本發(fā)明屬于醫(yī)藥保健領(lǐng)域，具體涉及到靈芝孢子油在制備預(yù)防心血管疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

全世界每年有1660萬人死于心血管疾病，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)：至2020年，這個(gè)數(shù)字將增至2500萬，2020年心血管疾病將成為世界上第一位死因，心血管疾病患者的迅速增加，不僅增加了失能和殘障的機(jī)會，造成了巨大的勞動力損失，也加速了疾病診斷、治療費(fèi)用上漲，僅從中國來看，2003年，翟屹等對中國35-74歲人的高血壓、冠心病和腦卒中的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)進(jìn)行研究，得出直接經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)分別為：201.5億、157.9億和242.97億元人民幣，由高血壓導(dǎo)致的冠心病和腦卒中的直接經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)達(dá)190.84億元人民幣，占這兩種疾病直接疾病負(fù)擔(dān)的47.7％，給患者本人、家庭及社會帶來了極大的痛苦和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，加大了家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，醫(yī)療技術(shù)水平不斷提高，各類藥物大量涌現(xiàn)，西藥在治療心血管疾病具有起效快的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在需長期服藥、副作用大等缺點(diǎn)和不足，在臨床上，對治療過程中的探索發(fā)現(xiàn)，中草藥在治療心血管疾病中能彌補(bǔ)西藥治療的不足，并且具有單一用藥得到更好療效的優(yōu)點(diǎn)，隨著研究不斷深入，加上對中藥有效成分的不斷認(rèn)識，中草藥治療心血管疾病越來越多的被患者和醫(yī)務(wù)人員接受，且具有一定的優(yōu)越性。

靈芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst是我國著名的高等藥用真菌，作為藥物已有2000多年的歷史了(林志彬，2001)，靈芝的整個(gè)生活史包括：靈芝菌絲體、靈芝孢子和靈芝子實(shí)體，但三者在化學(xué)成分上有顯著性差異，于華崢等(2016)研究報(bào)道顯示：靈芝子實(shí)體、菌絲體和孢子粉不僅多糖含量差異較大，靈芝菌絲體多糖含量達(dá)3.81％，孢子粉多糖含量為1.8％，靈芝子實(shí)體中多糖含量僅為0.59％，且在多糖的組成也有很大差異，通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)這3種材料所含多糖的種類也不一致，酶解其鏈接方式也不一致；陳軍輝等研究報(bào)道：靈芝子實(shí)體中含有豐富的靈芝酸、靈赤酸、赤芝酸甲酯、靈芝孢子內(nèi)酯等三萜類成分，保留時(shí)間50min之前的峰多數(shù)為靈芝酸類化合物，與靈芝孢子粉相對，靈芝子實(shí)體中含有三萜酸類化合物的含量明顯比孢子粉中的高。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的孢子，為靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，經(jīng)萃取后獲得靈芝孢子油是靈芝孢子的脂質(zhì)活性成分，陳體強(qiáng)等研究定量分析結(jié)果表明：靈芝孢子油中檢出9種一直脂肪酸，不飽和脂肪酸總量為73.6％，其中油酸、亞油酸等含量分別為57.5％、13.4％，還有少量十六碳烯酸、亞麻酸及19.6％飽和脂肪酸棕櫚酸。

靈芝提取物具有強(qiáng)心作用、抗心肌缺血作用，并證明后一作用與其增加冠脈流量及心肌營養(yǎng)性血流量，改善心肌微循環(huán)，增加心肌供氧有關(guān)，林志彬等研究發(fā)現(xiàn)：靈芝子實(shí)體三萜類物質(zhì)能抑制血管平滑肌細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；1986年，Morigiwa等報(bào)道從紅芝的70％乙醇提取物中分離出的8種靈芝三萜具有體外抑制豬腎血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的作用，而ACE的高活性是高血壓病發(fā)病的重要因素，因此推斷靈芝三萜可能具有體內(nèi)降低血壓功效；2007年劉冬等根據(jù)Morigiwa的報(bào)道對靈芝子實(shí)體中三萜類物質(zhì)降血壓作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)：給藥劑量分別在450mg/kg和900mg/kg時(shí)，從靈芝子實(shí)體中提取的三萜類物質(zhì)對SHR大鼠具有明顯的降壓作用；楊紅梅等發(fā)現(xiàn)：1％靈芝多糖能明顯改善失血性休克再灌注家兔的心功能；薛華等以靈芝子實(shí)體多糖給藥T2DM大鼠16周發(fā)現(xiàn)：靈芝子實(shí)體多糖能降低血糖水平而且能明顯改善T2DM大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)，降低其氧化應(yīng)激水平；而專利(CN1365816)公布含有靈芝寡糖的心血管病防治保健藥物及其制備方法。

綜上所述，靈芝孢子和子實(shí)體雖是靈芝生活史重要生長階段，但靈芝子實(shí)體和靈芝孢子在化學(xué)成分種類和含量上有顯著性差異，靈芝子實(shí)體的脂溶性活性成分集中在總?cè)粕?，其多糖含量低，單糖主要為葡萄糖和半乳糖；而靈芝孢子的脂溶性活性成分集中在不飽和脂肪酸上，其多糖含量高，單糖主要為葡萄糖。截止目前，關(guān)于靈芝改善心血管疾病的報(bào)道均集中在靈芝子實(shí)體提取的三萜類物質(zhì)和多糖類物質(zhì)上，而關(guān)于靈芝孢子及靈芝孢子油在改善心血管功能的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種靈芝孢子油在制備防治心血管疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用了結(jié)扎左冠狀動脈所致高血壓型心臟病模型，以收縮期和舒張期左室室壁厚度、內(nèi)徑數(shù)據(jù)、左室射血分?jǐn)?shù)等作為觀測指標(biāo)，對其心功能進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，從靈芝孢子中提取分離的活性成分靈芝孢子油在有效劑量3g/(kg·BW)情況下，可改善心臟功能，射血分?jǐn)?shù)達(dá)66.02，接近空白對照組數(shù)值；心血輸出量也有較好的改善，尤其是左心室的舒張能力有明顯改變。說明靈芝孢子油具有預(yù)防心血管疾病的作用，可用于制備防治心血管疾病的藥物。

上述應(yīng)用中，所述的靈芝孢子油可通過索氏萃取法、超臨界CO₂萃取法、微波提取法和超聲提取法中的一種獲得。

所述索氏萃取法獲取靈芝孢子油的具體步驟為：破壁靈芝孢子粉在45℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，取15g破壁靈芝孢子粉于索氏提取器中，以石油醚為溶劑，60℃回流提取8h，得到石油醚萃取液，所得萃取液經(jīng)減壓蒸餾后，用無水Na₂SO₄干燥24h，收集油樣。

所述超臨界CO₂萃取法獲取靈芝孢子油的具體步驟為：破壁靈芝孢子粉在45℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，取100g破壁靈芝孢子粉置于1L的萃取斧中進(jìn)行萃取，萃取壓力14MPa、萃取溫度34℃、萃取時(shí)間5h、CO₂流量25L/h，收集油樣。

所述微波提取法獲取靈芝孢子油的具體步驟為：破壁靈芝孢子粉在45℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，取20g破壁靈芝孢子粉，用水浸濕后置于提取罐中，按料液比15:1加入石油醚，放入微波設(shè)備中提取，微波功率825W、溫度45℃、提取時(shí)間20min，提取結(jié)束后用抽濾法分離溶劑混合物與殘?jiān)?，洗滌殘?jiān)?-3次，合并所得濾液，經(jīng)減壓蒸餾后，用無水Na₂SO₄干燥24h，收集油樣。

所述超聲波提取法獲取靈芝孢子油的具體步驟為：破壁靈芝孢子粉在45℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，取20g破壁靈芝孢子粉于三角瓶中，按料液比15:1加入石油醚，晃動三角瓶，使靈芝孢子粉與浸提液完全接觸，把三角瓶放入超聲處理器中進(jìn)行提取。超聲波功率350W、溫度40℃、提取時(shí)間30min、提取3次。提取結(jié)束后用抽濾法分離溶液，洗滌殘?jiān)?-3次，合并所得濾液，經(jīng)減壓蒸餾后，用無水Na₂SO₄干燥24h，收集油樣。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用效果：

相對于目前的其它治療心血管疾病的藥物而言，本發(fā)明具有以下的有益效果：(1)靈芝孢子油是一種純天然藥物，毒副作用小，既可以用作治療藥物，可以用作預(yù)防藥物；(2)本發(fā)明應(yīng)用心血管疾病模型和非侵入式超聲技術(shù)有機(jī)結(jié)合，彌補(bǔ)傳統(tǒng)模型的局限性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近真實(shí)情況；(3)本發(fā)明首次驗(yàn)證了靈芝孢子油在防治心血管疾病中的應(yīng)用效果。

【附圖說明】

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中高血壓型心血管疾病模型小鼠的左心室超聲波圖像；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中高血壓型心血管疾病模型小鼠的左心室壁厚度(收縮期)；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中高血壓型心血管疾病模型小鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中各實(shí)驗(yàn)組小鼠的心血輸出量；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中各實(shí)驗(yàn)組小鼠的射血分?jǐn)?shù)；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中各實(shí)驗(yàn)組小鼠的短軸縮短率；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中各實(shí)驗(yàn)組小鼠的左心室直徑。

【具體實(shí)施方式】

為了驗(yàn)證本發(fā)明的應(yīng)用效果，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。在未作說明的情況下，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。

心血管疾病模型建立方法：打開小鼠胸腔暴露左冠狀動脈降支，在左心耳下方2mm處用6-0絲線結(jié)扎動脈，結(jié)扎后按常規(guī)縫合并頸部皮下注射0.5ml生理鹽水以防脫水，術(shù)后進(jìn)行常規(guī)護(hù)理，以假手術(shù)組(假手術(shù)組僅縫線不打結(jié))為對比，利用超聲波檢測模型是否成功，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)：左心室心肌肥厚，心腔變大，射血分?jǐn)?shù)減少并伴隨著心室壁增厚及線粒體結(jié)構(gòu)異常(如圖1-3所示)，說明高血壓型心血管疾病模型成功建立。

靈芝孢子油的制備：本實(shí)施例中所用的靈芝孢子油是采用申請?zhí)枮?00610035574.8發(fā)明專利所述的方法獲得的，但是本發(fā)明中的靈芝孢子油并不局限于此。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組：將實(shí)驗(yàn)小鼠采用隨機(jī)數(shù)目表法隨機(jī)分為4組，除正常對照組3只小鼠外，其余組均為6只小鼠，雌雄各半，各組小鼠的處理如下：

受試樣品給藥組：以靈芝孢子油先給藥1周，劑量為3g/(kg·BW)，建模成功后，繼續(xù)給藥2周；

陽性對照組：灌胃陽性藥物心得安，劑量：10mg/kg，連續(xù)每日灌胃1周，建模成功后，繼續(xù)給藥2周；

正常對照組：灌胃與靈芝孢子油等劑量的溶媒1周，以假手術(shù)代替建模手術(shù)后，繼續(xù)灌胃2周；

模型對照組：灌胃與靈芝孢子油等劑量的溶媒1周，建模成功后，繼續(xù)灌胃3周。

飼養(yǎng)管理和檢測方法：采用標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)在恒溫(22±2)℃、恒濕(55±5)％、人工光照明暗各12h的安靜飼養(yǎng)室內(nèi)，3周后小鼠經(jīng)誘導(dǎo)麻醉，胸部脫毛，調(diào)節(jié)超聲探頭部位以獲取胸骨旁長軸B-Mode圖像，然后再M(fèi)-mode圖像下，采集收縮期和舒張期左室室壁厚度和內(nèi)徑數(shù)據(jù)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)，對其心功能進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4-7所示：與模型對照組比，灌胃靈芝孢子油，可改善心臟功能，射血分?jǐn)?shù)達(dá)66.02，接近空白對照組數(shù)值；心血輸出量也有較好的改善，尤其是左心室的舒張能力有明顯改變。

綜合以上結(jié)果，靈芝孢子油對高血壓型心血管疾病具有預(yù)防和輔助治療作用，通過改善心血輸出量、左心室舒張能力、射血分?jǐn)?shù)，從而起到預(yù)防或治療的作用，可應(yīng)用于人類心血管相關(guān)疾病的治療。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。