的中耳的切片并染色基本的形態(tài)結(jié)構(gòu)(h&e)或應(yīng)用免疫組化和/或免疫熒光染色ihf的存在。

表6

體內(nèi)形成生物膜的冷凍切片的免疫熒光成像按照下面所述的進(jìn)行。在解剖后，每只南美栗鼠的中耳以oct包埋化合物(fisherscientific,pittsburgh,pa)填充并在液氮中速凍。移除形成內(nèi)聽泡的骨骼以完整留下中耳粘膜和存在的生物膜。然后將獲得的塊一分為二以揭示生物膜的截面并重新包埋在oct中。應(yīng)用micromrotarycryotom切割十微米的切片，粘附至玻璃載玻片(mercedesmedical,sarasota,fl)并在-80℃儲存。之后染色切片以檢測體內(nèi)形成生物膜內(nèi)的ihf摻入。簡要地，風(fēng)干載玻片，以冷丙酮固定，然后在緩沖液中平衡(0.05mtris-hcl,0.15mnacl以及0.05％tween20,ph7.4)。切片以圖像-itfx增強(qiáng)子(分子探針,eugene,or)和按照制造商說明書的backgroundsniper(biocaremedical,concord,ca)封閉。然后切片以1:200稀釋的多克隆兔抗ihf在加濕室內(nèi)4℃孵育過夜。進(jìn)一步?jīng)_洗載玻片并以綴合alexafluor594(invitrogen)的山羊抗兔igg在室溫孵育30分鐘。作為復(fù)染，切片與dapi孵育并應(yīng)用prolonggoldantifadereagent(分子探針,eugene,or)封片。幼稚兔血清作為陰性對照。通過附著在zeissaxiovert200倒置顯微鏡(carlzeissinc.,thornwood,ny)的zeisslsm510元共聚焦系統(tǒng)觀察切片。

cfu/mg組織平均值與cfunthi/ml上清平均值之間的顯著差異通過配對t檢驗(yàn)檢測。p值≤0.05被認(rèn)為是顯著性的。同隊(duì)之間相對生物量的顯著性通過未配對t檢驗(yàn)評估。p值≤0.05被認(rèn)為是顯著性的。

如圖9、a組所示，僅以佐劑免疫的南美栗鼠中耳內(nèi)殘留生物膜的平均分值為2.8，其提示殘余疾病顯著，并且在細(xì)菌攻擊中耳18天后對大多數(shù)動(dòng)物內(nèi)預(yù)形成的生物質(zhì)缺乏解決方案。作為對照，e.coliihf+佐劑免疫的動(dòng)物的平均分值為1.5。平均分值為+2.8以及平均分值為+1.5的剩余生物質(zhì)的代表性圖像如圖9、b組所示。還有，如圖10所示，所述疾病的解決通過中耳內(nèi)生物質(zhì)架構(gòu)改變的組織學(xué)證據(jù)(參見a組)以及通過生物質(zhì)的均質(zhì)化測量并在巧克力瓊脂上培養(yǎng)的殘留生物質(zhì)內(nèi)負(fù)載細(xì)菌的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著減少(參見組b)而另外測量。此外，所有以分離的e.coliihf免疫的動(dòng)物具有強(qiáng)烈的局部及全身性免疫應(yīng)答，并且通過剖檢注意到免疫結(jié)果是沒有動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的二次后遺癥(未顯示數(shù)據(jù))。

當(dāng)抗ihf用于體外消除生物膜、以及純化的e.coliihf在體內(nèi)作為免疫原誘導(dǎo)能夠解決持續(xù)的生物膜疾病的多克隆抗體形成時(shí)所觀察到的顯著效果，產(chǎn)生了一個(gè)難題：為什么哺乳動(dòng)物宿主不能天然產(chǎn)生對與復(fù)發(fā)和/或慢性疾病狀態(tài)的細(xì)菌生物膜內(nèi)edna相關(guān)的dnabii蛋白的有效免疫應(yīng)答。回顧已解決的ihf結(jié)合dna時(shí)的結(jié)構(gòu)(rice等,(1996)cell87(7):1295-1306)，很清楚所述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要部分被結(jié)合dna所封閉，提示了當(dāng)結(jié)合細(xì)菌生物膜內(nèi)的edna時(shí)，保護(hù)性表位或ihf和/或hu的結(jié)構(gòu)域封閉的潛力。據(jù)推測，無dna結(jié)合的天然ihf作為免疫原的應(yīng)用可以提供克服這種封閉的機(jī)制并從而促進(jìn)保護(hù)性抗體的生產(chǎn)。

為確定edna是否能夠真正阻止針對dnabii家族成員的保護(hù)性抗體在免疫中發(fā)育而使用天然蛋白質(zhì)是有效的，進(jìn)行了第二項(xiàng)大規(guī)模群組研究，其中基本重復(fù)如前所詳述的南美栗鼠研究。

對于第二次動(dòng)物免疫研究，經(jīng)聲導(dǎo)抗測試和視頻耳鏡檢查未顯示中耳疾病的證據(jù)的20只成年南美栗鼠(體重在500-700g)入選，并分為四組，每組5只動(dòng)物。所有動(dòng)物以大約每聽泡1000cfu的nthi株系86-028np重新跨聽泡攻擊。四天之后，在生物膜于這些動(dòng)物的中耳腔內(nèi)形成后，它們通過上述的經(jīng)皮路徑(tci)免疫。制劑由任一種組成：10μgihf與10μgdmlt混合，10μg預(yù)先結(jié)合dna的ihf+dmlt，dna+dmlt，或單獨(dú)的10μgdmlt。

為確定當(dāng)相同的核蛋白復(fù)合物經(jīng)皮下(sq)遞送所誘導(dǎo)以及與ihf單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)相比較，tci和預(yù)結(jié)合dna的ihf是否產(chǎn)生相似的免疫應(yīng)答，兩只成年南美栗鼠被免疫以產(chǎn)生抗血清。每只動(dòng)物接受初始劑量后隨30天間隔遞送的兩個(gè)相同的增強(qiáng)劑量。免疫原與單磷酸脂質(zhì)a(mpl)(10μg/dose)(sigma-aldrich,st.louis,mo)佐劑混合，因其證明了在南美栗鼠宿主中強(qiáng)效的佐劑性質(zhì)(參見例如bakaletz等,(1999)infectimmun.67(6):2746-2762和kennedy的,(2000)infect.immun.68(5):2756-2765)。一只南美栗鼠以10μgihf+mpl免疫，而其它的以10μg結(jié)合dna的ihf+mpl免疫。所有劑量以200μl的總體積經(jīng)皮下遞送。在最后一次增強(qiáng)的十五天后，動(dòng)物放血以搜集血清，并且經(jīng)westernblot和elisa分析血清以確定抗體滴度和抗體反應(yīng)ihf的特異性。

繼而在研究完成后，再次從0至4+對中耳進(jìn)行疾病嚴(yán)重程度計(jì)分。為更好地確保ihf和dna保留在復(fù)合物中用于免疫，應(yīng)用了摩爾比為2:1[dna(10μm)與ihf(5μm)]的與已公開共結(jié)晶研究(參見例如.rice等,(1996)cell87(7):1295-1306)所應(yīng)用的具有來源于噬菌體λ重組位點(diǎn)attp的高親和力ihf結(jié)合位點(diǎn)相同合成寡核苷酸。這一數(shù)量是ihf結(jié)合該dna靶標(biāo)kd值的至少三個(gè)數(shù)量級以上。如圖11所示，如經(jīng)過其在電泳遷移率變動(dòng)中流動(dòng)性減小所證明的，ihf確實(shí)結(jié)合dsdna。

如圖12所示，以分離的e.coliihf免疫的動(dòng)物顯示了疾病狀態(tài)的顯著減少，與單獨(dú)以佐劑免疫(生物質(zhì)平均分值2.2)的對照或以與佐劑混合的dna免疫(生物質(zhì)平均分值2.8)相比，殘留中耳生物質(zhì)分值為0.9。有趣的是，那些以ihf-dna復(fù)合物免疫的動(dòng)物還證明了，具有顯著殘留細(xì)菌生物質(zhì)的中耳產(chǎn)生了2.5的生物質(zhì)平均分值，其與僅接受佐劑或與佐劑混合的dna的群組不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這個(gè)結(jié)果強(qiáng)烈提示如果存在足量的edna片段，作為一個(gè)假設(shè)情況是自然疾病期間，這種狀況可導(dǎo)致用于產(chǎn)生中和抗體所需的關(guān)鍵性ihf表位封閉。

為確信所觀察到的dna封閉結(jié)果并不特異于經(jīng)皮免疫途徑的應(yīng)用，重復(fù)了應(yīng)用皮下(sq)免疫途徑以確保所述抗原遞送給南美栗鼠宿主內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞的免疫。如圖13所示，以分離的e.coliihf皮下免疫控制對分離的ihf的強(qiáng)效免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，而以預(yù)結(jié)合過量dna的e.coliihf免疫無法誘導(dǎo)通過westernblot檢測時(shí)識別ihf的可檢測抗體。當(dāng)通過elisa檢測時(shí)，對于預(yù)結(jié)合寡核苷酸的ihf免疫動(dòng)物，抗體滴度相對于分離的ihf是1000，而對于以天然ihf免疫的動(dòng)物是8000(兩組動(dòng)物對ihf的預(yù)免疫抗體滴度是100)?？傮w地，這些結(jié)果與我們猜想的ihf與edna結(jié)合是一致的，如同在自然疾病狀態(tài)下發(fā)生的，具有封閉產(chǎn)生保護(hù)性獲得性免疫應(yīng)答所需的ihf表位或結(jié)構(gòu)域的潛力。進(jìn)一步的，天然ihf(未結(jié)合dna)免疫顯示出允許免疫應(yīng)答有效導(dǎo)向保護(hù)性或中和性抗體的產(chǎn)生，如同本文所述的兩種臨床前南美栗鼠研究所證明了的。

實(shí)驗(yàn)4

許多口腔細(xì)菌(例如伴放線菌聚集桿菌，牙齦卟啉單胞菌)與炎性疾病例如牙周炎和植入體周炎的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，所述疾病破壞牙槽骨和牙齦。這些細(xì)菌發(fā)病機(jī)制的調(diào)查因缺乏有效動(dòng)物模型而受阻。調(diào)查特定細(xì)菌致病性的挑戰(zhàn)之一是，當(dāng)外源性細(xì)菌導(dǎo)入動(dòng)物口腔時(shí)難以建立生物膜。盡管已開發(fā)了牙周炎的動(dòng)物模型，很少從接種動(dòng)物的口腔內(nèi)回收到可培育的細(xì)菌。能評估特定細(xì)菌致病性的有效動(dòng)物模型的開發(fā)將大大有助于闡明發(fā)病機(jī)制。

加工鈦植入體(1.2x4.5mm)的表面通過以alo3(100m)噴砂以及hcl蝕刻(80ocph7.820分鐘)修飾。加工的以及納米紋理的植入體在以伴放線菌聚集桿菌(aa)臨床株系d7s接種的tsb基質(zhì)內(nèi)37℃孵育1-3天。植入體上的細(xì)菌生物膜通過sem以及隨baclight^tm染色的激光共聚焦掃描顯微鏡分析。建立或未建立aa生物膜的植入體經(jīng)粘膜置于雌性大鼠上頜骨的前臼齒和門齒區(qū)的牙槽骨內(nèi)。為檢測放置在體內(nèi)的植入體上aa生物膜的存在，兩天后由唾液和口腔植入體表面收集細(xì)菌樣品。通過培養(yǎng)以及pcr分析檢測aa。植入體周圍骨骼以及粘膜組織的微型ct和組織學(xué)分析在植入六周后進(jìn)行。

植入一天后，發(fā)現(xiàn)球形aa細(xì)胞的團(tuán)塊遍布整個(gè)植入體。兩天后，團(tuán)塊的數(shù)量和大小下降，并在球形狀態(tài)的細(xì)菌之間觀察到更多不同長度的細(xì)胞。孵育三天之后，團(tuán)塊基本消失了，而大面積的植入體表面被棒狀形態(tài)的細(xì)菌覆蓋，形成密密麻麻的生物膜。此種植入體上三天aa生物膜的染色顯示所有生物膜細(xì)菌的75-80％的綠色信號，提示活細(xì)胞具有無與倫比的細(xì)胞膜完整性。放置體內(nèi)植入體上的aa生物膜的微生物和pcr檢測，植入體表面的樣品是陽性的并且唾液樣品以及對照植入體是陰性的。臨床檢測證明，與對照的未處理植入體相比，具有aa生物膜的植入體周圍有顯著的植入體周圍粘膜炎癥。等待植入體周骨骼和粘膜組織的微型ct和組織學(xué)分析。納米紋理植入體表面有利于aa生物膜的建立并增加了植入體周圍炎的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)驗(yàn)5

該實(shí)驗(yàn)提供了用于臨床前測試干擾劑治療萊姆病的小鼠模型。參見dresser等.pathogens5(12)e1000680,epub2009dec.4。萊姆病是美國最為常見的蜱傳染疾病。報(bào)道的兵力在1992-2006間增加了一倍多，2008年確診了大約29,000新病例。據(jù)估計(jì)，流行地區(qū)萊姆病的實(shí)際例數(shù)可能超過所報(bào)道的6-12個(gè)點(diǎn)。根據(jù)定義，當(dāng)人群持續(xù)地由城市移動(dòng)到郊區(qū)及農(nóng)村地區(qū)并且白尾鹿(其攜帶硬蜱蜱種)越來越多地在這些地區(qū)漫游，這些流行地區(qū)擴(kuò)大了。萊姆病由一種螺旋菌微生物伯氏疏螺旋體引起。伯氏疏螺旋體經(jīng)硬蜱蜱種叮咬傳輸并隨后經(jīng)血流傳播至其它組織和器官。

在該動(dòng)物模型中，c3h/hen小鼠經(jīng)背部皮下以及腹腔內(nèi)注射或經(jīng)靜脈注射螺旋體。在感染大約7天后獲取血液和活檢標(biāo)本用于評估微生物負(fù)載以及評價(jià)組織及器官內(nèi)的病理。本發(fā)明的方法和組合物考慮到了開發(fā)減小和/或消除存在的伯氏疏螺旋體生物膜的治療劑以及預(yù)防策略，所述生物膜在攻擊后形成并確信有助于所述疾病的發(fā)病機(jī)理及長期性。

實(shí)驗(yàn)6

該實(shí)驗(yàn)提供了用于臨床前測試治療囊性纖維化的干擾劑的豬模型。參見stoltz等.(2010)sciencetranslationalmedicine2(29):29ra31。囊性纖維化是一種歸結(jié)于編碼cf跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)(稱為cftr)離子通道的基因突變的常染色體隱性疾病。在該模型中，已特異性繁殖攜帶稱為“cftr”基因缺陷的豬，并且所述cf豬自發(fā)形成了cf肺疾病的標(biāo)志性特征，所述cf肺疾病包括多種細(xì)菌物種引起的下呼吸道感染。所述豬可以所述干擾機(jī)免疫，或者1)以多肽或其它免疫原性試劑免疫這些cf豬，從而誘導(dǎo)能夠根除肺內(nèi)細(xì)菌生物膜的抗體形成(類似于實(shí)驗(yàn)1所示的在主動(dòng)免疫后，ihf的抗體如何根除駐留在南美栗鼠中耳內(nèi)的生物膜)，通過霧化吸入遞送抗ihf(或其它干擾劑)至這些動(dòng)物的肺臟以改善疾病和相關(guān)病癥的跡象。

實(shí)驗(yàn)7

申請人還提供了肺結(jié)核(tb)的臨床前模型。參見ordway等.(2010)anti.agentsandchemotherapy54:1820。結(jié)核分枝桿菌微生物對全球疫病增長負(fù)責(zé)。當(dāng)前數(shù)字提示，每年大約800萬的tb新病例以及約270萬人因tb死亡。該微生物除了與hiv共感染個(gè)體(在大約4500萬hiv感染者中，估計(jì)有1/3還共感染結(jié)核分枝桿菌)的作用外，特別麻煩的是，所述分離物變得高度耐受多種藥物，并且超過四分之一世紀(jì)以來沒有新的針對tb的藥物引入。在該動(dòng)物模型中，spf豚鼠被保留在阻菌屏障內(nèi)，并經(jīng)霧化噴霧感染遞送約20cfu的結(jié)核分枝桿菌株系erdmank01桿菌至其肺臟。攻擊后第25、50、75、100、125和150天，在確定細(xì)菌負(fù)荷后處死動(dòng)物，并回收組織用于組織病理檢查。與小鼠不出現(xiàn)經(jīng)典tb跡象不同，以此方式攻擊的豚鼠出現(xiàn)了組織良好的中央壞死性肉芽腫，一種人類疾病的標(biāo)志。并且，類似于人類，豚鼠出現(xiàn)了作為原發(fā)病灶綜合體一部分的嚴(yán)重杓肉芽腫以及淋巴結(jié)的壞死性淋巴結(jié)炎。這個(gè)模型的應(yīng)用提供了臨床前篩選以確認(rèn)和鑒定用于減小和/或消除產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌生物膜的治療及預(yù)防策略，所述生物膜被發(fā)現(xiàn)在攻擊后形成于這些動(dòng)物的肺臟內(nèi)，并且據(jù)信有助于所述疾病的發(fā)病及慢性化。

實(shí)驗(yàn)8

已知導(dǎo)管/留置裝置生物膜感染的多種動(dòng)物模型。參見otto(2009)naturereviewsmicrobiology,7:555。盡管通常被當(dāng)作正常皮膚菌群，表皮葡萄球菌微生物已成為很多人認(rèn)為的重要的條件致病菌，居院內(nèi)感染病原體之首。主要地，這種細(xì)菌對在裝置插入時(shí)被這種常見皮膚移民所污染的植入醫(yī)療設(shè)備上出現(xiàn)的大多數(shù)感染負(fù)責(zé)。盡管通常不是危及生命的，與這些生物膜感染治療相關(guān)的困難與其出現(xiàn)頻率組合，使得其成為嚴(yán)重的公共健康負(fù)擔(dān)。當(dāng)前，美國每年僅與歸結(jié)于表皮葡萄球菌的血液感染相關(guān)的血管導(dǎo)管治療相關(guān)費(fèi)用為20億美元。除表皮葡萄球菌外，在植入醫(yī)療設(shè)備上還發(fā)現(xiàn)了糞腸球菌和金黃色葡萄球菌。存在數(shù)種導(dǎo)管相關(guān)表皮葡萄球菌感染的動(dòng)物模型包括兔子、小鼠、豚鼠以及大鼠，所有這些都用于研究發(fā)病的分子機(jī)制并使得它們用于預(yù)防和/或治療的研究。大鼠頸靜脈導(dǎo)管已用于評估干擾糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的治療。生物膜減小通常以三種方式測量-(i)超聲導(dǎo)管和計(jì)算的cfus，(ii)導(dǎo)管切片或簡單放置在平板上，并且評分，或者(iii)所述生物膜可用結(jié)晶紫或其它染料染色、洗脫并測量od值作為cfus的代理。

實(shí)驗(yàn)9

本文所述的方法可用于在人或動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答?？稍谧魟├绲幌抻阡X鹽和脂質(zhì)體的存在下給人類或動(dòng)物受試者施用免疫原性組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解還可應(yīng)用任意數(shù)量的藥學(xué)上可接受的佐劑。免疫組合物可以通過肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或其它任意適合途徑施用給人類或動(dòng)物受試者。免疫原性組合物可通過與所選擇的給藥模式相一致的方式制備。免疫組合物可以采取多肽、核酸或其組合物的形式，并可包含全長或部分抗原。此外或可選地，免疫組合物可采用apcs加特定抗原、或以一個(gè)或多個(gè)編碼特定抗原的多核苷酸轉(zhuǎn)染的apcs的形式。給藥可包括單劑量的免疫原性組合物、或后隨一次或多次增強(qiáng)劑量的初始給藥。增強(qiáng)劑量可每天、每兩天、每三天、每周、每兩周、每三周、一月、二月、三月、六月或十二個(gè)月提供，或在起始劑量之后的任何其它時(shí)間點(diǎn)。增強(qiáng)劑量可在受試者抗體滴度評估后給藥。

實(shí)驗(yàn)10

本文所述的方法可用于賦予非免疫受試者被動(dòng)免疫。針對給定抗原的被動(dòng)免疫可通過特異識別或結(jié)合特定抗原的抗體或抗原結(jié)合片段的轉(zhuǎn)移賦予?？贵w的供者和受者可以是人類或非人類受試者。此外或可選地，所述抗體組合物可包含編碼特異識別或結(jié)合特定抗原的抗體或抗原結(jié)合片段的分離或重組的多核苷酸。

被動(dòng)免疫可在免疫原性組合物給接受者帶來風(fēng)險(xiǎn)的情況下賦予，所述接受者是免疫功能低下的，或所述接受者需要立即進(jìn)行免疫。免疫原性組合物可以與所選擇的給藥模式相一致的方式制備。組合物可包含全抗體、抗原結(jié)合片段、多克隆抗體、單克隆抗體、體內(nèi)產(chǎn)生的抗體、體外產(chǎn)生的抗體、純化或部分純化的抗體、或全血清。給藥可包括單劑量的免疫原性組合物、或后隨一次或多次增強(qiáng)劑量的初始給藥。增強(qiáng)劑量可每天、每兩天、每三天、每周、每兩周、每三周、一月、二月、三月、六月或十二個(gè)月提供，或在起始劑量之后的任何其它時(shí)間點(diǎn)。增強(qiáng)劑量可在受試者抗體滴度評估后給藥。

實(shí)驗(yàn)11

dnabii家族成員對于包括基因轉(zhuǎn)錄的多個(gè)核蛋白系統(tǒng)是高度多效的，并且另外，其通常因而是必不可少的。相比之下，hu和ihf突變體可在e.coli實(shí)驗(yàn)室株系中產(chǎn)生并廣泛研究。未確定ihf和hu在edna形成中的作用，e.coli株系mg1655或其hu及ihf缺陷衍生物所形成的生物膜與抗ihf抗體(如granston和nash(1993)j.mol.biol.,234:45-59所述制備)孵育。如圖8所示，盡管親本分離物株系mg1655在體外產(chǎn)生了茁壯的生物膜(畫面a)，hu和ihf突變體株系沒那么茁壯(分別為面畫c和e)。hu缺陷突變體形成了大約1/2野生型生物膜高度的生物膜，盡管ihf缺陷株系產(chǎn)生了大約2/3親本分離物高度的生物膜。這一結(jié)果提示兩個(gè)蛋白均涉及e.coli生物膜eps的產(chǎn)生和/或整合。在以抗ihf處理后，所述由野生型分離物形成的生物膜顯示了顯著的減積以及高度的58.1％平均百分?jǐn)?shù)減少，生物質(zhì)的73.1％百分?jǐn)?shù)減少以及平均厚度的87％的減少(畫面b)，盡管hu突變體形成的生物膜沒有表現(xiàn)出高度的減小并且僅有30.9％的生物量減少以及37.2％的平均厚度減少(畫面d)。與之相比，在ihf突變體所形成的生物膜上未觀察到高度(減小-3.4％)、生物量(減小-20.5％)、平均厚度(減小-19.8％)損失效果(畫面f)。總體地，這些數(shù)據(jù)暗示對于這種e.coli株系，ihf很可能是應(yīng)用抗ihf抗體所能靶向的惟一結(jié)構(gòu)元素。由于至今在體內(nèi)已形成的生物膜內(nèi)僅看到高度結(jié)構(gòu)化交織的edna，通過相應(yīng)突變體的剩余dnabii家族成員表達(dá)的確認(rèn)以及所得到dna結(jié)構(gòu)的任意改變有待體內(nèi)免疫熒光分析。

實(shí)驗(yàn)12

盡管本申請已證明在體外及體內(nèi)，抗ihf以及ihf作為免疫原的應(yīng)用均顯示了在生物膜減積和/或解決各自生物膜疾病中的用途，不清楚抗ihf的nthi生物膜減積是否在于其它治療治療方法組合時(shí)也有協(xié)同作用。為此，當(dāng)次優(yōu)濃度的抗ihf與三種獨(dú)特試劑中的每一種一起使用時(shí)，評估了誘導(dǎo)預(yù)形成nthi生物膜的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性增加的能力。這三種試劑包括1)已知能夠在體外降解nthi生物膜的dna降解酶(dnasei)(但在此應(yīng)用次優(yōu)濃度)，2)單獨(dú)使用時(shí)不能破壞預(yù)形成nthi生物膜的針對外膜蛋白的抗血清(抗ompp5)(未顯示數(shù)據(jù))，以及3)通常在具有慢性和/或復(fù)發(fā)性om的兒童中作為第一線選擇但對駐留在生物膜群落內(nèi)的細(xì)菌效果有限的抗生素(阿莫西林)。

圖14a顯示了以證明為次優(yōu)濃度的dnase處理的nthi生物膜有一個(gè)邊際效應(yīng)(參見4aii)。同樣，1:200稀釋的抗ihf對預(yù)形成的nthi生物膜幾乎不具有作用參見4aiii)。然而與之相比，當(dāng)這兩種試劑組合使用時(shí)，所述生物膜顯著減少(參見14aiv)。通過該實(shí)驗(yàn)三次重復(fù)，我們發(fā)現(xiàn)生物膜減積的最顯著協(xié)同效應(yīng)測定為高度的減值。下表7描述了這些結(jié)果。

表7

這種結(jié)果的一個(gè)簡單解釋是，當(dāng)dnabii蛋白被從生物膜外周中和時(shí)，edna更容易受到dnase的作用。

圖14b顯示了以抗ompp5處理預(yù)形成nthi生物膜的結(jié)果。盡管這種抗血清與分離的nthiompp5(未顯示數(shù)據(jù))強(qiáng)烈作用并進(jìn)一步的，分離ompp5的主動(dòng)免疫在調(diào)節(jié)針對南美栗鼠模型中實(shí)驗(yàn)性om的重要保護(hù)中有效(參見例如.25.bakaletz等,(1997)vaccine15(9):955-961；bakaletz等,(1999)infectimmun67(6):2746-2762；kennedy等,(2000)infectimmun68(5):2756-2765；kydjm,等,(2003)infectimmun71(8):4691-4699；novotnyla,等,(2000)infectimmun68(4):2119-2128；novotnyla,等,(2002)vaccine20(29-30):3590-3597和novotnyla,等,(2003)jimmunol171(4):1978-1983)，當(dāng)這種抗血清以1:50稀釋時(shí)不能誘導(dǎo)已在體外形成的nthi生物膜結(jié)構(gòu)完整性的改變(參見14bii)。觀察到了類似于這些生物膜與次優(yōu)稀釋抗ihf(在此以1:100稀釋)孵育時(shí)的邊際效應(yīng)(參見14bi)。然而，當(dāng)抗p5加上抗ihf組合使用時(shí)，產(chǎn)生的生物膜高度減量超過這兩種抗血清單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的總量(參見14biii)，因而提示協(xié)同作用的結(jié)果。因此，得出的結(jié)論是，破壞nthieps基質(zhì)的抗ihf的應(yīng)用導(dǎo)致靶細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白(例如ompp5)的暴露，否則這些蛋白將被edna以及eps的可能其它成分遮蔽，從而允許通過至今仍不清楚的機(jī)制免疫介導(dǎo)細(xì)菌清除。

最后，圖14c顯示了以阿莫西林處理預(yù)形成nthi生物膜的結(jié)果。當(dāng)以64μg/ml的濃度應(yīng)用時(shí)，盡管有有限細(xì)菌細(xì)胞死亡的證據(jù)，阿莫西林在預(yù)形成的nthi生物膜結(jié)構(gòu)上沒有可測量的效果(參見14cii)。1:50稀釋的ihf抗血清處理如前所述顯著降低了生物膜的高度(參見14ciii)。然而令人感興趣的是，當(dāng)兩種試劑一同使用時(shí)，不僅生物膜的高度存在顯著降低(參見14civ)，并且活體染料提示大部分殘留在生物膜內(nèi)的細(xì)菌現(xiàn)在已死亡，如通過成像生物膜內(nèi)的紅色通道中的主要熒光所指出的。這種結(jié)果表明，抗ihf的生物膜減積可能足以暴露所述細(xì)菌以創(chuàng)造更接近敏感阿莫西林濃度的條件，所述濃度已知在測試針對浮游nthi時(shí)有效。這種結(jié)果可以通過增加駐留生物膜基質(zhì)內(nèi)細(xì)菌對阿莫西林作用的物理暴露，和/或通過如我們早先顯示的在生物膜減積期間發(fā)生的通過暴露于抗ihf抗體(參見圖4)增加釋放細(xì)菌進(jìn)入浮游階段來調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)13

申請人已顯示經(jīng)皮免疫的抗ihf抗體誘導(dǎo)有效解決南美栗鼠中耳內(nèi)由nthi誘導(dǎo)的生物膜。還顯示了幼稚ihf的應(yīng)用對于保護(hù)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是必不可少的，當(dāng)其結(jié)合edna時(shí)，保護(hù)性表位表現(xiàn)為已被遮蔽，如tci和sq免疫之后所示。不過，可能具有廣泛保護(hù)效果的疫苗候選物的合理設(shè)計(jì)要求詳細(xì)了解所述蛋白的免疫顯性和/或保護(hù)性表位，其可能既不明顯也不一定是連續(xù)的。目前的疫苗候選物設(shè)計(jì)策略在方法上更為簡單，并通常瞄準(zhǔn)鑒定和應(yīng)用誘導(dǎo)高親和力以及保護(hù)性抗體必不可少的所述靶蛋白的部分。為此，完成了表位定位以確定最有效的免疫原。

表位定位可以如novotny等,(2009)vaccine28:(1):279-289所記載的以及依據(jù)下述步驟進(jìn)行。為產(chǎn)生免疫血清，南美栗鼠通過皮下(sq)注射10μg幼稚ihf蛋白、具有ihfαc末端20個(gè)氨基酸的多肽、具有ihfβc末端20個(gè)氨基酸的多肽、或具有tbp-dnabii60-76位氨基酸的多肽與單磷酸脂質(zhì)a(mpl；corixa)佐劑混合或以mpl單獨(dú)給藥(只有佐劑的對照組)而胃腸道外免疫。兩個(gè)相同的增強(qiáng)免疫可在21天間隔遞送。血液血清可在接受最后一次免疫劑量10天后收集。可以進(jìn)行南美栗鼠抗血清的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)和免疫印跡。對于elisa，可在抗所遞送免疫原包被的96孔板中測試(0.2μg蛋白/孔)。滴度可定義為血清稀釋度的倒數(shù)，其產(chǎn)生了比含有血清外所有成分的對照孔大0.1的od450值。elisa檢測最少進(jìn)行3次并且所述結(jié)果以幾何平均數(shù)報(bào)告。免疫印跡可應(yīng)用1:100稀釋的免疫血清抗1μg相應(yīng)抗原而進(jìn)行，并且以hrp蛋白a(zymed,southsanfrancisco,ca)檢測。以cn/dab底物形成色彩(pierce,rockford,il)。

為定位nthi的ihf蛋白的表位，可合成一系列具有5個(gè)殘基重疊的20-mer合成肽。所有合成肽的合成、純化和序列確認(rèn)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(參見例如.bakaletzlo.等,(1997)infect.immun.71(8):4691-9和bakaletzlo等,(2001)vaccine68(4):2119-28)。可應(yīng)用氨基酸分析和質(zhì)譜分析確定純度、組合物以及每種肽的氨基酸序列。

可以如所記載的，應(yīng)用biacore3000儀器研究分析合成肽和血清中抗體的相互作用，并且所有試劑均可從biacore(uppsala,sweden)購買。簡單地，肽可在應(yīng)用胺偶聯(lián)化學(xué)固定于活性試劑級cm5傳感芯片表面之前懸浮于醋酸鈉緩沖液中。對于相互作用分析，15μl血清(在1mg羧甲基葡聚糖/mlhbs-ep緩沖液中1:2稀釋)可以以5μl/分鐘的流速注射通過所述傳感芯片表面。每個(gè)樣品中抗原或免疫原特異性抗體的相對量可計(jì)算為每個(gè)樣品注射前5秒和注射后45秒獲得的諧振單元(ru)內(nèi)的差異。所述傳感芯片可在樣品之間以25mmnaoh再生。與血清中抗體最強(qiáng)相互作用的合成肽可能是能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)高親和力保護(hù)性抗體的最有希望的候選物。

可產(chǎn)生針對來自表位定位的大多數(shù)免疫原性肽的兔多克隆抗血清。這種抗血清可用于通過柱層析從非中和性抗體中親和純化中和性抗體。要做到這一點(diǎn)，可應(yīng)用兔及南美栗鼠多克隆抗血清(后者已顯示為保護(hù)性的)。血清可在每次過柱之前及之后檢測哪一種為幼稚ihf所結(jié)合或哪一種預(yù)混合dna的ihf被結(jié)合。只有那些不結(jié)合dna-ihf復(fù)合物的抗體是中和性的。所有流通和洗脫的抗血清然后將通過分析減積相對能力的體外生物膜和nthi生物膜針對原抗血清池測試，以及通過elisa、免疫印跡和生物傳感器檢測確定特異性和滴度。作為一種額外的測試，表位靶向的疫苗候選物可結(jié)合所述層析柱以確定他們是否能清除現(xiàn)已被證明是中和性的抗體。

應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)本發(fā)明與上述實(shí)施方式配合使用時(shí)，前面的描述和實(shí)施例意在解釋且不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)勢以及修改對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

除非本文另有所指，本文所應(yīng)用的所有技術(shù)和科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。本文提供的所有核苷酸序列是5’到3’方向的。

在此舉例說明的發(fā)明可以適當(dāng)?shù)卦谌狈θ我庖粋€(gè)或多個(gè)在此未特別公開的元素、限制的情況下實(shí)行。因此，例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等等應(yīng)當(dāng)擴(kuò)張閱讀且沒有限制。此外，在此應(yīng)用的術(shù)語和表述已用作說明書的術(shù)語并不具有限制，而且這些術(shù)語和表述的使用無意排除所顯示和描述特征的等價(jià)物或其部分，但公認(rèn)各種修正可能在本發(fā)明要求的范圍內(nèi)。

因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選具體實(shí)施方式和可選特征具體公開，在此公開的發(fā)明體現(xiàn)的修改、改進(jìn)及變化可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員作出，并且此類修改、改進(jìn)和變化被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此處提供的物質(zhì)、方法和實(shí)施例是代表性的優(yōu)選具體實(shí)施方式，是示范的，并且無意作為本發(fā)明范圍的限制。

已在此廣泛和一般地描述本發(fā)明。落入一般披露內(nèi)的每一種縮小物種以及亞屬分組同樣構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括了具有例外或由該屬中排除任意題材的否定限定的本發(fā)明的一般性描述，不考慮所排除物質(zhì)是否在此特別列舉。

此外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組的方式記載時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識本發(fā)明也因而記載了馬庫什組的任意個(gè)體成員或分組成員。

在此提到的所有出版物、專利申請、專利以及其它參考，通過引用整體明確地并入至每個(gè)通過單獨(dú)引用并入的相同程度。在發(fā)生沖突的情況下，由本發(fā)明說明書包括定義決定。

表9a1(續(xù))

表9a2

表9a2(續(xù))

表9a3

表9a3(續(xù))

表9b

表9b(續(xù))

表9b(續(xù))