本申請要求2014年3月21日遞交的美國臨時專利申請第61/968,716號的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引證在此全部并入本文。.
背景技術(shù)：
：這里描述了一種對ECM衍生的水凝膠進(jìn)行消毒的方法。細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)腳手架的最終消毒(例如，通過與環(huán)氧乙烷(EtO)氣體相接觸、暴露在γ射線照射中或者電子束輻射中)能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)衍生的水凝膠的形成。臨床前的研究結(jié)果已經(jīng)顯示并且持續(xù)表明細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)降解產(chǎn)物的顯著效果，而細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)水凝膠中富集這種細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)降解產(chǎn)物。在臨床轉(zhuǎn)化并廣泛的商業(yè)應(yīng)用水凝膠產(chǎn)品之前，必須首選確定細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)水凝膠的消毒方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：這里描述了制備細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)凝膠劑及其相關(guān)組合物的方法。用一種酸性蛋白質(zhì)消化最終消毒的細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)材料產(chǎn)生消化液，然后中和并將所得溶液溫度升高到37℃時通常不會產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)水凝膠。而這里所描述的是一些溶液會遇到這種問題，即在最終消毒之后，仍然會產(chǎn)生可再生的凝膠化作用。通過環(huán)氧乙烷、電子束和γ射線對多劑量的實心板形式的細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)腳手架進(jìn)行消毒不會形成水凝膠。但是，我們在這里顯示，在消毒之前，所述材料從板型變成冷凍干燥的細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)消化液會導(dǎo)致水凝膠的形成。如下面實施例所示，舉例并不做任何限制，冷凍干燥(凍干)細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)消化物，通過與環(huán)氧乙烷氣體接觸對干燥的消化物消毒，并在水中重新組成干燥的預(yù)-凝膠，產(chǎn)生另一種消化物，這種消化物經(jīng)過中和并在37℃下培養(yǎng)克再生的成膠。根據(jù)這些結(jié)果，可以預(yù)計使用其他可接受的方法(例如電子束輻射、γ射線、X射線、超臨界二氧化碳方法)對干燥的消化物進(jìn)行最終消毒同樣可以形成細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)水凝膠。這里提供了用于制備消毒的、凝膠化的、溶液化的細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)組合物的方法，這種組合物可以有效用作細(xì)胞生長腳手架。在移植到病人中或者對病人施用之前，所述組合物處于非凝膠化形式，在凝膠化之前鑄模并在此處原位成膠。這里還提供了使用本發(fā)明方法制備的組合物及其應(yīng)用。在一個實施方案中，提供了一種裝置，例如，假肢。所述裝置包括一種無機(jī)基質(zhì)，在此無機(jī)基質(zhì)中分散著經(jīng)過消毒、凝膠化、溶液化的ECM，從而促進(jìn)細(xì)胞生長入細(xì)胞外基質(zhì)中并因此使病人適應(yīng)該裝置和/或?qū)⒃撗b置附著到病人身上。附圖說明圖1是示意圖，顯示了這里所描述的股骨移植物的實施方案。圖2是示意圖，顯示了這里所描述的義肢手的實施方案。圖3是膀胱壁橫截面示意圖(未按比例描繪)。顯示了下列結(jié)構(gòu)：上皮細(xì)胞層(A)、基膜(B)、固有膜(C)、粘膜肌層(D)、粘膜下層(E)、外肌膜(F)、漿膜層(G)、粘膜(H)和膀胱管(L)。圖4A是冷凍干燥的豬膀胱基質(zhì)(UBM)層的照片。圖4B是冷凍干燥的豬膀胱基質(zhì)(UBM)粉末的照片。圖4c是濃度為10毫克/毫升的膀胱基質(zhì)(UBM)胃蛋白酶消化液照片。圖4D是4毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)和8毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)的照片，其中，顯示4毫克/毫升的膠原蛋白I(ColI)水凝膠做對比(D)。圖5顯示了膀胱基質(zhì)(UBM)和膠原蛋白I水凝膠的凝膠電泳結(jié)果。圖6A是3毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠在5,000X下的掃描電子顯微照片(SEM)。圖6B是3毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠在10,000X下的掃描電子顯微照片(SEM)。圖6C是6毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠在5,000X下的掃描電子顯微照片(SEM)。圖6D是6毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠在10,000X下的掃描電子顯微照片(SEM)。圖7A是4毫克/毫升膠原蛋白I凝膠在5,000X下的掃描電子顯微照片(SEM)圖7B是4毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠在5,000X下的掃描電子顯微照片(SEM)圖8A顯示了比濁法測定的膠原蛋白I和膀胱基質(zhì)(UBM)水凝膠的凝膠化動力學(xué)，通過在凝膠化期間使用分光光度計測定吸光度來確定。結(jié)果顯示為測量的吸光度值。圖8B顯示了比濁法測定的膠原蛋白I和膀胱基質(zhì)(UBM)水凝膠的凝膠化動力學(xué)，通過在凝膠化期間使用分光光度計測定吸光度來確定。結(jié)果顯示為規(guī)范化的吸光度值，這可以用于計算動力學(xué)參數(shù)，例如t1/2(達(dá)到50％最大濁度的時間)、tlag(凝膠化的滯后時間)和S(凝膠化速度)。圖9顯示了比濁法測定的1毫克/毫升小腸粘膜下層(SIS)凝膠的凝膠化動力學(xué)。圖10顯示了膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠在凝膠化期間的流變學(xué)測量值，其中，通過以固定的頻率監(jiān)控凝膠化期間樣品振動模量，以機(jī)械方式確定凝膠化作用。結(jié)果顯示了3毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠和6毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠的彈性模量(G′)和粘滯模量(G″)。圖11A顯示了LS(肝基質(zhì)細(xì)胞)和小腸粘膜下層(SIS)凝膠在凝膠化期間的流變性測量值。在5％菌株和1rad/sec下測定凝膠化動力學(xué)。結(jié)果顯示了LS、SIS和UBM水凝膠在6毫克/毫升下的彈性模量(G′)。圖11B顯示了LS(肝基質(zhì)細(xì)胞)和小腸粘膜下層(SIS)凝膠在凝膠化期間的流變性測量值。在5％菌株和1rad/sec下測定凝膠化動力學(xué)。結(jié)果顯示LS、SIS和UBM水凝膠在6毫克/毫升下的儲能模量(G′)作為角頻率的函數(shù)。圖12顯示了3毫克/毫升膠原蛋白I凝膠和3毫克/毫升和6毫克/毫升膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠的頻率對動態(tài)粘度的作用。圖13A顯示了深入于膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠中的多孔肽纖維照片，其中，所述纖維不使用超聲破碎處理。條形圖度量是2000微米。圖13B顯示了深入于膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠中的多孔肽纖維照片，其中，所述纖維使用超聲破碎處理。條形圖度量是2000微米。圖14A顯示了在纖維孔中包含Ti6Al4V線的多孔金屬腳手架的SEM圖像。圖14B顯示了雜合細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)/多孔金屬腳手架的電子掃描顯微鏡圖片，其中，膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠包覆Ti6Al4V線。圖14C顯示了包含燒結(jié)的商品純鈦(CPTi)小珠的多孔金屬腳手架的SEM圖像。圖14D顯示了進(jìn)行超聲破碎之后雜合細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)/多孔金屬腳手架和CPTi小珠的ESEM圖像。圖15顯示了最終消毒后水凝膠形成的定性觀察。與未消毒的參照相比，在除去金屬環(huán)霉菌(上圖)之后，隨著最終消毒皮膚細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)形成水凝膠的能力被消除。圖16A顯示未消毒的冷凍干燥的預(yù)-凝膠。圖16B顯示未消毒的冷凍干燥的在HCl中重組的預(yù)-凝膠。圖16C顯示未消毒的冷凍干燥的在去離子水中重組的預(yù)-凝膠。圖16D顯示了用環(huán)氧乙烷消毒的冷凍干燥的預(yù)-凝膠和在水中或者HCl中重組的預(yù)凝膠。圖16B和圖16C的比較顯示，除了在HCl中消毒的樣品(圖16D)之外，其它所有樣品的重組是完整的。圖17顯示冷凍干燥的SIS-ECM預(yù)-凝膠的消毒導(dǎo)致水凝膠形成。圖18顯示冷凍干燥的膀胱基質(zhì)(UBM)預(yù)凝膠的消毒導(dǎo)致水凝膠形成。圖19A脫細(xì)胞的膀胱基質(zhì)(UBM)各種消毒方法的比較。圖19B是圖19A的定性比較。具體實施方式本申請中在指定各種范圍時所使用的數(shù)值，除非另有明確說明，僅僅是約數(shù)，比如所述范圍內(nèi)的最小值和最大值之前都冠有“約”。在這種情況下，超過或者低于所述數(shù)值范圍的微小變化數(shù)值也可以用于實現(xiàn)基本上相同的結(jié)果，這是由于這些數(shù)值也被認(rèn)為在所述范圍內(nèi)。同樣，除非另外說明，這里公開的范圍指的是一種連續(xù)的范圍，包括最大值和最小值之間的每一個值。如這里所使用，一個或者一種指的是一種或者一種以上。如這里所使用的，術(shù)語“包括(comprising)”是開放式的，并且與“包含(including)”“含有(containing)”或者“特征在于(characterizedby)”同義。術(shù)語“基本上由…組成”將權(quán)利要求的范圍限制在指定的材料或者步驟，以及那些本質(zhì)上不影響要求保護(hù)的發(fā)明的本質(zhì)和新穎特性的材料或者步驟。相反，術(shù)語“由…組成”不包括任何在權(quán)利要求中沒有特別指出的成分、步驟或者組分。如這里所使用的，實施方案“包括”一種或者一種以上所聲稱的元素或者步驟也包括，但是不局限于實施方案“基本上由”或者“由”這些所聲稱的元素或者步驟組成。這里描述了制備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的組合物的方法，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的組合物包括來自任意多種組織的溶液化的細(xì)胞外基質(zhì)。這里還描述了相關(guān)的組合物、裝置及其使用方法。這種組合物是一種反向膠，也就是說當(dāng)加熱使溫度高于組合物的低臨界溶液溫度(LCST)達(dá)到生理溫度大約37℃時，這種基質(zhì)的粘度增加。根據(jù)一個非限制性的實施方案，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的組合物在溫度低于37℃時時可注射的溶液，但是在生理溫度37℃條件下是凝膠態(tài)。根據(jù)特定的實施方案，所述凝膠具有生物活性，這是由于整個完整的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是溶液化的并且沒有被透析、交聯(lián)和/或額外處理來去除或者使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)或者功能成分失活，因此產(chǎn)生的是高度生物活性的凝膠腳手架。這里提供了制備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的水凝膠的制備原則，以及從多種組織中制備凝膠的具體方案，所述組織包括膀胱、脾臟、肝臟、心臟、胰腺、卵巢、小腸、大腸、結(jié)腸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、脂肪組織和骨骼。美國專利第8,361,503號和美國專利公開號2010-0226895號和國際專利公開號第WO2011/087743WO2013/009595號公開了反向膠細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的組合物的非限制性實施例。如這里所使用的，“最終消毒”或者“末端消毒”指的是對組合物或者裝置進(jìn)行本質(zhì)上或者實際上的完全消毒。這不包括去感染，例如，在制備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)品時作為去細(xì)胞化的一部分或者輔助操作，用過氧乙酸進(jìn)行去感染。例如，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物可以通過浸泡在0.1％(v/v)過氧乙酸(σ)、4％(v/v)乙醇和96％(v/v)去離子水中兩小時來去感染。然后用磷酸緩沖液(pH＝7.4)洗滌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物兩次15分鐘，用去離子水洗滌兩次15分鐘。盡管這也能實現(xiàn)去感染的特點，但是通常按照現(xiàn)行的操作規(guī)范這不會被認(rèn)可為一種最終消毒方法。在最終消毒過程中，產(chǎn)品被暴露于一種有效的能夠殺死存貨的微生物的過程中。在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物中，去細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料可以在增容、存儲和/或商業(yè)分裝之前進(jìn)行最終消毒。本領(lǐng)域內(nèi)已知多種最終消毒的方法，包括暴露于：環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、γ輻射、電子束輻射、氣體等離子體滅菌和超臨界二氧化碳中(參見，例如，White,A,etal.,“EffectiveTerminalSterilizationUsingSupercriticalCarbonDioxide,”(2006)J.Biotech.123(4):504-515)。本發(fā)明組合物還可以通過用戊二醛處理去感染，這回導(dǎo)致蛋白質(zhì)材料的交聯(lián)，但是這種處理本質(zhì)上改變了材料因此吸收緩慢或者完全不能被吸收，并且會激發(fā)一種不同類型的宿主重塑，這種重塑更類似于疤痕組織形成或者包裹，而不是建設(shè)性的重塑。蛋白質(zhì)材料的交聯(lián)還可以被引入到亞胺、脫水熱反應(yīng)或者光氧化反應(yīng)中。交聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料不被認(rèn)為是完整的可用于本發(fā)明應(yīng)用的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。如下面實施例中所指出的，最終消毒的時間實質(zhì)上影響了消化后的增容后的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料形成反向膠凝膠的能力。對干燥的、酸性蛋白酶-消化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物進(jìn)行消毒?！案稍铩被蛘摺案稍锏摹敝傅氖菍⒔M合物干燥或者冷凍干燥至基本上所有水份都被除去的程度，在實踐中可以意識到，不可能完全除去組合物中的所有水分子。因此“干燥”或者“干燥的”指的是水含量，例如但是不局限于，小于組合物重量的5.0、1.0、0.5、0.1、0.01、0.001或者0.0001％(％重量)?？梢允褂枚喾N方法干燥材料，比方說，例如并不限制于，通過在非破壞性溫度(例如，室溫下)下簡單蒸發(fā)，或者通過冷凍干燥(凍干)法。根據(jù)一個實施方案，這里提供了制備一種細(xì)胞外基質(zhì)-衍生的凝膠的方法。在該方法中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，例如，完整的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)被酸性蛋白酶(比如胰蛋白酶或者胃蛋白酶)在酸性溶液中消化溶解產(chǎn)生消化溶液。干燥消化溶液，例如，通過空氣干燥或者冷凍干燥。一旦溶液干燥，對其進(jìn)行最終消毒，例如，通過電子束輻射或者γ射線輻射、或者暴露于環(huán)氧乙烷氣體或者超臨界二氧化碳。所述組合物可在其干燥狀態(tài)，例如冷凍干燥狀態(tài)被存儲、分包和/或分配。然后水合消毒的材料，例如，通過溶解在水中或者水相溶液中(例如，TRIS緩沖液或者磷酸緩沖液)、或者溶解在鹽溶液(例如，氯化鈉溶液)中，例如(0.9％)鹽水中產(chǎn)生消毒的消化溶液。然后，例如，通過與離子緩沖液或者堿(例如，但不局限于NaOH)混合將消毒的消化溶液的pH值調(diào)整到7.2-7.8之間，產(chǎn)生中和的消化溶液，所得溶液在溫度大于25℃時成膠。將干燥的、消毒的組合物再水合在一種緩沖液中，例如pH為7.2-7.8的磷酸緩沖液中，可以同時完成再水合和中和步驟，如果再水合溶液的溫度在25℃以上的話，該溶液會成膠，這樣就可以將再水合、中和以及選擇性的成膠步驟結(jié)合在一起。理想的情況是將溫度維持在低于20-25℃，從而控制成膠進(jìn)程，并且使所述組合物更均勻的再水合。這里所描述的組合物可以被用作，例如但不局限于，可注射的移植物(例如，異源、異體或者自體移植物)用于需要修復(fù)或者增強(qiáng)的組織(例如，骨骼或者軟組織)中，更典型的，用于需要彌補(bǔ)創(chuàng)傷或者疾病導(dǎo)致的組織缺陷中。所述組合物還可以用作移植構(gòu)建物填充物，包括但是不局限于，形成理想形狀的鑄模構(gòu)建物，用于裝飾或者治療創(chuàng)傷的外科手術(shù)。所述組合物可以通過多種方法植入病患、人體或者動物體中。在一個非限制性實施方案中，該組合物以液體形式被注射進(jìn)入病患體內(nèi)的理想位點。如這里所使用的，術(shù)語“接種”、“種植”或者“移植”指的是向特定組合物中加入、整合、傳播或者擴(kuò)散確定體積的細(xì)胞懸浮液或者確定的細(xì)胞數(shù)。所述組合物可以是細(xì)胞預(yù)先接種的，然后優(yōu)選的使用大尺寸，例如，16號針管注射，從而防止細(xì)胞被切碎。在另一個非限制性實施方案中，所述組合物在模中成膠，并且成膠成模的產(chǎn)品被移植到病患體內(nèi)合適的位點。所述成膠成模的產(chǎn)品可以用細(xì)胞預(yù)先接種，例如，接種病患的細(xì)胞。如這里所使用的，術(shù)語“細(xì)胞外基質(zhì)”和“ECM”指的是用于細(xì)胞生長的天然腳手架，通過對多細(xì)胞有機(jī)體(例如哺乳動物和人)中發(fā)現(xiàn)的組織進(jìn)行去細(xì)胞化制備腳手架。細(xì)胞外基質(zhì)-(ECM-)可以通過，例如透滲析或者交聯(lián)進(jìn)一步加工。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是一種結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性生物分子的復(fù)雜混合物，包括但不限于：膠原蛋白、彈性蛋白、粘連蛋白、氨基多糖、含蛋白多糖、抗菌劑、趨化性細(xì)胞誘導(dǎo)因子、細(xì)胞因子和/或生長因子。在哺乳動物中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)常常包括大約90％的以各種形式存在的膠原蛋白。所述組合物和ECM的結(jié)構(gòu)根據(jù)組織來源不同而變化。例如，由于各個組織需要的獨特的細(xì)胞環(huán)境不同，小腸粘膜下層(SIS)、膀胱基質(zhì)(UBM)和肝基質(zhì)ECM在其整體結(jié)構(gòu)和組合物各方面均不相同。如這里所使用的，術(shù)語“完整的細(xì)胞外基質(zhì)”和“完整的ECM”指的是其結(jié)構(gòu)性或非結(jié)構(gòu)性生物分子保持活性的細(xì)胞外基質(zhì)，包括但不局限于，膠原蛋白、彈性蛋白、粘連蛋白、氨基多糖、含蛋白多糖、抗菌劑、趨化性細(xì)胞誘導(dǎo)因子、細(xì)胞因子和/或生長因子，例如，但不局限于這里所描述的粉碎的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)?？梢允褂没瘜W(xué)方法或者機(jī)械方法除去細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中生物分子的活性，例如，通過交聯(lián)和/或通過透析細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。完整的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)基本上沒有交聯(lián)或者沒有被透析，這意味著所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沒有經(jīng)過透滲析和/或交聯(lián)過程，或者在溶解前，沒有經(jīng)過除了儲存和處理細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)時會自然發(fā)生的過程之外的其他情況，如這里所述的。因此，本質(zhì)上交聯(lián)的和/或透析的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)(以任何方式除了那些不能基本上影響所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在這里所描述的應(yīng)用中的凝膠化作用和功能性特點的小改變方式)不被認(rèn)為是“完整的”?！吧锵嗳菪浴敝傅氖且环N裝置、腳手架、組合物等等是本質(zhì)地、實際上(用于其預(yù)計應(yīng)用時)和/或基本上對與所述裝置、腳手架、組合物等等接觸的細(xì)胞、組織、器官和/或器官系統(tǒng)無毒的、無害的或者非抑制性或者不起抑制作用的。通常，制備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的凝膠的方法需要從所關(guān)心的動物體或者所關(guān)心的器官中內(nèi)分離細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。在某些實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是從哺乳動物組織中分離的。如這里所使用的，術(shù)語“哺乳動物組織”指的是來源于哺乳動物的組織，其中，所述組織包括動物的任何細(xì)胞組分。例如但不局限于，組織可以來源于細(xì)胞的集合體，例如，器官、器官部分或者器官組合。在某些實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)來源于脊椎動物，例如，但不局限于，人、猴子、豬、家牛和羊。在某些實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)來源于動物的任何組織的，例如但不局限于：膀胱、肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、脂肪組織、小腸、大腸、結(jié)腸、食管、胰腺、真皮和心臟。在一個實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)來自膀胱。所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可能包括或者可能不包括細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的基膜部分。在某些實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包括至少一部分所述基膜。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可能保持或者可能不保持一些包括原始組織的細(xì)胞分子，例如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或者纖維細(xì)胞。如這里所使用的，術(shù)語“衍生于”及其相關(guān)的其他文字形式，例如，但是不局限于“來源于”、“衍生物”指的是通過任意有效的方法從任意所述來源處獲得的一種組分或者一些組分。例如，但是不局限于，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的凝膠指的是由通過使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種適合分離細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的方法從任意組織處獲得的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組分所組成的凝膠。在另一個實施例中，哺乳動物組織-衍生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)指的是由哺乳動物組織的組分所組成的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，其中所述哺乳動物組織是通過任何有效的方法獲得的。在分離所關(guān)心的組織之后，通過各種方法進(jìn)行去細(xì)胞化，例如但是不局限于，暴露在高滲鹽水中、過乙酸中、Triton-X中或者其他清潔劑中。然后，干燥或者冷凍干燥(凍干)或者風(fēng)干去細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。通過一些方法可以粉碎干燥的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，所述方法包括但不限于，撕裂、碾壓、切割、磨碎、和剪切。被粉碎的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)還可以通過一些方法被進(jìn)一步加工成粉末狀，所述方法包括但是不局限于，例如，磨碎或者壓碎凍結(jié)或者凍結(jié)干燥狀態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。如這里所使用的，術(shù)語“粉碎”及該字的任何形式或者同義詞，例如，但不局限于“粉末”和“制粉”值得是將大顆粒加工成小顆粒的過程，包括但是不局限于通過磨碎、摻雜、撕碎、切斷、壓碎、切割、切細(xì)等方法。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可以粉碎的，雖然不局限于任何形式，包括但是不局限于，水合式、凍結(jié)式、風(fēng)干式、冷凍干燥式、粉末或者片式。為了制備溶液化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織，用在酸性溶液中的酸性蛋白酶消化粉碎的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，形成消化溶液。如這里所使用的，術(shù)語“酸性蛋白酶”指的是能夠裂解肽鍵的酶，其中，所述酶可以在酸性pH值下增加裂解肽鍵的能力。例如但不局限于，酸性蛋白酶可以包括胃蛋白酶和胰蛋白酶。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的消化液通常在室溫下持續(xù)攪拌一段時間。所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)消化液可以被立即使用或者在-20℃下存儲，或者在例如但是不局限于-20℃或者-80℃條件下冷凍，被用于這里所描述的方法和組合物中，被干燥并消毒。隨后，所述消化液的pH值被升高到7.2-7.8之間，產(chǎn)生中和的消化液?？梢酝ㄟ^加入一種或者一種以上的堿或者等滲緩沖溶液升高pH值，例如但是不局限于，NaOH或者pH值為7.4的磷酸緩沖液。這些方法通常不包括凝膠化之前的透析步驟，產(chǎn)生更完整的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-樣基質(zhì)，該基質(zhì)在37℃下比可比較的膠原蛋白或者透析過的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)制劑更緩慢的成膠。因此，所述凝膠更易于注入病人體內(nèi)，并且由于保持了許多天然可溶性因子(例如，但是不局限于，細(xì)胞因子)而維持更多質(zhì)量的天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。從各種組織制備的未透析(全細(xì)胞外基質(zhì)(ECM))制劑生成一種其動力學(xué)適用于成模成膠或者原位成膠應(yīng)用的凝膠的能力是出乎意料的。如這里所使用的，術(shù)語“等滲緩沖液”指的是一種能夠?qū)⑷芤旱膒H值緩沖到7.2到7.8之間的等滲溶液，并且這種等滲溶液具有平衡的鹽濃度從而促進(jìn)等滲環(huán)境。如這里所使用的，所述術(shù)語“堿”指的是pH值大于7的任何化合物或者化合物的溶液。例如，但是不局限于，所述堿是堿性氫氧化物或者堿性氫氧化物的水溶液。在某些實施方案中，所述堿是NaOH或者在磷酸緩沖液中的NaOH。中和的消化液可以在合適的溫暖氣溫下培養(yǎng)，例如，但是不局限于，在大約37℃下培養(yǎng)成膠。所述中和的消化液可以在，例如但是不局限于，-20℃或者-80℃的條件下冷凍并存儲。如這里所使用的，術(shù)語“中和的消化液”或者“中和的消化物”指的是其中pH值增加的消化物或者消化液，可以以溶液或者干燥組合物的形式存在。例如但是不局限于，中和的消化物的pH值在7.2到7.8之間。這里所描述的方法、組合物和裝置可以使用任何種類的細(xì)胞外基質(zhì)組織(通常參見，美國專利號4,902,508；4,956,178；5,281,422；5,352,463；5,372,821；5,554,389；5,573,784；5,645,860；5,711,969；5,753,267；5,762,966；5,866,414；6,099,567；6,485,723；6,576,265；6,579,538；6,696,270；6,783,776；6,793,939；6,849,273；6,852,339；6,861,074；6,887,495；6,890,562；6,890,563；6,890,564；和6,893,666),只是所述材料不是最終消毒的。在某些實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)來源于脊椎動物，例如，但不局限于，來源于熱血的哺乳脊椎動物，包括但不限于，人、猴子、豬、母牛和羊。所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可以來源于任何器官或者組織，包括但是不局限于，膀胱、腸、肝、食管和皮膚。在一個實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分離自膀胱。在另一個實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分離自腸，或者腸的一部分。所述腸從幽門括約肌伸出，延伸至肛門，并且包括：小腸，從幽門瓣伸出延伸至回盲瓣；大腸，從回盲瓣伸出；及其他部分，包括十二指腸；空腸；回腸；盲腸；附件；升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸；直腸和/或肛管(參見，例如，Marieb,EN,HumanAnatomyandPhysiology,第二版,1992,Benjamin/Cummings印刷有限公司，Redwood城，加利福尼亞州，第792,793,802,和803頁).所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可能包括或者可能不包括細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的基膜部分。在某些實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包括至少一部分所述基膜。能用于腳手架中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的種類可以根據(jù)傷口愈合時或者組織再生時需要募集的細(xì)胞類型、被替換的組織器官的天然組織結(jié)構(gòu)、來源于組織的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的有效性或其他影響最后腳手架質(zhì)量和制備腳手架可能性的因素而變化。例如但是不局限于，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可以包含基膜表面和非-基膜表面，這可以有效用于促進(jìn)組織再造，所述組織例如，膀胱、食管或者血管，這些組織都有基膜部分和非-基膜部分。在一個非限制性實施方案中，從豬膀胱中收獲細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)(也被稱作膀胱基質(zhì)或者UBM)。簡單的說，通過從豬中取出膀胱組織并修整剩余的外部結(jié)締組織(包括脂肪組織)來制備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。通過重復(fù)用自來水洗滌去掉殘余尿液。首先將所述組織浸泡在真皮生長溶液(例如但是不局限于，高滲鹽水(例如1.0N鹽水)中10分鐘到四小時，使組織分層。與高滲鹽水溶液的接觸從基膜下層除去所述上皮細(xì)胞。選擇性地，可以向所述鹽溶液中加入鈣螯合劑。經(jīng)過最初分層過程處理后剩余的組織包括上皮細(xì)胞基膜和與所述上皮細(xì)胞基膜連接的管腔組織層。隨后，該組織進(jìn)一步被處理去掉大部分管腔組織但是維持上皮細(xì)胞基膜和固有膜。通過機(jī)械磨蝕或者通過酶組合物的處理(例如，使用胰蛋白酶或者膠原酶)，隨后進(jìn)行水合作用和磨蝕，從剩余的真皮組織中除掉外漿膜、外膜、肌膜粘膜、粘膜下層和大部分粘膜肌層。在機(jī)械法除去這些組織的同時伴隨著系膜組織的去除，例如但是不局限于，使用Adson-Brown鑷子和Metzenbaum剪刀，并使用縱向擦抹動作，用解剖刀處理或者其他包裹在濕紗布中的剛性物體擦去肌膜和粘膜下層。本發(fā)明還包括自動機(jī)器處理法，包括切削片、激光及其他組織分離方法。在去掉這些組織之后，產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)主要有上皮細(xì)胞基膜和下層固有膜組成(圖3的層B和層C)。在另一個實施方案中，通過用解剖刀和濕紗布進(jìn)行縱向摩擦動作磨擦豬膀胱組織去掉包括漿膜層和肌膜的外層(圖3中的層G和層F)制備所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。在反轉(zhuǎn)組織片段之后，使用相同的擦抹動作使下層組織中粘膜的腔部分(圖3中的層H)被分層。小心不要使粘膜下層穿孔(圖3的層E)。在去掉這些組織之后，產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)主要由所述粘膜下層組成(圖3的層E)。許多細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)制劑是市場上可買到的，可以通過多種方法制備。市場上可買到的小腸粘膜下層(SIS)制劑包括，但是不局限于，SurgisisTM,Surgisis-ESTM,StratasisTM和Stratasis-ESTM(CookUrological公司；印第安納波利斯，印地安那州)和GraftPatchTM(Organogenesis公司；麻薩諸塞州)。市場上可買到的皮膚制劑包括，但是不局限于，(在歐洲以的名稱出售；Bard，科靈頓，喬治亞州)，(Microvasive公司；波士頓，麻薩諸塞州)和(LifeCell公司；Branchburg，新澤西州)。市場上可買到的膀胱制劑包括，但是不局限于UBM(Acell公司；Jessup，馬里蘭州)。這些細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)制劑的任何一種都可以沒有最終消毒的形式被提供，因此可以是適合于這里所描述的方法和組合物的前體。這里所描述的組合物可以被用于多種方法或者形式中。例如但是不局限于，根據(jù)第一實施方案，所述中和消化物放置于適當(dāng)?shù)哪＞咧行纬善鞴倩蛘咂鞴俚囊徊糠?。作為一種非限制性的實施例，所述組合物在模具中形成肝的一部分，從而促進(jìn)肝組織的再生。在另一個非限制性實施例中，所述組合物在模具中形成鼻子的形狀或者耳朵軟骨的形狀，或其一部分，適用于替換損傷或者刪除的軟骨組織。在依舊另一個非限制性實施例中，所述組合物在模具中形成傷口形狀，促進(jìn)組織的非疤痕性愈合。為了制備成模的凝膠，中和的消化物被放置在生物相容性的并且優(yōu)選的無菌模具中，例如，塑料膜中，并且在一定溫度下培養(yǎng)合適的時間使組合物進(jìn)行凝膠化，例如但是不局限于在大約37℃條件下。在一個實施方案中，37℃下所述組合物和模具放置在培養(yǎng)箱中成膠。由于二氧化碳已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能夠減緩凝膠化的過程，在一個非限制性實施方案中，不將二氧化碳注入所述培養(yǎng)器中，但是在依舊另一個實施方案中，二氧化碳和溫度被用于控制凝膠化過程。在凝膠化或者擴(kuò)散、吸收和/或通過成膠后的凝膠吸附之前，任何有效的細(xì)胞因子、趨化性細(xì)胞誘導(dǎo)因子或者細(xì)胞可以與組合物相混合。例如但是不局限于，有用的組分包括生長因子、干擾素、白介素、趨化因子、單核因子、激素、拮抗因子、藥物和抗生素。細(xì)胞可以被混合物中和的、溶液化的凝膠中或者一旦成膠，可以被放置在成模組合物中。在每種情況下，當(dāng)凝膠中被接種上細(xì)胞時，通過在生物反應(yīng)器或者培養(yǎng)器中合適的介質(zhì)上培養(yǎng)適當(dāng)時間，所述細(xì)胞可以生長和/或沿著成模的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠壁生長，從而最佳制備或者有利的制備適用于在病人中抑制的組合物?？梢韵虺赡５慕M合物中接種細(xì)胞，從而促進(jìn)內(nèi)部生長、分化作用和/或細(xì)胞的適應(yīng)性。例如但是不局限于，所述細(xì)胞可以是自體細(xì)胞或者相對于接受包括所述凝膠的組合物/裝置的病人來講的異源細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是干細(xì)胞或者其他祖細(xì)胞，或者分化細(xì)胞。在一個實施例中，從病人處獲得的皮膚層被接種在模具上，用于恢復(fù)皮膚損傷和/或延伸與組織下部。如這里所使用的，術(shù)語“模具”指的是用于使凝膠形成三維性質(zhì)的腔或者表面。例如但是不局限于，所述模具可以是平皿、細(xì)胞培養(yǎng)盤或者管，或者可以被塑形成任何有用的形狀。在某一實施方案中，所述模具可以被塑形成某一器官或者器官的一部分的形狀。凝膠可以通過多種方法傳遞到模具中，包括但不限于，注入、沉淀。如這里所使用的，術(shù)語“藥物”和“藥物們”指的是任何具有預(yù)防或者治療作用的組合物，包括但是不限制于，抗生素、肽、激素、有機(jī)分子、維生素、補(bǔ)充物、因子、蛋白質(zhì)和趨化性細(xì)胞誘導(dǎo)因子。如這里所使用的，術(shù)語“細(xì)胞”或者“細(xì)胞群”值得是任意種類的來自任意動物的細(xì)胞，例如，但是不局限于，大鼠、小鼠、猴子和人。例如但是不局限于，所述細(xì)胞可以是祖細(xì)胞，例如干細(xì)胞或者分化細(xì)胞，例如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。在某些實施方案中，用于醫(yī)療過程的細(xì)胞可以來自于病人，用于自體過程，或者來源于其他供體，適合于異源過程。使用預(yù)成模組織的一個好處是可以產(chǎn)生層狀組合物。例如，使用來自第一來源的第一細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠制備待移植組合物的核心部分，包覆層可以含有來自第二來源的第二細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠，所述第二來源與第一來源不同，或者與第一來源相同但是包括不同成分，例如細(xì)胞因子或者細(xì)胞。在預(yù)成模組合物的另一個實施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)被包括在非粉碎性和未消化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織(例如，小腸粘膜下層(SIS)或者膀胱基質(zhì)(UBM))片狀的套中，從而增加凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。在這些實施方案中，在用溶液化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織充滿模具之前，使用本領(lǐng)域已知方式制備的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織的各個層可以被放置在模具中，用于產(chǎn)生凝膠。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組織的各個層可以被用作模具，只要他們之間形成并縫合或者交聯(lián)成需要的形狀。以這種方式，可以產(chǎn)生比只有凝膠的情況具有更大機(jī)械強(qiáng)度的固體組合物。在另一個非限制性實施方案中，所述組合物作為一種中和的消化液被注入病人體內(nèi)。所述組合物被注射入病人體內(nèi)需要基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞生長的位點。例如但是不局限于，當(dāng)病人由于外傷必須去掉組織、清創(chuàng)術(shù)和/或除去損傷的、患病的或者癌性組織時，所述組合物可以被注射進(jìn)入除去組織的位點從而促進(jìn)組織內(nèi)部生長。通過改變制備預(yù)凝膠所使用的水的量(例如，通過改變水、酸、堿、緩沖液(例如磷酸緩沖液)或者其他稀釋劑的量)來控制預(yù)凝膠的粘度。在使用小規(guī)格針頭的應(yīng)用中，例如在內(nèi)窺鏡檢查時，需要使用粘度更小的預(yù)凝膠，這通常會導(dǎo)致粘度更小的凝膠，一旦形成預(yù)凝膠的話。在使用大規(guī)格針頭的應(yīng)用中，可以使用粘度更高的凝膠，當(dāng)成膠時具有更高的強(qiáng)度。同樣，使用更大規(guī)格的針頭時，不管預(yù)凝膠的粘度怎樣，最好在移植前立刻將預(yù)凝膠與活細(xì)胞相混合，降低切碎細(xì)胞的風(fēng)險。在一個實施方案中，通過增加酸性消化液的pH值制備中和消化液，并在發(fā)生明顯的凝膠化作用之前將所述組合物直接注射入病人體內(nèi)。在一個實施方案中，所述組合物處于凍結(jié)狀態(tài)并在注入之前解凍并升溫。在另一個實施方案中，所述酸性消化液被加熱到生理溫度并在注射期間在靜態(tài)混合器中與大量堿和/或緩沖液(例如磷酸緩沖液)混合。適當(dāng)?shù)撵o態(tài)混合器包括但是不局限于，螺旋狀或者正方形的靜態(tài)混合器，可以從加拿大安大略省科伯格Cammda公司商業(yè)購得，或者具有微靜態(tài)混合器的微二重注射器，可以從康泊狄格諾維斯的Plas-Pak工業(yè)公司商業(yè)購得。在進(jìn)一步的實施方案中，提供了可市售的試劑盒，包括這里所描述的組合物。試劑盒包括適當(dāng)?shù)陌b材料和所述組合物。在一個非限制性實施方案中，所述試劑盒在容器中包括消化液，這可以是被包裝的，或者可以包含在包裝中。在這些實施方案中，如果所述消化液是中和的，她可以被冷凍、冷卻；例如，在接近冷凍溫度下儲存，例如，但是不局限于，低于大約4℃或者在室溫下儲存，例如，20-25℃。在另一個非限制性實施方案中，所述試劑盒包括第一容器，第一容器包含一種酸性溶液，所述酸性溶液包括這里所描述的預(yù)中和的消化物，并且，所述試劑盒還包括一種第二容器，第二容器包括中和溶液，所述中和溶液中包括堿和/或緩沖劑(多種)，從而使第一容器中的酸性溶液回到生理學(xué)離子強(qiáng)度和pH，生成中和的消化物。在進(jìn)一步的實施方案中，第一容器包含最終消毒的、冷凍干燥的、預(yù)中和的消化物，這種消化物可以用水或者能夠選擇性的中和酸的適當(dāng)?shù)乃芤核稀Ｔ诖藢嵤┓桨钢?，選擇性的提供一種第二容器，其中包括如上所述的中和溶液，既能夠水合凍干產(chǎn)品也能夠中和她，或者選擇性的提供一種第三容器，其中包括水或者其他能夠在使用中和溶液中和前有效水合所述凍干產(chǎn)品的適當(dāng)?shù)娜芤骸Ｔ撛噭┖羞€選擇性的包括混合針和/或冷卻包裝。所述容器可以是小瓶、注射器、管或者任何其他適合在商業(yè)分銷途徑中貯存和傳遞所述試劑盒的容器。在所述試劑盒依舊另一個實施方案中，凝膠組合物成模并在包裝和分配之前預(yù)成膠。在一個實施方案中，成模的凝膠被包裝在氣泡包裝中，包括塑料容器和一種紙質(zhì)、塑料和/或薄箔密封的部分，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。模具和包裝通常在包裝之前或者之后消毒，例如但是不局限于，通過γ或者電子束照射或者超臨界的二氧化碳消毒。所述成模的組合物可以被包裝在任意合適的生理溶液中，例如，磷酸緩沖液或者鹽水。如果成模的凝膠包含活細(xì)胞，則所述模具可以通過密封的廣口瓶或者其他容器運輸?shù)揭环N適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中。當(dāng)然，包含細(xì)胞的成模凝膠以一種加快保存細(xì)胞的方式運輸。如這里所使用的，術(shù)語“雜合無機(jī)/細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)腳手架”指的是包覆在生物相容性無機(jī)結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的凝膠，所述生物相容性無機(jī)結(jié)構(gòu)例如，但是不局限于，一種金屬、一種無機(jī)鈣化合物(例如氫氧化鈣，磷酸鈣或者碳酸鈣)或者一種陶瓷組合物。在一個實施方案中，使用超聲作用來給無機(jī)結(jié)構(gòu)包覆上細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生的凝膠。如這里所使用的，術(shù)語“超聲作用”指的是暴露于拼讀高于15千赫茲并低于400千赫茲的超聲波中。如這里所使用的，術(shù)語“包覆”及其同義詞例如“涂布”和“包裹”指的是一種過程，這一過程包括用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生的凝膠或者雜合無機(jī)/細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)腳手架覆蓋無機(jī)結(jié)構(gòu)。例如但是不局限于，用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)-衍生的凝膠包覆無機(jī)結(jié)構(gòu)可以包括倒、裝入、分層、浸泡、噴霧等方法。在這里所描述的技術(shù)的另一個實施方案中，所述組合物被包覆在一種生物相容性結(jié)構(gòu)材料上，所述生物相容性結(jié)構(gòu)材料例如金屬、無機(jī)鈣化合物(例如氫氧化鈣、磷酸鈣或者碳酸鈣)或者陶瓷組合物。適當(dāng)?shù)慕饘俚姆窍拗菩詫嵤├氢掋t合金、不銹鋼、鈦合金、鉭合金、鈦-鉭合金，其可以包括非金屬成分和金屬成份，例如鉬、鉭、鈮、鋯、鐵、錳、鉻、鈷、鎳、鋁和鑭，包括但不局限于，各種等級的CPTi(商品純鈦)或者Ti6Al4V(90％重量Ti、6％重量鋁和4％重量釩)、不銹鋼316、鎳鈦金屬互化物(鎳鈦合金)、鍍有羥基磷灰石的鈦合金。由于金屬的高強(qiáng)度、柔韌性和生物適應(yīng)性，金屬是有效的。金屬還可以形成各種復(fù)雜的形狀并且許多金屬能夠經(jīng)受生物環(huán)境的腐蝕，減少磨損，并且不會對組織造成損傷。在一個非限制性實施例中，所述金屬是股骨或者髖臼組分，用于臀部修復(fù)。在另一個實施例中，所述金屬是纖維或者其他突起，用于永久附著于病人的修復(fù)體上。其他組合物，包括陶瓷、鈣化合物，例如，但是不局限于碳酸鈣，可以是優(yōu)選的，例如但是不局限于，用在骨骼或者牙齒結(jié)構(gòu)的修復(fù)或者再塑形中。金屬、陶瓷和/或其他材料的組合也被證明是有效的。例如，臀部置換物的金屬股骨部分可以包括陶瓷球和/或可以包括包覆在球表面的塑料，作為髖臼部分。金屬及其他合適的材料可以以其不同的形式被使用，包括但是不局限于線狀、薄片、小珠、棒狀和粉末狀，包括納米晶體粉末。組合物和金屬或其他材料的表面還可以被改變來保護(hù)生物相容性，例如，通過硅烷處理使表面鈍化、包覆生物相容性塑料或者陶瓷、復(fù)合金屬/陶瓷材料。這里所使用的材料和方法是本發(fā)明所述領(lǐng)域已知的。使用金屬插入物修復(fù)病人骨骼結(jié)構(gòu)的一個難題是插入物必須錨定/附著于現(xiàn)存的骨骼部分。傳統(tǒng)方法使用粘合劑和/或螺旋釘。就修復(fù)體而言，修復(fù)體一般不與病人組織相連，除非，通常使用粘合劑粘合。因此，理想的情況是使醫(yī)療裝置生物附著在病人組織上。這可以通過使用這里所描述的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠包覆移植物表面來實現(xiàn)，這里所描述的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠能夠促進(jìn)組織的內(nèi)生長，因此附著所述裝置。多種多孔結(jié)構(gòu)可以附著在移植物上，產(chǎn)生腳手架，在此腳手架中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠和隨后的細(xì)胞或其他組織(例如，骨骼)可以滲透進(jìn)入其中。這些結(jié)構(gòu)包括，但是不局限于，編織的網(wǎng)孔或者非編織的網(wǎng)孔、海綿樣的多孔材料、融合小珠，等等。多孔腳手架會促進(jìn)活組織之間的有力連接，包括骨骼和該裝置之間。多孔腳手架的“孔”可以是任意能夠允許細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠滲入的尺寸，選擇性的，通過巢式或者其他幫助凝膠和隨后的細(xì)胞或其他生物材料(例如，骨骼、軟骨、腱、韌帶、筋膜或者其他結(jié)締組織)滲入腳手架的方式處理來促進(jìn)滲入。在一個實施方案中，金屬絲附著于所述裝置上并且所述金屬絲表面包覆有這里所描述的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠，從而允許組織在纖維內(nèi)的內(nèi)生長。在第二實施方案中，小珠基質(zhì)被焊接或者附著于裝置表面，這里所描述的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠包覆在小珠基質(zhì)上，促進(jìn)組織在小珠間的內(nèi)生長。在一個實施例中，包含纖維突起的裝置可以插入骨骼內(nèi)部，允許金屬絲與骨骼的融合。在一個實施方案中，在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠上接種適當(dāng)?shù)募?xì)胞群(例如載體成骨細(xì)胞)并培養(yǎng)，促進(jìn)骨骼生長。在另一個實施方案中，雜合無機(jī)/細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)腳手架還可以用來包覆其他結(jié)構(gòu)移植物，例如但不局限于，股骨移植物、手義肢。圖1顯示了在臀部置換過程中被插入到股骨15中的裝置10的一個實施方案。圖1顯示了裝置10，表明了適合于插入股骨15的插入部分20，和可以螺絲固定或插入小球(未顯示)的擴(kuò)充部分25.裝置10包括多孔涂層30，例如但是不局限于焊接在裝置10上的金屬珠的多孔涂層。圖1中的區(qū)域A顯示了裝置10的涂層30的放大的視窗。小珠32被焊接在裝置10的金屬表面34上。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠36被涂布在小珠32上或者小珠32之間。通過細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠36的存在促進(jìn)骨骼組織向小珠32的生長。義肢需要錨定到骨頭上，以使用具有多孔涂層插入物類似的方式，多孔涂層延長附著到病人組織所需要的限制。舉例來說，如圖2所示，手部義肢100包括外部分115和內(nèi)部分120，其中包括徑向插入部分122和尺骨插入部分124。多孔涂層130從插入部分122和124中延伸出來，附著到骨頭上，從外部分115開始，允許皮膚以及骨骼和皮膚之間的中間組織附著。這里所描述的裝置(例如，義肢)可以被中和的預(yù)凝膠涂布，并且隨后將凝膠溫度升高產(chǎn)生中和的預(yù)凝膠和凝膠。在另一個實施方案中，所述酸性預(yù)凝膠被用于裝置或者義肢。然后可以干燥裝置上的預(yù)凝膠，例如，冷凍干燥，并對整個裝置進(jìn)行最終消毒，隨后包裝并分配。裝置上的冷凍干燥產(chǎn)品可以被最終的用戶水合，并向裝置使用水、鹽水或者磷酸緩沖液中和，隨后或者同時升高裝置的溫度至，例如，高于37℃。在使用時，表面徒步游適當(dāng)?shù)哪_手架和這里所描述的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠的裝置可以與細(xì)胞相接觸，例如，與病人或者異源細(xì)胞相接觸，并且所述細(xì)胞被允許滲透入基質(zhì)中。細(xì)胞的內(nèi)生長或者細(xì)胞深入可以在體內(nèi)或者體外發(fā)生，取決于最優(yōu)的使用方法。例如但是不局限于，就股骨移植物來講，所述移植物可以被插入股骨中，病人的細(xì)胞、理想的骨骼組織會滲入腳手架將裝置與骨骼相融合。在另一個實施方案中，例如，對于人工腱或者韌帶，病人腱或者韌帶的活體解剖物與適當(dāng)?shù)哪_手架一起培養(yǎng)，從而產(chǎn)生自體韌帶或者腱移植物。實施例實施例1-豬細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)(膀胱基質(zhì)(UBM))的制備之前已經(jīng)描述了膀胱基質(zhì)(UBM)的制備[SarikayaA,etal.TissueEng.2002Feb；8(1):63-71；RingelRL,etal.JSpeechLangHearRes.2006Feb；49(1):194-208].簡單地說，從6個月大的體重在108-118千克的豬(Whiteshire-Hamroc，IN)中收獲豬膀胱，隨后立即使其安樂死。從絨膜表面除去結(jié)締組織和脂肪組織，然后重復(fù)用自來水洗滌除掉殘余尿液。機(jī)械除去漿膜層、肌膜外膜、粘膜下層和大多數(shù)肌膜粘膜。在1.0N鹽溶液中浸泡組織，隔開腔表面，分離粘膜的泌尿道上皮細(xì)胞，產(chǎn)生由基膜加下層固有膜所組成的生物材料，這被認(rèn)為是膀胱基質(zhì)(UBM)。圖3顯示了膀胱壁的剖面圖以及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在振蕩器上，在包含0.1％(體積/體積)過乙酸、4％(體積/體積)乙醇和95.9％(體積/體積)無菌水溶液中消毒膀胱基質(zhì)(UBM)層。使用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(pH＝7.4)洗滌兩邊，每次15分鐘，并用無菌水洗滌兩次，每次15分鐘，除去過乙酸殘基。然后使用FTS系統(tǒng)批量冰凍干燥器型號8-54冷凍干燥(圖4B)膀胱基質(zhì)(UBM)片(如圖4A所示)，并使用Wiley小型粉碎器制粉。將1克冷凍干燥的膀胱基質(zhì)(UBM)粉末(圖4B)和100毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入100毫升的0.01MHCl中。在室溫下(25℃)持續(xù)攪拌溶液48小時。在胃蛋白酶消化之后，消化液(圖4C)分部分儲存在-20℃下，直到使用時。完成后，所述溶液被認(rèn)為是消化液或者細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)消化物或者細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)儲備溶液。實施例2-豬脾細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備獲得新鮮的脾組織。切除外層脾膜，然后剩余組織被切成均勻的塊。修整外膜的殘余物，然后在水中漂洗三次。通過使用篩網(wǎng)除去水中菌株。通過按摩溶解脾細(xì)胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培養(yǎng)脾切片1小時。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解脾細(xì)胞。在洗滌之后，用3％TritonX-100溶液中吸收切片并在振蕩器上放置1小時。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解脾細(xì)胞。然后將切片在4％脫氧膽酸溶液中吸收，并放置在振蕩器上1小時。徹底清洗之后，保存純化的脾細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)用于進(jìn)一步處理。這些組織隨后用過乙酸處理消毒，并干燥。將1克干燥的豬脾細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入100毫升的0.01MHCl中。在室溫下(25℃)持續(xù)攪拌溶液72小時。如果在溶液中沒有明顯的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)碎片浮動的話，將樣品分部分并冷凍(-20℃)或者立即使用。實施例3-豬肝基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備獲得新鮮的肝組織。修整多余的脂肪和組織。切除外層肝膜，然后剩余組織被切成均勻的塊。用解剖刀或者刀片修整外膜的殘余物，然后在水中漂洗三次。通過使用篩網(wǎng)除去水中菌株。通過按摩溶解細(xì)胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培養(yǎng)肝切片1小時。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解細(xì)胞。在洗滌之后，用3％TritonX-100溶液中吸收切片并在振蕩器上放置1小時。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解細(xì)胞。然后將切片在4％脫氧膽酸溶液中吸收，并放置在振蕩器上1小時。徹底清洗之后，將肝基質(zhì)保存在去離子水中用于進(jìn)一步處理。這些組織隨后用過乙酸處理消毒，并干燥。將1克干燥的豬肝基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入100毫升的0.01MHCl中。持續(xù)攪拌溶液24-48小時，在室溫下(25℃)。如果在溶液中沒有明顯的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)碎片浮動的話，將樣品分部分并冷凍(-20℃)或者立即使用。實施例4-人肝基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備獲得新鮮的肝組織。修整多余的脂肪和組織。切除外層肝膜，然后剩余組織被切成均勻的塊。用解剖刀或者刀片修整外膜的殘余物，然后在水中漂洗三次。通過使用篩網(wǎng)除去水中菌株。通過按摩溶解細(xì)胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培養(yǎng)肝切片1小時。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解細(xì)胞。在洗滌之后，用3％TritonX-100溶液中吸收切片并在振蕩器上放置1小時。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解細(xì)胞。然后將切片在4％脫氧膽酸溶液中吸收，并放置在振蕩器上1小時。徹底清洗之后，將肝基質(zhì)保存在去離子水中用于進(jìn)一步處理。這些組織隨后用過乙酸處理消毒，并干燥。將1克干燥的人肝基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和200毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入500毫升的0.01MHCl中。在室溫下(25℃)持續(xù)攪拌溶液3-5天。所述溶液需要每天監(jiān)控。如果在溶液中沒有明顯的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)碎片浮動的話，將樣品分部分并冷凍(-20℃)或者立即使用。實施例5-豬心細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備將1克干燥的豬心的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入50毫升的0.01MHCl中。在室溫下(25℃)持續(xù)攪拌溶液48小時。實施例6-豬胰腺細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備將1克干燥的去脂肪的豬胰腺細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入50毫升的0.01MHCl中。在室溫下(25℃)持續(xù)攪拌溶液48小時。實施例7-豬卵巢細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備在6小時內(nèi)收獲新鮮的卵巢組織。除去卵巢并在生理鹽水中保存組織，直到可以用于解剖，并且除掉剩余的子宮組織?？v切穿過卵巢門臍，使卵泡囊分離。一旦所有的卵泡囊都被分離，則從所述卵巢中收獲細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。在過濾后的水中漂洗三遍并用濾網(wǎng)給水除菌。通過輕柔按摩溶解細(xì)胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)1小時然后洗滌。如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解細(xì)胞。用3％TritonX-100溶液中吸收細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)并在振蕩器上放置1小時。漂清之后，如果需要的話，通過按摩進(jìn)一步地溶解細(xì)胞。然后將切片在4％脫氧膽酸溶液中吸收，并放置在振蕩器上1小時。在徹底漂清去掉剩余的表面活性劑以后，所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)被保存在無菌的/過濾水中直到進(jìn)一步地使用。這些組織隨后用過乙酸處理消毒，并干燥。將1克冷凍干燥的卵巢細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)粉末和100毫克胃蛋白酶混合進(jìn)入100毫升的0.01MHCl中。在室溫下(25℃)持續(xù)攪拌溶液48小時。在胃蛋白酶消化之后，消化液分部分儲存在-20℃下，直到使用時。實施例8:脊髓和硬膜細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備使用鑷子、剪刀和解剖刀，從豬脊髓中去掉硬膜。用解剖刀刀刃弄碎硬膜內(nèi)表面除去所有碎片。將脊髓和硬膜處在不同的容器中并用如下相同的方法處理。橫切或者縱切脊髓來增加表面積，然后放置在暗盒中。選擇性的，在37℃下，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸酶催化處理組織30分鐘。在4℃下，在TritonX-100TM(4-辛苯酚多聚羥乙基酸)溶液中以3％的濃度培養(yǎng)組織2-3天。在6％的TritonX-100TM溶液中重復(fù)這一步驟，然后在9％的TritonX-100TM溶液中再次重復(fù)這一步驟。在4℃下，在卵磷脂或者卵磷脂-脫氧膽酸鹽中培養(yǎng)脊髓組織整夜，去掉脂質(zhì)。硬膜不受該過程的影響。然后在3％的TritonX-100TM或者1％的SDS中洗滌組織1-2小時在室溫下，在磷酸緩沖液中洗滌3次每次15分鐘。然后在室溫下在DNaseI溶液中培養(yǎng)組織1小時。在室溫下，在磷酸緩沖液中洗滌組織3次每次15分鐘。最后，在室溫下，在去離子水中洗滌組織3次每次15分鐘。該過程產(chǎn)生膠狀的非細(xì)胞性脊髓材料，和非細(xì)胞性硬膜材料片。實施例9–脂肪細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備在水中解凍冷凍的脂肪組織并進(jìn)行人工按摩，加速細(xì)胞溶解。將組織放置在包含0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液的燒瓶中并在37℃下培養(yǎng)1小時，然后在蒸餾的去離子水(ddH2O)中簡單的漂洗，并再次人工按摩。然后將組織放置在包含3％TritonX-100的燒瓶中，并在室溫下放置在軌道振蕩器上1小時。在簡單水洗之后，將組織放置在4％的脫氧膽酸溶液中，并再次防止在軌道振蕩器下在室溫中處理1小時。在水中洗滌組織三次，并在4℃下存儲整夜。然后在軌道振蕩器上用4％乙醇和0.1％過乙酸溶液處理組織2小時，隨后在室溫下用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)洗滌兩次并用水洗滌兩次，每次15分鐘。然后在軌道振蕩器上，在室溫下用100％正丙醇洗滌所得材料1小時，并在四份ddH2O中洗滌1小時，除去正丙醇，然后進(jìn)行冷凍干燥。實施例10–神經(jīng)-衍生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠的制備在-80℃下存儲鼠脊髓組織直到用于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生物加工。解凍材料并除掉脊髓上的影魔，然后縱向?qū)⒓顾枨谐砷L度大約在1英尺并具有均勻厚度的直柱。4℃下將脊髓塊放置在水中整夜，并在去細(xì)胞化之前，在120轉(zhuǎn)/分下機(jī)械破除天然組織結(jié)構(gòu)。18小時之后，通過使用孔徑大約840微米的網(wǎng)孔或者篩網(wǎng)過濾將脊髓塊從水中除去。用鑷子收集脊髓片，并放入燒瓶中使用0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液進(jìn)行蛋白酶消化。將消化物在37℃下水浴1小時，同時以120轉(zhuǎn)/分的速度搖動。在一個小時以后，溶解所得溶液并在水流下輕輕的沖洗脊髓組織，按規(guī)定梳理。重新將脊髓塊放置回?zé)?，用鑷子從過濾器中收集盡可能多的小組織塊。然后向燒瓶中加入3％的TritonX-100溶液，開始對組織進(jìn)行去細(xì)胞化，將其放置在振蕩器中在200轉(zhuǎn)/分下處理1小時。一小時后，將所得組織除菌、漂洗并收集。將組織塊放回?zé)恐?，然后進(jìn)行滲透壓震蕩進(jìn)行進(jìn)一步去細(xì)胞作用。向燒瓶中加入高滲的1M蔗糖并放置在振蕩器上200轉(zhuǎn)/分下處理15分鐘。所得組織被除菌、洗滌、收集并與低滲溶液(去離子水)結(jié)合，然后放置在振蕩器上200轉(zhuǎn)/分處理15分，從而溶解剩余細(xì)胞。去細(xì)胞的組織被再次除菌、漂洗并灰收入燒瓶中。向燒瓶中加入4％的脫氧膽酸鹽溶液并放置在振蕩器上200轉(zhuǎn)/分下處理1小時。隨后，所述組織塊在I型(超高純)水中被重復(fù)除菌并漂洗直到除去所有表面活性劑(氣泡)的痕跡。剩余的組織現(xiàn)在富集細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，收集剩余組織并使用過乙酸溶液(由I型水(96％)和100％EtOH醇(4％)組成)和20:1過乙酸溶液消毒，增重細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)并在200轉(zhuǎn)/分下晃動2小時。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行一系列漂洗之后，在-20℃下冷卻細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)然后進(jìn)行冷凍干燥，直到全部水都被除去。將冷凍干燥的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)加入包含1.0毫克/毫升胃蛋白酶的0.01N鹽酸溶液中來制備凝膠腳手架預(yù)凝膠材料，用等滲鹽水稀釋，根據(jù)需要得到濃度在大約1毫克/毫升和200毫克/毫升的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。實施例11-從細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中制備凝膠的一般方法在4℃下將0.1NNaOH(1/10消化液體積)和10X磷酸緩沖液(pH7.4)(1/9消化液體積)以適當(dāng)?shù)牧肯嗷旌闲纬砂螂谆|(zhì)(UBM)。使用冷(4℃)1XPBSpH7.4將所得溶液調(diào)整到理想的體積和濃度，放置在37℃培養(yǎng)器中發(fā)生凝膠化反應(yīng)(圖4D)。如圖4所示，在40分鐘后細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能夠在溶液中形成基質(zhì)。所述細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)衍生的凝膠在溫度低于20℃時是液態(tài)的，但是當(dāng)溫度升高到37℃時會變成凝膠。在從細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中制備凝膠時，所有溶液應(yīng)該被保存在冰上，并且變量具有以下的定義：Cf＝最終凝膠濃度，單位為mg/mlCs＝ECM消化液濃度，單位為mg/mlVf＝實驗所需最終凝膠溶液體積Vd＝ECM消化液所需體積，單位毫升V10X＝需要的10XPBS的體積，單位毫升V1X＝需要的1XPBS的體積，單位毫升VNaOH＝需要的0.1NNaOH的體積，單位毫升首先，確定所需要的ECM凝膠的最終濃度(Cf)和體積(Vf)。然后，計算通過乘式Cf(mg/ml)*Vf(ml)確定需要的ECM的量。所得值會提供需要的ECM消化液的體積(Vd)，其中Vd＝[Cf(mg/ml)*Vf(ml)]/Cs.將計算的體積Vd除以9來計算需要的10XPBS的體積(V10X＝Vd/9)。將計算的體積Vd除以10來計算需要的0.1NNaOH的體積(VNaOH＝Vd/10).計算需要的1XPBS的量，所述1XPBS能夠使溶液具有合適的濃度/體積，計算方法如下所示：V1X＝Vf–Vd–V10X–VNaOH。向合適的容器(通常是15或者50毫升的離心管)中加入所有試劑(V1X+Vd+V10X+VNaOH)，所述容器中不含有ECM消化物(Vd)。將所得溶液放置在冰上并一直在冰上保存。向上述制備的磷酸緩沖液/NaOH混合物中加入適當(dāng)體積的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)消化液(Vd)，用1毫升微量吸液管混合均勻，同時小心不要在溶液中產(chǎn)生氣泡。根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)消化液的粘度，在轉(zhuǎn)移過程中可能會有一些顯著的體積損失。監(jiān)控總體積并增加適當(dāng)?shù)牧?，直到實現(xiàn)最終體積。測量預(yù)凝膠液的pH值，其中，pH值應(yīng)該是在7.4左右。將預(yù)凝膠溶液加入到模具或者適當(dāng)?shù)男】字?。將所得模具或者小孔放?7℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)至少40分鐘。不要使用具有二氧化碳參照的培養(yǎng)器。如果擔(dān)心水分蒸發(fā)的話，將所述模具放置在帶拉連鎖的塑料袋中然后在放在培養(yǎng)器中。在凝膠化之后，從模具中移出凝膠并放置在1XPBS中。如果凝膠在組織培養(yǎng)皿中制備，則1XPBS可以被放置在凝膠頂部直到用于維持凝膠水合。樣品計算：從10毫克/毫升儲備溶液中制備6毫升凝膠，最終濃度為6毫克/毫升。前提Cs＝10mg/ml；Cf＝6mg/ml；Vf＝6mlVd＝[6mg/ml*6ml]/10mg/ml＝3.600mlV10X＝3.6/9＝0.400mlVNaOH＝3.6/10＝0.360mlV1X＝6ml–3.6ml–0.400ml–0.360＝1.640ml實施例12-組合物和豬膀胱基質(zhì)(UBM)形態(tài)學(xué)膀胱基質(zhì)(UBM)和鼠尾1型膠原蛋白(BD生物科學(xué)公司)溶液在還原條件下(5％的2-巰基乙醇)，4-20％聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。用凝膠-密碼藍(lán)(Bio-Rad公司)使蛋白顯色，用柯達(dá)成像站紀(jì)錄照片。分別使用羥脯氨酸試驗[ReddyGK,etal.“Asimplifiedmethodfortheanalysisofhydroxyprolineinbiologicaltissues,(在生物組織中分析羥脯氨酸的簡單方法)”(1996)Clin.Biochem.29(3):225-9]和BlyscanTM試驗試劑盒(Biocolor公司，北愛爾蘭)確定膠原蛋白和氨基多糖硫酸鹽(購自S-GAG)含量(三個樣品進(jìn)行實驗)。根據(jù)使用說明書進(jìn)行BlyscanTM實驗。在120℃下通過使用2M的NaOH(100微升總體積)在高壓鍋中水解樣品20分鐘確定羥脯氨酸含量。用50微升4MHCl中和樣品并與300微升的0.056M氯胺T(光譜)發(fā)生反應(yīng)，輕柔的混合并允許其在室溫下氧化25分鐘。然后將樣品與300微升的1M埃利希醛(光譜)并在65℃下培養(yǎng)20分鐘。使用鼠尾I型膠原蛋白(BD生物科學(xué)公司)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算消化的膀胱基質(zhì)(UBM)溶液中存在的膠原蛋白的總量。使用SpectraMax分光光度計在550nm下測定吸光度，確定比色變化。凝膠組合物已經(jīng)被確定了。胃蛋白酶消化的膀胱基質(zhì)(UBM)中的膠原蛋白濃度被發(fā)現(xiàn)是0.8±0.2毫克每毫克干冷凍干燥的膀胱基質(zhì)(UBM)粉末(平均值±SD)?？係-GAG含量是5.1±0.9微克每毫克干冷凍干燥的膀胱基質(zhì)(UBM)粉末(平均值±SD)。電泳的蛋白質(zhì)顯示在膀胱基質(zhì)(UBM)通路上含有典型的I型膠原蛋白帶，還有其他的條帶，如圖5所示。區(qū)別部分由于膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠劑中存在的其他組分(例如，小分子肽和氨基多糖)。使用掃描電鏡(SEM)檢驗膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠劑的表面形態(tài)。將樣品固定在冷2.5％戊二醛中，并在磷酸緩沖液中漂洗，隨后通過階梯系列的乙醇(30％-100％)進(jìn)行脫水工藝，最后在EmscopeCPD750臨界點干燥器中進(jìn)行臨界點干燥。將樣品固定在鋁掃描電鏡樣品固定架(ElectronMicroscopy科學(xué)有限公司，Hatfield，美國賓夕法尼亞州)上，并用自動噴射涂布機(jī)108(Cressington科學(xué)儀器公司，巴倫西亞，美國賓夕法尼亞州)將金-鈀合金噴射涂布在樣品上。最后，用掃描電鏡(JEOL6330F)檢驗樣品。以5,000和10,000倍放大取像。掃描電子顯微鏡照片顯示了膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠劑在濃度為3毫克/毫升和6毫克/毫升(圖6A-6D)以及在4毫克/毫升(圖7B)時的纖維狀外表。實施例10-豬膀胱基質(zhì)(UBM)、SIS和LS凝膠的流變性質(zhì)和凝膠化動力學(xué)在凝膠化期間檢定膀胱基質(zhì)(UBM)衍生的凝膠的流變性質(zhì)。膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠由溫度低于25℃的粘稠溶液和生理學(xué)溫度(37℃)的凝膠組成。使用這里所描述的類似的方法可以測量其他凝膠的流變性質(zhì)。同時測量肝基質(zhì)(LS)和小腸粘膜下層(SIS)的流變性質(zhì)。按照之前的描述使用分光光度法確定比濁的凝膠動力學(xué)(GelmanRA,etal.,“Collagenfibrilformation.Evidenceforamultistepprocess,”(1979)J.Biol.Chem.254(1):180-6).最終，適當(dāng)濃度的預(yù)凝膠溶液在4℃下保存，并轉(zhuǎn)移到冷96孔板上，每孔100微升，一式三份。SpectraMax分光光度計(MolecularDevices公司)被預(yù)先加熱到37℃，將平皿放置于分光光度計中，在405納米下測定每個孔板的濁度，每兩分鐘測定一次進(jìn)行1.5小時(圖8A)。還可以在530納米處測量濁度(圖9)。記錄吸光度值并如圖8B所示規(guī)范化。達(dá)到50％最大濁度測量值(例如，最大吸光光度值)所需的時間被定義為t1/2，且通過外延曲線的線性增長計算Lag相(tlag)根據(jù)比濁測量值，如圖8B所示計算曲線生長部分的斜率確定凝膠化速度(s)。動態(tài)振動測量通常被用于凝膠化的機(jī)理研究以及用于凝膠粘彈性質(zhì)定性中。將樣品與擺動菌株接觸：γ(t)＝γ0cos(2πft)(1)其中，γ0是正弦菌株的量，t是時間，f是頻率。樣品產(chǎn)生的正弦力如下所述：σ(t)＝|G*|γ(t)(2)其中，G*是樣品的頻率依賴型復(fù)合模量。G*的實數(shù)部分，寫作G′，與使用的菌株在一個相中，并且由于其對應(yīng)于樣品彈性形變過程中存儲的機(jī)械能而被叫做存儲模量。G*的虛數(shù)部分，寫作G″，與使用的菌株相成90°，并且由于其對應(yīng)于樣品內(nèi)因粘性消散造成的能量損失而被叫做損失模量。由于樣品被期望發(fā)展成固體狀特點，如進(jìn)行的凝膠化作用，因此期望G′能夠顯著增長。所關(guān)心的最終性質(zhì)是復(fù)合粘度的數(shù)值，如下定義：其中，|η*|是頻率依賴型復(fù)合粘度，G*是頻率依賴型復(fù)合模量，并且f是頻率。通常，相對于頻率數(shù)據(jù)將復(fù)合粘度擬合成冪率分布，形成：|η*|＝kfn(4)其中，k和n都是常數(shù)。使用TA測試儀AR2000應(yīng)力-控制流變儀進(jìn)行流變學(xué)實驗，使用40毫米直徑的平行平板幾何結(jié)構(gòu)和Peltier細(xì)胞維持樣品溫度。按照之前的描述制備樣品并裝入流變儀中，所述流變儀中含有溫度維持在15℃的Peltier細(xì)胞。在樣品邊緣使用礦物油避免蒸發(fā)。首先通過對樣品施加恒定的1帕壓力，并在15℃下持續(xù)1分鐘來測定樣品粘度。然后將溫度設(shè)定到37℃，產(chǎn)生凝膠化作用。通常Peltier細(xì)胞在10秒內(nèi)溫度能夠達(dá)到30℃，在50秒內(nèi)溫度能夠達(dá)到37℃。在溫度增加過程中以及隨后的凝膠化過程中，以固定的頻率0.159赫茲(rad/s)和5％的菌株持續(xù)監(jiān)測樣品的振動模量。當(dāng)彈性模量(G')不再隨時間發(fā)生進(jìn)一步的變化時，認(rèn)為完成凝膠化作用。通過在37℃下和5％的菌株中進(jìn)行掃頻，掃頻范圍在15.9赫茲和0.08赫茲之間，來調(diào)節(jié)凝膠的最終線性粘稠彈性性質(zhì)。圖8顯示了比濁凝膠動力學(xué)和計算參數(shù)，結(jié)果顯示在表1中。膀胱基質(zhì)(UBM)和I型膠原蛋白凝膠的比濁凝膠動力學(xué)形成S形狀(圖8A)。在凝膠化之后，濃度為3毫克/毫升的I型膠原蛋白凝膠比3毫克/毫升和6毫克/毫升的膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠變得更渾濁(圖8A)。膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠(濃度為3和6毫克/毫升時)的lag相(tlag)和達(dá)到最終濁度的一半所需要的時間(t1/2)比I型膠原蛋白(3毫克/毫升)的大。另外，與I型膠原蛋白相比，膀胱基質(zhì)(UBM)的比濁凝膠化動力學(xué)(S)的速度較低。在膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠中，當(dāng)濃度發(fā)生改變時，tlag、t1/2和S不發(fā)生變化，但是當(dāng)達(dá)到最大濁度時，則發(fā)生變化。1毫克/毫升的小腸粘膜下層(SIS)凝膠的比濁動力學(xué)也形成S形(圖9)。而膀胱基質(zhì)(UBM)測量值在405納米下獲得，小腸粘膜下層(SIS)測量值在530納米處獲得。小腸粘膜下層(SIS)測量值還顯示在達(dá)到最大濁度前，濁度下降。在樣品的溫度從15℃升高到37℃后，膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠的儲存模量(G′)和損失模量(G″)都隨時間變化呈S型(圖10)。G′和G″在大約8分鐘之后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，說明發(fā)生凝膠化作用。G′和G″的動力學(xué)比比濁動力學(xué)更快。圖12顯示了在0.08-15赫茲的膀胱基質(zhì)(UBM)和I型膠原蛋白的粘度，結(jié)果總結(jié)在表1中。在樣品的溫度升高到37℃后，LS和SIS凝膠的儲存模量(G′)也隨時間變化呈S型(圖11A)。LS和SIS凝膠的G′動力學(xué)比膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠的G′動力學(xué)更快。LS、SIS和膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠的儲存模量(G′)也可以被測量為角頻率的函數(shù)(圖11B)。表1:結(jié)果來自膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠化動力學(xué)的濁度分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用三個樣品進(jìn)行實驗(n＝3).*p<0.05在努力探索將膀胱基質(zhì)(UBM)用作可注射材料可能性的工作中，進(jìn)行了多次試驗在注射設(shè)定中檢驗他們。懸浮在鹽水中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)粉末和膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠劑一起被檢驗，觀察他們是否可以成功的穿過經(jīng)常被用于醫(yī)學(xué)過程的注射針，例如聲帶擴(kuò)張器。這些針長度為1厘米，口徑為25規(guī)格，說明里面附著著25厘米長，16規(guī)格的針狀軸。膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠可以容易地并且連續(xù)的穿過這些針。膀胱基質(zhì)(UBM)粉末懸浮液的濃度上限為10毫克/毫升，在此上限之上，針會時常阻塞，從而難以確定傳遞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的實際量。該實驗顯示膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠有可能用作可注射的材料(表2)。表2:膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠和市場上可買到的可注射材料的粘度比較aChanRW,etal.Viscositiesofimplantablebiomaterialsinvocalfoldaugmentationsurgery.Laryngoscope.1998May；108(5):725-31.bKlemukSA,etal.Viscoelasticpropertiesofthreevocal-foldinjectablebiomaterialsatlowaudiofrequencies.Laryngoscope.2004Sep；114(9):1597-603.實施例14-雜合無機(jī)/細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)腳手架在四肢截肢以及用義肢置換之后連接動力學(xué)的恢復(fù)是受到限制的，這是由于不能將存在的肌肉系統(tǒng)與義肢通過腱的骨間插入相附著(Higuera,C.A.,etal.,JOrthopRes.1091-9(23)2005).雖然有很多多孔鈦和鉭合金已經(jīng)成功的促進(jìn)了骨骼的內(nèi)向生長，但是目前沒有替換手段來促進(jìn)纖維軟骨組織的內(nèi)向生長，二纖維軟骨組織修復(fù)韌帶或者腱的插入位點。最近，多孔鉭腳手架已經(jīng)被研究測定其促進(jìn)血管化的纖維組織向內(nèi)生長的能力，并使所述纖維組織具有約定的機(jī)械強(qiáng)度(Hacking,S.A.,etal.:JBiomedMaterRes,631-8(52)2000)。從豬小腸和膀胱(UBM)中自然衍生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)腳手架也已經(jīng)顯示形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的腱、韌帶、軟骨和骨骼以及強(qiáng)壯的、具有很好機(jī)械強(qiáng)度的骨間插入位點(Badylak,S.F.:TransplImmunol.367-77(12)2004；Dejardin,L.M.,etal.:AJSM.175-84(29)2001)。可以合理預(yù)計在其小孔中裝入細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的多孔鉭或者鈦腳手架可以改善軟組織的向內(nèi)生長，長入金屬表面并促進(jìn)纖維軟骨組織的形成。目前研究的目標(biāo)是確定使用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠包覆多孔的鈦腳手架的可能性，確定是否適合最終的韌帶或者腱插入修復(fù)。按照之前的描述制備膀胱基質(zhì)(UBM)粉末(Freytes,DOetal,Biomaterials,2004.25(12):2353-61)。室溫下，將1克冷凍干燥的膀胱基質(zhì)(UBM)粉末與在100毫升0.01MHCl中的100毫克的胃蛋白酶相混合，持續(xù)攪拌大約48小時，制備膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠消化物。37℃下使用磷酸緩沖液將pH和離子強(qiáng)度調(diào)整到生理學(xué)范圍，引發(fā)膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠聚合作用。凝膠在30分鐘內(nèi)進(jìn)行完全聚合作用。用丙酮、甲醇、水清潔多孔金屬腳手架，并用20-45％的硝酸鈍化。測量膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠消化物(在[10毫克/毫升]之前和生理活化作用[6毫克/毫升]之后)和CPTi片或者Ti6Al4V片之間的接觸角。向每個表面加入1毫升的消化物并照數(shù)字照片用于隨后確定角度。兩個方法測試促進(jìn)聚合的膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠穿入CP鈦纖維網(wǎng)孔或者CP鈦燒結(jié)的小珠的能力。每個多孔金屬腳手架的全部表面都被活化的膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠覆蓋五分鐘。對于一般的腳手架來說，凝膠能在靜態(tài)條件下穿過，而另一半樣品需要使用超聲處理才能發(fā)生穿透作用。加入染料從而觀察凝膠。為了確定多孔鈦腳手架中存在膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠，以及為了更好地理解膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠和所述金屬之間的相互作用，制備用于環(huán)境掃描電子顯微鏡法(ESEM)的樣品。由于當(dāng)在水合狀態(tài)下保持靜止時，樣品可以用環(huán)境掃描電子顯微鏡法(ESEM)目測，鈦腳手架和膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠之間的相互作用能夠在不脫水分裂細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的情況下被確定。膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠消化物和活化的膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠潤濕CPTi和Ti6Al4V孔表面(表4)。因此，多孔金屬將不會排斥細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。根據(jù)這些結(jié)果，隨后的實驗集中在活化的凝膠上。在靜態(tài)條件下膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠能夠穿過每個多孔金屬腳手架厚度的一半。在加入超聲處理之后，小孔可以滲入腳手架的整個厚度(圖13A和13B)。用環(huán)境掃描電子顯微鏡法(ESEM)檢驗雜合腳手架，顯示在多孔肽內(nèi)很好的穿透，并很好的包覆所述多孔鈦(圖14A-14D)。使用膀胱基質(zhì)(UBM)凝膠和多孔鈦腳手架制備一種雜合的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)/多孔金屬腳手架是可能的。未來的研究會評價這些腳手架是否可以支持細(xì)胞體外生長并促進(jìn)結(jié)締組織在體內(nèi)的內(nèi)向生長。這些努力的最終目標(biāo)是開發(fā)一種腳手架，它能夠促進(jìn)軟組織向內(nèi)生長進(jìn)入金屬中并用作韌帶和腱的插入位點。表4:膀胱基質(zhì)(UBM)材料在鈦合金上的接觸角(平均值±SD)實施例15-預(yù)消化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料的消毒.已經(jīng)注意到，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)腳手架的最終消毒能夠抑制隨后的水凝膠形成蛋白酶-溶解的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料。下面解釋了消毒對定性水凝膠形成的作用，使用沒有滲析的皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)(也就是說，如上所述完整的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM))。如上所述使豬皮膚去細(xì)胞，并且使用多種方法進(jìn)行最終消毒。通過暴露于(1)用量為10kGy、25kGy和40kGy的γ射線、(2)用量為10kGy、25kGy和40kGy的電子束輻射，和(3)劑量為750毫克/小時的環(huán)氧乙烷(EtO)氣體，進(jìn)行16小時。參照皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)片不消毒。然后在帶有60網(wǎng)篩的Wiley碾壓器上機(jī)械粉碎消毒的和參照的皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，在4℃下用在0.01NHCl中的1毫克/毫升胃蛋白酶進(jìn)行酶消化48小時產(chǎn)生預(yù)凝膠，并在室溫下(20-25℃)，通過將pH值中和到大約7.4來檢驗水凝膠的形成，然后在不包括二氧化碳的培養(yǎng)器中升高溫度到37℃。圖15顯示最終消毒的皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)不能形成水凝膠，無論使用什么消毒方法，而未消毒的皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成固體凝膠，并且在除去金屬環(huán)模型后仍然能夠維持。實施例16-冷凍干燥產(chǎn)品的消毒由于在預(yù)-消化的去細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料進(jìn)行最終消毒之后不能形成水凝膠，并且已經(jīng)認(rèn)識到消毒的臨床/商業(yè)需要，我們假設(shè)消毒前材料形式的改變能夠使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)凝膠化。不使用冷凍干燥的固體細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)片，我們對從未滲析(如上所述完整的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM))中制備的冷凍干燥的預(yù)凝膠進(jìn)行消毒，機(jī)械粉碎經(jīng)過酶消化(基本上如上所述)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，并檢測是否形成水凝膠。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，不包括滲析，對來源于小腸粘膜下層的細(xì)胞外基質(zhì)(SIS-ECM)進(jìn)行脫細(xì)胞作用。小腸粘膜下層(SIS)-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)粉末使用上述同樣的方法進(jìn)行酶消化，在-80℃下在干冰上冷凍，并冷凍干燥。然后通過暴露于環(huán)氧乙烷氣體(用量為750毫克/小時，進(jìn)行16小時)對冷凍干燥的預(yù)凝膠消毒，和/或在去離子水或者0.01NHCl中重組(圖16A-16D)。圖16A-16D顯示在室溫下，在消毒之前使用水可完全重組，但是在消毒后(圖16D)只有在去離子水中的預(yù)凝膠是完全重組的。由于只有在去離子水中的預(yù)凝膠實現(xiàn)了完全重組，使用這些樣品檢驗水凝膠的形成。圖17顯示，當(dāng)中和后被放入不含有二氧化碳的培養(yǎng)器中時，未消毒的和環(huán)氧乙烷消毒的預(yù)凝膠會產(chǎn)生固體凝膠，在除去金屬環(huán)模具之后仍維持凝膠形式。為了鞏固圖17的結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案對來源于膀胱的細(xì)胞外基質(zhì)(UBM)進(jìn)行去細(xì)胞化，并使用上面對小腸粘膜下層(SIS)-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所使用的相同的方法進(jìn)行實驗。相似的結(jié)果說明冷凍干燥的預(yù)凝膠的消毒會增進(jìn)水凝膠的形成(圖18)。實施例17-冷凍干燥產(chǎn)品的消毒-進(jìn)一步研究展開上述實施例的工作，基本上按照上述制備的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料被以不同的形式消毒，如下所示：未被消化的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料，粉末形式或者二位片狀形式；未被消化的水合的粉末或者二維片狀細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料；酸性蛋白酶消化的但是沒有被中和的預(yù)凝膠溶液；和/或消化的但沒有被中和的冷凍干燥預(yù)凝膠。對各種來源的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料進(jìn)行實驗，包括膀胱、脾、肝、心臟、胰腺、卵巢、小腸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、脂肪組織和/或骨骼。用環(huán)氧乙烷、γ射線(2kGy、30kGy，在室溫和-80℃下)、電子束輻射(2kGy、30kGy，在室溫和-80℃下)、和/或超臨界二氧化碳(高和/或低)。同時運行未滅菌的參照物。實施例18–經(jīng)歷各種消毒方法的脫細(xì)胞的膀胱基質(zhì)(UBM)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案對膀胱基質(zhì)去細(xì)胞化并進(jìn)行各種消毒方法。在對(1)膀胱基質(zhì)(UBM)片、(2)機(jī)械粉碎的膀胱基質(zhì)(UBM)粉末、和(3)在消化和冷凍干燥之后進(jìn)行消毒，隨后檢驗水凝膠的形成。每種凝膠在環(huán)形模具中形成并成像(圖19A)。用冷凍干燥的消化物所形成的剛性最強(qiáng)的水凝膠檢測凝膠形成作用，隨后進(jìn)行粉末形式的，最后顯示為儲存模量值(參見圖19B)。膀胱基質(zhì)(UBM)片的消毒不允許隨后形成水凝膠。每種消毒方法都會影響水凝膠的形成，但是這個影響可以通過開始形成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料而減輕，通過將scCO2和EtO冷凍干燥的消化物與粉末形式的儲存模量相比較可以清楚的證明這一結(jié)論。有趣的是，未消毒的參照樣品在水凝膠形成方面也顯示了明顯的差異，冷凍干燥的消化物形成更具剛性的凝膠。定性的說，冷凍干燥的消化物形成最具剛性的水凝膠，隨后的粉末形式，而膀胱基質(zhì)(UBM)片的消毒使隨后的水凝膠形成變得不可能。這些凝膠剛性的流變性表征(即，儲存模量或者G’)進(jìn)一步確證凝膠剛性的定性趨勢。這些圖一起強(qiáng)調(diào)了經(jīng)過消毒的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形式(即，片型、粉末或者消化物)的重要性。本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)一些實施例進(jìn)行了描述，所述實施例只是起說明作用，而不是以任何形式作為限制。因此，本發(fā)明能夠在具體實施過程中有許多變化，這些變化可以是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過這里所包含的描述衍生的內(nèi)容，并且之前的描述不會起到局限作用，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)被解釋為與下述權(quán)利要求書的范圍一樣寬。當(dāng)前第1頁1 2 3