一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應(yīng)用，選用生長(zhǎng)在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素，采用微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50℃，乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min；制備的原花青素的總抗氧化活性也比抗壞血酸高，結(jié)合果蠅生存實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果說明原花青素具有延緩果蠅衰老功效；通過小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)表明，從昆侖雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，對(duì)CCl4致小鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用，應(yīng)用從昆侖雪菊中提取原花青素具有良好的延緩衰老功效，具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】 一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及原花青素的提取制備的【技術(shù)領(lǐng)域】。具體的說，本發(fā)明涉及一種從昆侖雪菊原花青素的提取方法及其應(yīng)用的制備【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]新疆昆侖雪菊,學(xué)名為兩色金雞菊{(diào)Coreopsis tine tori a)是菊科金雞菊屬一年生草本植物的干燥頭狀花序.在新疆主要分布于和田地區(qū)海拔高3000米左右的昆侖山區(qū)，有較豐富的野生資源。長(zhǎng)期以來，昆侖雪菊被當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)花茶飲用，新疆維吾爾醫(yī)院也作為一種維藥材應(yīng)用.具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功，用花泡茶飲，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒，是具有廣闊前景和研究?jī)r(jià)值的新品種。作為藥食兩用資源，昆侖雪菊在近幾年已經(jīng)成為市場(chǎng)的賣點(diǎn)，已成為人們的高檔饋贈(zèng)禮品。關(guān)于昆侖雪菊黃酮研究較多，而對(duì)昆侖雪菊原花青素的研究鮮見報(bào)道。
[0003]原花青素iProcyemidinsWC)是一種黃燒_3_醇或黃燒_3，4_ 二醇聚合而成的一大類多酚化合物的總稱，是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。原花青素還具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變、美容等，并具有改善人體微循環(huán)的功能。原花青素作為植物中一類普遍的次級(jí)代謝產(chǎn)物同花色素、生物黃酮等物質(zhì)一樣廣泛分布于各種植物的種子、葉子、果實(shí)、花和皮、殼等處，目前國(guó)內(nèi)外多從葡萄籽中提取原花青素，其次是從松樹皮中提取。而以昆侖雪菊花作為提取原花青素原料，研究其提取方法和含量的文章還未見報(bào)道。
[0004]動(dòng)態(tài)超高壓微射流(DHPM)是一種特殊形式的高壓均質(zhì)技術(shù)，它利用高壓使液體物料高速流過狹窄的縫隙時(shí)受到強(qiáng)大的剪切力、撞擊力以及空穴爆炸力等綜合作用，使細(xì)胞破碎、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物溢出，從而提高有效成分的提取率的過程。目前已有學(xué)者研究了 DHPM在提取和大分子改性方面的應(yīng)用，如對(duì)馬鈴薯葉中總黃酮提取及活性影響、木瓜蛋白酶活性的影響、脂肪酸脂質(zhì)體的制備、對(duì)胰蛋白酶的活性、穩(wěn)定性和構(gòu)象的影響等，但尚無關(guān)于將DHPM技術(shù)運(yùn)用于雪菊原花青素提取的相關(guān)研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見有關(guān)將DHPM技術(shù)運(yùn)用于雪菊原花青素提取的研究和報(bào)道，本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，旨在提供一種昆侖雪菊原花青素的提取方法及在延緩衰老中的應(yīng)用，制備的原花青素的總抗氧化活性也比抗壞血酸高，結(jié)合果蠅生存實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果說明原花青素具有延緩果蠅衰老功效，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案:
本發(fā)明以生長(zhǎng)在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素，優(yōu)化提取工藝，并對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化、延緩果蠅衰老作用及對(duì)CC14誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用的研究，確定了從昆侖雪菊中提取原花青素在延緩衰老中的應(yīng)用具有良好的效果；制備的原花青素的總抗氧化活性也比抗壞血酸高，是一種天然的抗氧化劑，結(jié)合果蠅生存實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果說明原花青素具有延緩果蠅衰老功效；通過小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)表明，從從昆侖雪菊中提取原花青素可降低血清ALT和AST活性，對(duì)CC14致小鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用，應(yīng)用從從昆侖雪菊中提取原花青素具有良好的延緩衰老功效，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0007]本發(fā)明具體提供一種昆侖雪菊原花青素的提取方法，％按照重量百分比計(jì)，具體提取方法步驟如下:
(I)生長(zhǎng)在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，將烘干后的雪菊粉在粉碎機(jī)中粉碎后過40目篩。
[0008](2)用石油醚對(duì)雪菊粉脫脂8小時(shí)并在50°C烘干2h。
[0009](3)乙醇浸潤(rùn):料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中靜置過夜。
[0010](4)預(yù)均質(zhì):使用均質(zhì)壓力為30MPa,均質(zhì)2次。
[0011](5)動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理:采用一定微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min。
[0012](6)乙醇回流:以60%乙醇濃度，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度60 °C，回流提取2次，離心并合并濾液,經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，蒸發(fā)溫度30°C,轉(zhuǎn)速40rpm。
[0013](7)大孔樹脂純化:AB-8大孔樹脂純化最優(yōu)條件為原花青素上樣濃度為1.06mg/mL、上樣pH=6、上樣流速為2BV/h，用4倍柱床體積70%的乙醇以流速為2BV/h洗脫；經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，蒸發(fā)溫度30°C,轉(zhuǎn)速40rpm ;純化后昆侖雪菊原花青素的純度為66.76%。
[0014](8)采用真空冷凍干燥，冷凝溫度一 50°C，真空度<20Pa條件下制備獲得昆侖雪菊原花青素濃縮粉。
[0015]進(jìn)一步，本發(fā)明通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于清除羥基自由基，抗壞血酸與原花青素的IC5tl值分別為0.052mg/mL與0.045mg/mL ;對(duì)于清除DPPH.自由基，抗壞血酸與原花青素的IC50值分別為0.003mg/mL與0.025mg/mL，表明原花青素的清除羥基自由基與DPPH.自由基活性比抗壞血酸強(qiáng)；昆侖雪菊原花青素與抗壞血酸的總抗氧化能力IC5tl值分別為0.002mg/mL與0.003mg/mL,由此可表明昆侖雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
[0016]本發(fā)明通過果蠅生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素添加量達(dá)到0.0067%時(shí)雌性與雄性的平均壽命均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組；果蠅體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明，原花青素添加量為0.0201%劑量組的SOD活性較對(duì)照組顯著提高，而MDA含量卻顯著降低，表明采用本發(fā)明提供的動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素具有延緩果蠅衰老的功效。
[0017]本發(fā)明通過小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素可以減輕實(shí)驗(yàn)性肝損傷所致炎性反應(yīng)，降低肝體指數(shù)，降低血清中ALT、AST活性(P〈0.05)。由此可得結(jié)論，本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素對(duì)CC14造成的實(shí)驗(yàn)性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與雪菊原花青素抗氧化作用有關(guān)。
[0018]本發(fā)明提供給了原花青素含量的具體計(jì)算方式:
顯色劑制備:A液為0.5%香草醛溶液(稱取0.500g香草醛溶于甲醇液中，最后定容到10mL) ;B液為4%的鹽酸液(取4mL濃鹽酸溶于甲醇中，定容至10mL );顯色劑:A:B=1:1，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0019]原花青素對(duì)照品的制備:精密稱取原花青素對(duì)照品10.0 mg，放置于1mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得到濃度是1.0mg/mL的原花青素對(duì)照品溶液。
[0020]原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確吸取原花青素對(duì)照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5mL別然后用甲醇定容至10mL。各取ImL分別加入5mL顯色劑,搖勻,避光。在30±1°C恒溫水浴中保持30min，保溫比色。取出比色管，在Amax=500nm波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)原花青素濃度與吸光值的數(shù)量關(guān)系，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程為:A=0.4066C-0.0018, r=0.9996，說明原花青素濃度在0.050?1.250mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。
[0021 ]原花青素含量=2.4594A+0.0044
本發(fā)明提供給了原花青素提取得率計(jì)算方式:
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitlabl5分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以原花青素提取得率為考察指標(biāo)原花青素提取得率計(jì)算公式:得率/%=[CXVXn/W] X 100%
其中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度mg/mL ^為提取液的體積mL ;11為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量mg。
[0022]本發(fā)明采用統(tǒng)計(jì)方法利用Minitabl5、SPSS17.0、Excel等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
[0023]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
可以達(dá)到以下有益效果:
(I)本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取昆侖雪菊原花青素，并利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，同時(shí)對(duì)昆侖雪菊原花青素的抗氧化性及延緩衰老作用進(jìn)行了研究，探討了雪菊原花青素對(duì)小鼠CC14肝損傷的保護(hù)作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取昆侖雪菊原花青素的最佳條件是:微射流壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min，此條件下原花青素的提取率為22.29%，純度為25.68 ±0.98%，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后純度為66.76±0.34%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于清除羥基自由基，抗壞血酸與原花青素的IC5tl值分別為0.052mg/mL與0.045mg/mL ;對(duì)于清除DPPH.自由基，抗壞血酸與原花青素的IC5tl值分別為0.003mg/mL與0.025mg/mL，表明原花青素的清除羥基自由基與DPPH.自由基活性比抗壞血酸強(qiáng)；昆侖雪菊原花青素與抗壞血酸的總抗氧化能力IC5tl值分別為0.002mg/mL與0.003mg/mL,由此可表明昆侖雪菊原花青素具有良好的抗氧化活性。
[0024](2)本發(fā)明通過果蠅生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素添加量達(dá)到0.0067%時(shí)雌性與雄性的平均壽命均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組；果蠅體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明，原花青素添加量為0.0201%劑量組的SOD活性較對(duì)照組顯著提高，而MDA含量卻顯著降低，表明采用本發(fā)明提供的動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素具有延緩果蠅衰老的功效。
[0025](3)本發(fā)明通過小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素可以減輕實(shí)驗(yàn)性肝損傷所致炎性反應(yīng)，降低肝體指數(shù)，降低血清中ALT、AST活性(P〈0.05)。由此可得結(jié)論，本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取技術(shù)從中提取出雪菊原花青素對(duì)CC14造成的實(shí)驗(yàn)性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與雪菊原花青素抗氧化作用有關(guān)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明提供的活性研究試驗(yàn)路線圖。
[0027]圖2顯示為乙醇濃度對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0028]圖3顯示為提取溫度對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0029]圖4顯示為提取時(shí)間對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0030]圖5顯示為微射流壓力對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響圖。
[0031]圖6顯示為原花青素清除羥基自由基活性圖。
[0032]圖7顯示為原花青素清除DPPH.自由基活性圖。
[0033]圖8顯示為原花青素總抗氧化活性圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034]下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例，本發(fā)明中基本涉及到的％無特別指明都是重量百分比計(jì)。
[0035]試驗(yàn)原料:昆侖雪菊采自新疆和田的昆侖山區(qū)，由新疆和田沙漠玫瑰有限責(zé)任公司采摘并提供，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院的胡君萍博士鑒定為菊科金雞菊品種。學(xué)名為兩色金雞菊C.tinctoria,本實(shí)驗(yàn)所用的為其干燥的花序；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%),天津市尖峰天然產(chǎn)物研究;AB-8大孔吸附樹脂，天津南開大學(xué)實(shí)驗(yàn)化工廠；天津建成生物試劑有限公司；2，2-二苯基-1-苦味酰苯肼(DPPH)，天津市化學(xué)試劑三廠；S0D試劑盒、MDA試劑盒自南京建成生物工程研究所。CCL4，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；聯(lián)苯雙酯(1.5mg/粒)，浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司。
[0036]主要化學(xué)試劑:乙醇、甲醇、香草醛、濃鹽酸、雙氧水、碘化鉀、三氯甲烷、鄰二氮菲、磷酸納、硫酸亞鐵、石油醚、丙酸、瓊脂粉、酵母粉，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵等化學(xué)試劑均為分析純。
[0037]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:黑檀體果蠅(Ebony，e)由新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院鑒定；昆明種小鼠，體重18_22g，雌雄各半120只，合格證號(hào)N0.65000200000072，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)SCXK (新)2011-0001。本發(fā)明具體采用的活性研究試驗(yàn)路線圖參見附圖1。
[0038]試驗(yàn)儀器:SABA18全自動(dòng)生化儀,意大利；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；V-1100D型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；AL-104電子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱，日本三洋電子生物儀器有限公司；TDL_5_A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-82恒溫振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；FZ102-SM真空冷凍干燥設(shè)備，德國(guó)西門子公司；SHB-1II循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-S型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華有限公司；H-1微型混合器，上?？岛坦怆妰x器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA電儀器有限公司；體視顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱GHP-9050，上海-恒科技有限公司；985-370型勻漿器，美國(guó)B1spec公司等。
[0039]本發(fā)明中選用的所有原輔材料，所選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0040]實(shí)施例一:新疆昆侖雪菊原花青素的提取
本發(fā)明具體提供一種昆侖雪菊原花青素的提取方法，％按照重量百分比計(jì)，具體提取方法步驟如下:
(I)生長(zhǎng)在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，將烘干后的雪菊粉在粉碎機(jī)中粉碎后過40目篩。
[0041](2)用石油醚對(duì)雪菊粉脫脂8小時(shí)并在50°C烘干2h。
[0042](3)乙醇浸潤(rùn):料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中靜置過夜。
[0043](4)預(yù)均質(zhì):使用均質(zhì)壓力為30MPa,均質(zhì)2次。
[0044](5)動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理:采用一定微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min。
[0045](6)乙醇回流:以60%乙醇濃度，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度60 V，回流提取2次，離心并合并濾液,經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，蒸發(fā)溫度30°C,轉(zhuǎn)速40rpm。
[0046](7)大孔樹脂純化:AB-8大孔樹脂純化最優(yōu)條件為原花青素上樣濃度為1.06mg/mL、上樣pH=6、上樣流速為2BV/h，用4倍柱床體積70%的乙醇以流速為2BV/h洗脫；經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，蒸發(fā)溫度30°C,轉(zhuǎn)速40rpm ;純化后昆侖雪菊原花青素的純度為66.76%。
[0047](8)采用真空冷凍干燥，冷凝溫度一 50°C，真空度<20Pa條件下制備獲得昆侖雪菊原花青素濃縮粉。
[0048]實(shí)施例二:提取新疆昆侖雪菊原花青素最優(yōu)工藝的確定
選擇濃度為60%(V/V)的乙醇作為提取溶劑，反復(fù)浸提兩次，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度溫度4個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn)，以昆侖雪菊原花青素提取得率和DPPH.清除率為評(píng)價(jià)提取工藝條件的指標(biāo)。
[0049]1.1乙醇濃度對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響
準(zhǔn)確稱取1.0OOg雪菊花粉，石油醚脫脂至無色并烘干，料液比1:40，配置40%，50%，60%，70%, 80%, 90%乙醇濃度放置于4°C冰箱中靜置過夜，經(jīng)30MPa，均質(zhì)2次后，在微射流壓力100 MPa下處理2次，50°C水浴提取30分鐘，提取2次，離心合并濾液后測(cè)吸光度值，計(jì)算得率；計(jì)算DPPH.清除率，結(jié)果如附圖2所示:
由附圖2所示，在乙醇濃度40-60%的范圍內(nèi)，提取得率及DPPH.清除率均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨著提取劑用量的增加，原花青素提取得率明顯增大，這是因?yàn)閷?duì)于一定量的粉末原料，溶劑用量的增加降低了濃度，增加了原料與溶劑接觸面的濃度差，從而提高了原花青素與溶劑的擴(kuò)散速度，原花青素提取得率升高。此時(shí)DPPH.的清除率為78.64%，隨著乙醇濃度進(jìn)一步增加，但是當(dāng)乙醇濃度超過60%時(shí)，原料中的絕大部分原花青素已被溶解出來，提取得率緩慢降低，對(duì)DPPH.清除率也有所下降，因此選擇60%的乙醇作為溶劑。
[0050]1.2提取溫度對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響
稱1.0OOg雪菊花粉，處理?xiàng)l件同2.1.1.1，在微射流壓力100 MPa下處理2次，20°C，30°C AOV, 50°C，60°C水浴提取30分鐘，提取2次，離心合并濾液后測(cè)吸光度值，計(jì)算得率；計(jì)算DPPH.清除率，結(jié)果如附圖3示。
[0051]從附圖3可以看出，提取溫度在20~40°C之間時(shí)，隨著提取溫度的增加，原花青素提取得率相應(yīng)增大，這是由于升高溫度增加了溶劑分子和原花青素分子的動(dòng)能，促進(jìn)了原花青素的擴(kuò)散作用，使原花青素溶出率增大。但當(dāng)溫度超過40°C時(shí)變得緩慢降低，這可能是因?yàn)闇囟壬撸軇┑膿]發(fā)加快，減少了溶劑和原料之間的有效接觸面，使出原花青素提取得率下降。且在40°C時(shí)，DPPH.的清除率高達(dá)88.00%，，因此選擇40°C為最佳提取溫度。
[0052]1.3提取時(shí)間對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響
稱1.0OOg雪菊花粉，處理?xiàng)l件同2.1.1.1，在微射流壓力10MPa下處理2次，40°C水浴提取10、20、30、40、50分鐘，提取2次，離心合并濾液后測(cè)吸光度值，計(jì)算得率；計(jì)算DPPH.清除率，結(jié)果如附圖4所示。
[0053]由附圖4可見，隨著提取時(shí)間的增加，雪菊原花青素提取得率出現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間30min時(shí)雪菊原花青素提取得率不再增加反而有所下降。分析原因可能是長(zhǎng)時(shí)間作用下，有效成分發(fā)生降解或者是由于時(shí)間過長(zhǎng)，造成雜質(zhì)含量增加，有效成分含量隨之下降，從而導(dǎo)致提取得率的降低。其DPPH.的清除率達(dá)到78.85%。因此選擇30min為最佳提取時(shí)間。
[0054]1.4微射流壓力對(duì)提取得率及DPPH.清除率的影響
稱1.0OOg雪菊花粉，處理?xiàng)l件同上，在微射流壓力分別40MPa，60MPa，80 MPa, 10MPa,120Mpa下處理2次，40°C水浴提取30分鐘，提取2次，離心合并濾液后測(cè)吸光度值，計(jì)算得率；計(jì)算DPPH.清除率，結(jié)果見附圖5。
[0055]由附圖5所示，隨著微射流壓力的增大，提取得率及DPPH ?清除率均呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，說明增加微射流壓力有利于溶劑滲透到植物細(xì)胞內(nèi)部，加速相互滲透，以增加原花青素在乙醇中的溶解度。在微射流壓力上升到10MPa時(shí)，DPPH.清除率達(dá)到57.32%。隨著壓力進(jìn)一步的增大，提取得率及DPPH.清除率都趨于平緩，因此，考慮到儀器的承受負(fù)荷，選擇10MPa為最佳。
[0056]結(jié)論:動(dòng)態(tài)超高壓微射流輔助提取昆侖雪菊原花青素最優(yōu)工藝為:提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min，此條件下原花青素的提取率為22.29%，純度為25.68±0.98%，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后純度為66.76±0.34%。
[0057]實(shí)施例三:新疆昆侖雪菊原花青素最優(yōu)工藝的確定
以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、微射流壓力為自變量設(shè)計(jì)四因素三水平L9 (34)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)昆侖雪菊原花青素提取工藝。
[0058]表1:正交試驗(yàn)結(jié)果表

【權(quán)利要求】
1.一種昆侖雪菊原花青素的提取方法，其特征在于，％按照重量百分比計(jì)，具體提取方法步驟如下: (1)生長(zhǎng)在海拔2600米以上的昆侖雪菊花為原料，將烘干后的雪菊粉在粉碎機(jī)中粉碎后過40目篩； (2)用石油醚對(duì)雪菊粉脫脂8小時(shí)并在50°C烘干2h； (3)乙醇浸潤(rùn):料液比按重量比1:40配置的70%乙醇提取液放置于4°C冰箱中靜置過夜； (4)預(yù)均質(zhì):使用均質(zhì)壓力為30MPa,均質(zhì)2次； (5)動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理:采用一定微射流壓力處理2次；提取壓力120MPa，提取溫度50°C，乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min ； (6)乙醇回流:以60%乙醇濃度，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度60 V，回流提取2次，離心并合并濾液，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，蒸發(fā)溫度30 °C,轉(zhuǎn)速40rpm ； (7)大孔樹脂純化:AB-8大孔樹脂純化最優(yōu)條件為原花青素上樣濃度為1.06mg/mL、上樣pH=6、上樣流速為2BV/h，用4倍柱床體積70%的乙醇以流速為2BV/h洗脫；經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，蒸發(fā)溫度30°C，轉(zhuǎn)速40rpm ;純化后昆侖雪菊原花青素的純度為66.76% ； (8)采用真空冷凍干燥，冷凝溫度一50°C，真空度<20Pa條件下制備獲得昆侖雪菊原花青素濃縮粉。
2.一種昆侖雪菊原花青素在延緩衰老中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/352GK104173401SQ201410365439
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】敬思群, 柴文杰 申請(qǐng)人:新疆大學(xué), 敬思群