一種多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米超分子材料【技術(shù)領(lǐng)域】，通過在現(xiàn)有的磷脂分子、膽固醇制備脂質(zhì)體囊泡的基礎(chǔ)上，通過添加合適比例的兩親性磺化杯[4]芳烴、制得了非共價(jià)結(jié)合、生物相容性好、穩(wěn)定性高，且可實(shí)現(xiàn)靶向傳輸和監(jiān)測跟蹤功能的脂質(zhì)體囊泡，該制備方法簡便，主、客體原料用量少，在癌癥藥物靶向運(yùn)輸領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法
[0001]【【技術(shù)領(lǐng)域】】
本發(fā)明屬于納米超分子材料【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種新型多功能脂質(zhì)體囊泡及其制備方法。
[0002]【【背景技術(shù)】】
近年來，多功能囊泡在生物技術(shù)、醫(yī)療診斷、藥物傳遞等領(lǐng)域備受關(guān)注。其主要原因是，囊泡具有和細(xì)胞膜相似的結(jié)構(gòu)，并且可以包載親水性分子于其內(nèi)腔，同時(shí)包載疏水性分子于其疏水膜層之中(J.Nicolas, S.Mura, D.Brambilia, N.Mackiewicz, P.Couvreur.Chem.Soc.Rev.2013, 42, 1147 - 1235; (2) M.Elsabahy, K.L.ffooley.Chem.Soc.Rev.2012，41，2545 - 2561.)。常見的功能化方法是通過將功能化基團(tuán)，例如靶向劑和熒光探針等，通過共價(jià)鍵連接在構(gòu)筑囊泡的兩親性分子上，所得的多功能囊泡不僅可用于生物成像，還可用于革巴向治療等藥物傳輸領(lǐng)域(F.Gu, L.Zhang, B.A.Teply, N.Mann, A.Wang, A.F.Radovic-Moreno, R.Langer, 0.C.Farokhzad.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 2008, 105, 2586 - 2591; (2) S.Mitragotri, J.Lahann.Adv.Mater.2012, 24,3717 - 3723; (3) L.Chen, X.Zhao, Y.Lin, Y.Huang, Q.Wang.Chem.Commun.2013,49，9678 - 9680.)。然而，該過程需要繁瑣的合成，會(huì)將有機(jī)試劑和有毒化合物引入囊泡載體，進(jìn)而影響材料的生物相容性。并且，如果改變功能基團(tuán)，往往需要重新進(jìn)行載體的合成，費(fèi)時(shí)費(fèi)力(W.Li, J.Du, K.Zheng, P.Zhang, Q.Hu, Y.Wang.Chem.Commun.2014,50，1579 - 1581.)。
[0003]超分子非共價(jià)修飾是除共價(jià)鍵手段外的另一種構(gòu)筑多功能囊泡的方法(S.Himmelein, V.Lewe, M.C.Stuart, B.J.Ravo0.Chem.Sc1.2014, 5, 1054 - 1058;
(2)E.Kim, D.Kim, H.Jung, J.Lee, S.Paul, N.Selvapalam, Y.Yang, N.Lim, C.G.Park, K.Kim.Angew.Chem.1nt.E d.2010, 49, 4405 - 4408.)。通過在囊泡構(gòu)筑過程中嵌入大環(huán)主體，使其表面富含主客體鍵合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過主客體相互作用使功能基團(tuán)以非共價(jià)的形式結(jié)合于囊泡表面從而實(shí)現(xiàn)囊泡的功能化(U.Kauscher, M.C.Stuart,P.Driicker, H.J.Galla, B.J.Ravo0.Langmuir 2013, 29, 7377 - 7383.)。該方法不僅避免了囊泡骨架的繁雜合成，而且可以方便快捷地引入不同種類功能基團(tuán)并實(shí)現(xiàn)載體的定量功能化。常用的超分子大環(huán)主體有環(huán)糊精、葫蘆脲和杯芳烴等。已報(bào)道的兩親性環(huán)糊精囊泡和葫蘆脲納米球水溶性很差，在水環(huán)境中無法實(shí)現(xiàn)長時(shí)間穩(wěn)定，限制了其在藥物傳輸領(lǐng)域的應(yīng)用。兩親性杯芳烴由于其良好的水溶性，近些年來在蛋白識(shí)別、生物傳感和基因轉(zhuǎn)染等領(lǐng)域倍受關(guān)注(S.Kolusheva, R.Zadmard, T.Schrader, R.Jelinek.J.Am.Chem.Soc.2006, 128，13592 - 13598.)。其中兩親性磺化杯芳烴由于其優(yōu)良的鍵合能力和生物相容性，在眾多杯芳烴衍生物中脫穎而出，但在脂質(zhì)體囊泡的制備中還鮮見報(bào)道。
[0004]【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析，提供一種多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法及功能化應(yīng)用。該囊泡由兩親性磺化杯[4]芳烴(SC4AB)、磷脂分子(DPPC)、膽固醇等組成，生物相容性好。兩親性磺化杯[4]芳烴 嵌入在囊泡表面，不僅提供了主客體鍵合位點(diǎn)，使囊泡可以鍵合陽離子熒光探針和靶向劑進(jìn)而實(shí)現(xiàn)功能化，而且由于磺化杯芳烴的嵌入，其磺酸根降低了囊泡表面電位從而在極大程度改善了脂質(zhì)體囊泡的穩(wěn)定性，其制備方法簡便，主、客體原料用量少。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種多功能脂質(zhì)體囊泡，其構(gòu)筑單元以磷脂分子(DPPC)和膽固醇為主，以兩親性磺化杯[4]芳烴(SC4AB)為輔，通過親疏水作用構(gòu)筑多功能脂質(zhì)體囊泡。兩親性磺化杯[4]芳烴在脂質(zhì)體囊泡表面提供了主客體鍵合位點(diǎn)，可用來結(jié)合陽離子熒光探針和靶向劑等功能化分子。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0006]一種所述多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法，步驟如下:
1)將DPPC和膽固醇按照物質(zhì)的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC終濃度為5mmol/L,混勻后55-60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小時(shí)；
2)向上述脂質(zhì)體薄膜加入與上述氯仿等體積的濃度為0.25~0.5 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下攪拌30分鐘，繼而水浴超聲30分鐘，最終使用220 nm濾器除去大顆粒脂質(zhì)體，即可制得多功能脂質(zhì)體囊泡。
[0007]上述脂質(zhì)體囊泡的應(yīng)用:
1、將熒光探針與囊泡溶液混合均勻，即可制得帶有熒光的脂質(zhì)體囊泡，該囊泡可通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)監(jiān)測和跟蹤。
[0008]2、將靶向劑與囊泡溶液混合均勻，即可制得對(duì)靶向癌細(xì)胞有靶向作用的脂質(zhì)體囊泡。該囊泡可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被靶向癌細(xì)胞攝入，實(shí)現(xiàn)靶向傳輸功能。
[0009]3、將熒光探針和靶向劑同時(shí)與囊泡溶液混合均勻，即可制得帶有熒光且對(duì)靶向癌細(xì)胞有靶向作用的脂質(zhì)體囊泡。該囊`泡可通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被靶向癌細(xì)胞攝入，實(shí)現(xiàn)靶向傳輸和監(jiān)測跟蹤的功能。
[0010]因此，本發(fā)明提供的多功能脂質(zhì)體囊泡可以應(yīng)用于癌癥藥物靶向運(yùn)輸領(lǐng)域。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明通過使用常見的磷脂分子、膽固醇和兩親性磺化杯[4]芳烴為主要組分即可制備出多功能脂質(zhì)體囊泡，該脂質(zhì)體囊泡為非共價(jià)結(jié)合、生物相容性好、穩(wěn)定性高，且可實(shí)現(xiàn)靶向傳輸和監(jiān)測跟蹤功能，該制備方法簡便，主、客體原料用量少，在癌癥藥物靶向運(yùn)輸領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0012]【【專利附圖】

【附圖說明】】
圖1為多功能脂質(zhì)體囊泡的結(jié)構(gòu)及功能基團(tuán)示意圖。
[0013]圖2為固定磷脂分子濃度，不同兩親性磺化杯[4]芳烴含量透光率曲線及450nm處透光率變化柱狀圖。
[0014]圖3為固定磷脂分子濃度，不同兩親性磺化杯[4]芳烴含量水和動(dòng)力學(xué)直徑變化圖。
[0015]圖4為固定磷脂分子濃度，不同兩親性磺化杯[4]芳烴含量溶液的照片。
[0016]圖5為多功能脂質(zhì)體囊泡功能化前后以及囊泡室溫儲(chǔ)存6個(gè)月后的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布圖。
[0017]圖6為普通脂質(zhì)體囊泡和多功能脂質(zhì)體囊泡的ζ電位數(shù)值以及加入甲基紫精客體后的ζ電位變化。
[0018]圖7為普通脂質(zhì)體和功能脂質(zhì)體囊泡吸附熒光探針客體后，透析介質(zhì)中熒光變化圖。
[0019]圖8為不同濃度兩親性磺化杯[4]芳烴和MCF-7細(xì)胞孵育兩天后細(xì)胞存活率圖。
[0020]圖9為多功能脂質(zhì)體囊泡吸附熒光分子及靶向劑后，與MCF-7細(xì)胞孵育6小時(shí)后的熒光共聚焦顯微鏡圖及其與對(duì)照組的對(duì)比。
[0021]【【具體實(shí)施方式】】
實(shí)施例1:
一種所述多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法，步驟如下:
1)將DPPC和膽固醇按照物質(zhì)的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC終濃度為5mmol/L,混勻后55-60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小時(shí)；
2)向上述脂質(zhì)體薄膜加入與上述氯仿等體積的濃度為0.25 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下攪拌30分鐘，繼而水浴超聲30分鐘，最終使用220 nm濾器除去大顆粒脂質(zhì)體，即可制得多功能脂質(zhì)體囊泡。
[0022]實(shí)施例2
一種所述多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法，步驟如下:
1)將DPPC和膽固醇按照物質(zhì)的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC終濃度為5mmol/L,混勻后55-60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小時(shí)；
2)向上述脂質(zhì)體薄膜加入與上述氯仿等體積的濃度為0.5 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下攪拌30分鐘，繼而水浴超聲30分鐘，最終使用220 nm濾器除去大顆粒脂質(zhì)體，即可制得多功能脂質(zhì)體囊泡。
[0023]對(duì)比例I
一種普通脂質(zhì)體囊泡的制備方法，步驟如下:
1)將DPPC和膽固醇按照物質(zhì)的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC終濃度為5mmol/L,混勻后55-60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小時(shí)；
2)向上述脂質(zhì)體薄膜加入與上述氯仿等體積的二次蒸餾水，在55-60°C下攪拌30分鐘，繼而水浴超聲30分鐘，最終使用220 nm濾器除去大顆粒脂質(zhì)體，即可制得普通脂質(zhì)體囊泡。
[0024]對(duì)比例2
一種混合脂質(zhì)體膠束的制備方法，步驟如下:
1)將DPPC和膽固醇按照物質(zhì)的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC終濃度為5mmol/L,混勻后55-60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小時(shí)；
2)向上述脂質(zhì)體薄膜加入與上述氯仿等體積的濃度為Immol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下攪拌30分鐘，繼而水浴超聲30分鐘，最終使用220 nm濾器除去大顆粒脂質(zhì)體，即可制得混合脂質(zhì)體膠束。
[0025]對(duì)上述實(shí)施例得到的脂質(zhì)體囊泡的檢測分析:
1、透光率檢測，通過測量上述所得脂質(zhì)體溶液在450nm處的透光率，得到如圖2所示結(jié)果:如圖所示，當(dāng)SC4AB含量超過10% (物質(zhì)的量比例)時(shí)，脂質(zhì)體溶液透光率明顯上升，表明脂質(zhì)體囊泡由于SC4AB過量而轉(zhuǎn)變?yōu)槟z束，這可通過動(dòng)態(tài)光散射和肉眼觀測進(jìn)行佐證。
[0026]2、水和動(dòng)力學(xué)直徑檢測，如圖3所示，當(dāng)SC4AB含量超過10% (物質(zhì)的量比例)時(shí)，脂質(zhì)體粒徑明顯減小，證明了脂質(zhì)體由空心囊泡轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)心膠束。[0027]3、溶液的照片，如圖4所示，當(dāng)SC4AB含量超過10% (物質(zhì)的量比例)時(shí),脂質(zhì)體溶液由渾濁變?yōu)槌吻?，同樣證明其囊泡結(jié)構(gòu)遭到破壞。
[0028]最后，對(duì)SC4AB含量為10%的多功能脂質(zhì)體囊泡進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布檢測，得到其平均粒徑為87.4 nm，如圖5所示。
[0029]實(shí)施例3
一種所述多功能脂質(zhì)體囊泡的功能衍生化方法，步驟如下:
將實(shí)施例2中制備得到的多功能脂質(zhì)體囊泡溶液稀釋10倍，并加入甲基紫精，其終濃度為0.05 mmol/L,混勻。
[0030]對(duì)比例3
將對(duì)比例I中制備得到的普通脂質(zhì)體囊泡溶液稀釋10倍，并加入甲基紫精，其終濃度為 0.05 mmol/L,混勻。
[0031]對(duì)實(shí)施例3和對(duì)比例3 ζ電位檢測，通過測量上述所得脂質(zhì)體溶液的ζ電位，得到如圖6所示結(jié)果:如圖所示，向多功能囊泡溶液中加入紫精，由于紫精和磺化杯芳烴之間的主客體作用，可使紫精吸附于囊泡表面，從而提高了囊泡的表面電位。然而，向普通脂質(zhì)體中加入紫精，表面電位并沒有明顯變化，這說明紫精是通過主客體作用鍵合與囊泡表面。同時(shí)，多功能囊泡較普通脂質(zhì)體囊泡，電位值很低(-26.82 mV)，這為囊泡提供了負(fù)電荷保護(hù)層從而提高囊泡的穩(wěn)定性。同時(shí)將多功能囊泡在室溫儲(chǔ)存6個(gè)月后，粒徑大小及分布均變化不大，如圖5所示，而普通脂質(zhì)體在一星期內(nèi)發(fā)生沉淀，證明磺化杯芳烴的加入極大地提升了脂質(zhì)體囊泡的 穩(wěn)定性。
[0032]實(shí)施例4
一種所述多功能脂質(zhì)體囊泡的熒光衍生化方法，步驟如下:
向?qū)嵤├?中制備得到的多功能脂質(zhì)體囊泡溶液中加入熒光探針分子(FITCPy)，其終濃度為0.05 mmol/L,混勻。
[0033]對(duì)比例4
向?qū)Ρ壤齀中制備得到的普通脂質(zhì)體囊泡溶液中加入熒光探針分子(FITCPy)，其終濃度為0.05 mmol/L,混勻。
[0034]對(duì)實(shí)施例4和對(duì)比例4進(jìn)行熒光檢測。通過對(duì)上述所得脂質(zhì)體溶液進(jìn)行透析，并測量透析介質(zhì)中FITCPy的熒光強(qiáng)度，得到如圖7所示結(jié)果:如圖所示，普通脂質(zhì)體與熒光探針混合后，通過透析，可以很快地將探針分子除去，即透析介質(zhì)中熒光快速上升；然而，含有磺化杯芳烴的多功能脂質(zhì)體與熒光探針混合后，通過透析，探針分子除去較慢，即透析介質(zhì)中熒光上升緩慢，說明熒光分子通過主客體作用與囊泡結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了囊泡的熒光功能化。
[0035]對(duì)兩親性磺化杯[4]芳烴進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，得到如圖8所示結(jié)果:如圖所示，不同濃度兩親性磺化杯[4]芳烴和MCF-7細(xì)胞(人體乳腺癌細(xì)胞)孵育兩天后細(xì)胞存活率均維持在100%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該兩親磺化杯芳烴是生物相容的，可被用于藥物傳輸領(lǐng)域。
[0036]實(shí)施例5
一種所述多功能脂質(zhì)體囊泡的熒光衍生化及靶向功能衍生化方法，步驟如下:
向?qū)嵤├?中制備得到的多功能脂質(zhì)體囊泡溶液中加入熒光探針分子(FITCPy)，其終濃度為0.25 mmol/L，和靶向劑分子(BtPy)，其終濃度為0.25 mmol/L，混勻。
[0037]對(duì)實(shí)施例5進(jìn)行細(xì)胞成像能力檢測，通過觀察上述所得多功能脂質(zhì)體溶液與靶向癌細(xì)胞孵育6小時(shí)后，細(xì)胞中FITCPy的熒光強(qiáng)度，得到如圖9所示結(jié)果:
圖9為多功能脂質(zhì)體囊泡吸附熒光分子及靶向劑后，與MCF-7細(xì)胞孵育6小時(shí)后的熒光共聚焦顯微鏡圖及其與對(duì)照組的對(duì)比。如圖所示，功能化的囊泡與MCF-7細(xì)胞孵育6小時(shí)后(PCB+BtPy組)，細(xì)胞中呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光；作為對(duì)比試驗(yàn)，當(dāng)缺乏靶向劑時(shí)，細(xì)胞中熒光很弱(PCB組)；而如果先用生物素飽和細(xì)胞表面靶向位點(diǎn)，再加入功能化的囊泡(生物素+PCB+BtPy組)，則細(xì)胞中熒光同樣很弱；如果細(xì)胞孵育時(shí)只加熒光探針分子，則細(xì)胞中熒光仍然很弱。以上結(jié)果表明，經(jīng)過功能化的囊泡，可以通過表面鍵合熒光分子使其具有熒光性能；當(dāng)鍵合靶向劑之后，可使囊泡通過受體誘導(dǎo)的內(nèi)吞作用被腫瘤細(xì)胞充分?jǐn)z入。綜上所述，該囊泡可通過主客體作用將功能化客體經(jīng)過簡單混合吸附于囊泡表面從而實(shí)現(xiàn)囊泡的功能衍生化。
【權(quán)利要求】
1.一種多功能脂質(zhì)體囊泡的制備方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: 1)將DPPC和膽固醇按照物質(zhì)的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC終濃度為5mmol/L,混勻后55-60°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小時(shí)； 2)向上述脂質(zhì)體薄膜加入與上述氯仿等體積的濃度為0.25~0.5 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下攪拌30分鐘，繼而水浴超聲30分鐘，最終使用220 nm濾器除去大顆粒脂質(zhì)體，即可制得多功能脂質(zhì)體囊泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能脂質(zhì)體囊泡的一種應(yīng)用，其特征在于，本發(fā)明提供的多功能脂質(zhì)體囊泡 應(yīng)用于癌癥藥物靶向運(yùn)輸領(lǐng)域。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK103877024SQ201410156810
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】劉育, 王以軒, 郭東升, 王鯤鵬 申請(qǐng)人:南開大學(xué)