一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從山楂葉中同時制備總?cè)圃碥仗崛∥锖涂傸S酮提取物的方法。將山楂葉原料粉碎，用乙醇水混合溶液提取，提取物通過大孔樹脂和聚酰胺柱色譜進(jìn)行分離純化，得到總?cè)圃碥仗崛∥锛翱傸S酮提取物。本發(fā)明方法具有工藝簡單，操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，成本低，污染少，并可同時得到高純度的總?cè)圃碥蘸涂傸S酮等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥制藥領(lǐng)域，尤其涉及從山楂葉中同時制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]山 楂葉為薔微科山楂屬植物山里紅(Crataeguspinnatif ida Bge.var.majorN.E.Br)或山楂(C.pinnatif ida Bge.)的干燥葉，具有消食健胃，活血化瘀止癢，斂瘡，降血壓的功效。臨床上用于防治心腦血管疾病如高血壓，高血脂，冠心病，心絞痛，腦供血不足等癥。研究表明山楂葉中的三萜類成分和總黃酮成分均為山楂葉的活性成分。黃酮類成分具有擴(kuò)張血管，改善冠狀動脈供血，抗凝血等作用。三萜類成分除具有降血壓，降血脂，改善心肌缺血等的作用外，還具有抗炎，抗癌，抗病毒等作用。
[0003]目前，關(guān)于單一提取山楂葉中的總黃酮的專利較多，如專利CN1436785A提供了一種用大孔樹脂提取山楂葉中總黃酮的方法，得到含量為90%的總黃酮提取物；專利CN1839957A提供了一種用聚酰胺從山楂葉中提取注射用總黃酮的方法，提取物中總黃酮的含量為80%等。此外，還有關(guān)于從山楂葉中提取總黃酮和總酚酸的總提物的專利，如專利CN1565464A提供一種通過兩次大孔樹脂柱層析純化后得到含有總黃酮和總酚酸的提取物的方法，其中總酚酸的含量為50%~90%，總黃酮的含量為10%~40%。專利CN102755405A提供了一種用水提取的方法從山楂葉中獲得含有總黃酮、多糖和有機(jī)酸三種成分的總提物的方法。
[0004]上述方法多以獲得山楂葉中的總黃酮為主，有些還可同時獲得酚酸，多糖和有機(jī)酸，但卻沒有從山楂葉中獲得總?cè)圃碥盏姆椒?，造成了三萜類有效成分的流失。本發(fā)明提供了一種從山楂葉中同時制備總黃酮和總?cè)圃碥盏男路椒?，不僅保留了黃酮類有效成分還使三萜類有效成分得以保存，該方法簡便易行，分離效果好，避免有效成分損失浪費(fèi)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]酶標(biāo)儀是酶聯(lián)檢測的反應(yīng)儀器，近年來，也廣泛用于物質(zhì)的含量測定。酶標(biāo)儀在物質(zhì)的含量測定方面有與紫外分光光度計(jì)相同的理論基礎(chǔ)，都遵循朗伯比爾定律。酶標(biāo)儀的樣品池如96孔板多是由聚苯乙烯制成，在400nm下有較強(qiáng)的紫外吸收，會對樣品測定產(chǎn)生干擾，因此酶標(biāo)儀的檢測波長通常在400nm以上。與紫外分光光度法相比，用酶標(biāo)儀進(jìn)行含量測定其優(yōu)點(diǎn)在于:可多孔重復(fù)，準(zhǔn)確性高，測試間隔短，時效性好，樣品獨(dú)立測試不用一個比色杯重復(fù)使用避免不同樣品相互干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從山楂葉中同時制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法。此發(fā)明目的可通過以下說明實(shí)現(xiàn)。
[0007](I)將山楂葉原料粉碎，用乙醇水混合溶液(30%~80%)提取，合并提取液減壓濃縮至無醇味；[0008](2)將步驟(1)的濃縮物用水混懸，用大孔樹脂吸附后，用30%~80%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；
[0009](3)將步驟(2)的濃縮物用水稀釋至濃度為20%~30%，靜置，過濾沉淀；
[0010](4)取上清液進(jìn)行80~400目的聚酰胺柱色譜，先用20%~50%乙醇洗脫I~3個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥仗崛∥锔稍锓勰?br> [0011](5)再用50%_90%乙醇洗脫I~5個保留體積，收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末；
[0012](6)用酶標(biāo)儀測定總?cè)圃碥仗崛∥镏性碥疹惓煞值暮?，以熊果酸為對照品?%香草醒一冰醋酸和高氯酸為顯色劑，檢測波長為548nm，測得總皂苷含量為80%以上；
[0013](7)用酶標(biāo)儀測定總黃酮提取物中總黃酮類成分的含量，以蘆丁為對照品，硝酸鋁為顯色劑，檢測波長為510nm，測得總黃酮含量為90%以上。
[0014]步驟(1)中的乙醇水混合溶液的用量是原料的8-10倍，濃度優(yōu)選50%~80%，更優(yōu)選70%~80%。提取2-3次。所述提取方法為超聲提取，微波輔助提取或閃式提取。
[0015]步驟(2)中大孔樹脂類型選自DM301、NKA-9 型、AB-8、D101、DM130、DM_18、D312 型弱極性或中極性大孔樹脂。
[0016]步驟(2)中洗脫濃度優(yōu)選為40~60%，優(yōu)選50%。
[0017]步驟(3)中優(yōu)選稀釋濃度為30%。
[0018]步驟(4)中乙醇濃度優(yōu)選20%~25%，聚酰胺柱色譜為80~400目，優(yōu)選200~
400 目。
[0019]步驟(5 )中乙醇濃度優(yōu)選50%~70%，優(yōu)選60%。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0021](1)采用超聲提取、微波輔助提取、閃式提取等提取方法使提取更完全，更快速，同時避免了有效成分的受熱分解。
[0022](2)同時得到了總?cè)圃碥仗崛∥锖涂傸S酮提取物，并且提高了皂苷和黃酮的含量，使苷類成分含量在80%以上，黃酮類成分含量在90%以上。
[0023](3)制備工藝簡單易行，實(shí)用性強(qiáng)；大孔樹脂和聚酰胺價格便宜，可再生和反復(fù)利用，成本低；用乙醇-水作為溶劑污染少，也避免了用正丁醇等溶劑萃取時的溶劑殘留。
[0024](4)用酶標(biāo)儀進(jìn)行含量測定，速度快，省時簡便，消耗試劑少。
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]將300g山楂葉原料粉碎，用10倍量的80%乙醇，微波輔助提取2次，每次15min，功率為600W，合并提取液減壓濃縮至無醇味。用AB-8大孔樹脂吸附后，用80%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400聚酰胺柱色譜，先用50%乙醇洗脫I個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?.34g ;收率為0.78%，再用80%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末 24.15g ;收率為 8.05%。[0028]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為83%。
[0029]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為93%。
[0030]實(shí)施例2
[0031]將300g山楂葉原料粉碎，用8倍量的30%乙醇，微波輔助提取2次，每次15min，功率為600W，合并提取液減壓濃縮至無醇味。用AB-8大孔樹脂吸附后，用30%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400聚酰胺柱色譜，先用20%乙醇洗脫I個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?.1Og ;收率為0.7%，再用50%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末 23.25g ;收率為 7.75%。
[0032]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為81%。
[0033]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為90%。·
[0034]實(shí)施例3
[0035]將Ikg山楂葉原料粉碎，用10倍量的70%乙醇，超聲提取3次，每次20min，合并提取液減壓濃縮至無醇味。用DlOl大孔樹脂吸附后，用80%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400目聚酰胺柱色譜，先用20%乙醇洗脫I個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?.2g ;收率為0.92%，再用60%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末89.5g ;收率為8.95%。
[0036]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為81%。
[0037]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為90%。
[0038]實(shí)施例4
[0039]將Ikg山楂葉原料粉碎，用8倍量的30%乙醇，超聲提取3次，每次20min，合并提取液減壓濃縮至無醇味。用DlOl大孔樹脂吸附后，用30%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400目聚酰胺柱色譜，先用20%乙醇洗脫I個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?.5g ;收率為0.95%，再用80%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末89.Sg ;收率為8.98%。
[0040]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為80.2%。
[0041]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為89.3%ο
[0042]實(shí)施例5
[0043]將5kg山楂葉原料粉碎，用10倍量的75%乙醇，閃式提取2次，每次20min，合并提取液減壓濃縮至無醇味。將提取物用AB-8大孔樹脂吸附后，用80%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400目聚酰胺柱色譜，先用20%乙醇洗脫2個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?7.5g ;收率為0.95%，再用60%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末456g ;收率為9.12%。
[0044]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為85%。
[0045]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為91%。
[0046]實(shí)施例6
[0047]將5kg山楂葉原料粉碎，用8倍量的40%乙醇，閃式提取2次，每次20min，合并提取液減壓濃縮至無醇味。將提取物用AB-8大孔樹脂吸附后，用30%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400目聚酰胺柱色譜，先用50%乙醇洗脫2個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?8.5g ;收率為0.97%，再用80%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末460g;收率為9.2%ο
[0048]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為83%。
[0049]取總黃酮提取物 適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為90%。
[0050] 對比例I
[0051 ] 將Ikg山楂葉原料粉碎，用10倍量的80%乙醇，回流提取3次，每次3h，合并提取液減壓濃縮至無醇味。用DlOl大孔樹脂吸附后，用80%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400目聚酰胺柱色譜，先用20%乙醇洗脫I個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?.7g ;收率為0.97%，再用60%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末120.3g ;收率為12.03%。
[0052]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為68%。
[0053]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為75%。
[0054]對比例2
[0055]將Ikg山楂葉原料粉碎，用8倍量的30%乙醇，回流提取3次，每次3h，合并提取液減壓濃縮至無醇味。用DlOl大孔樹脂吸附后，用30%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇至無醇味；將濃縮物用水稀釋至濃度為30%，靜置，過濾沉淀；取上清液進(jìn)行200~400目聚酰胺柱色譜，先用50%乙醇洗脫I個保留·體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥疹惓煞痔崛∥锔稍锓勰?.7g ;收率為0.97%，再用70%乙醇洗脫4個保留體積，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末122.3g ;收率為12.23%。
[0056]取總?cè)圃碥仗崛∥镞m量，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml,60°C水浴15min，冷卻后加冰醋酸5.0ml，搖勻，以相應(yīng)的溶液為空白。在548nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得皂苷含量為69%。
[0057]取總黃酮提取物適量，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，搖勻，放置6min ;精密加4%氫氧化鈉溶液2ml，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的溶液為空白。在510nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，測得黃酮含量為76%。
【權(quán)利要求】
1.一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (O取山楂葉原料，用30%~80%乙醇水混合溶液提取，合并提取液，減壓濃縮至無醇味； (2)將步驟(1)濃縮物，經(jīng)過大孔吸附樹脂柱色譜，用30%~80%乙醇進(jìn)行洗脫，減壓濃縮洗脫液至無醇味； (3)將步驟(2)的濃縮物用水稀釋至濃度為20%~30%，靜置，過濾沉淀； (4)取上清液進(jìn)行80~400目的聚酰胺柱色譜，先用20%~50%乙醇洗脫I~3個保留體積，收集洗脫液，減壓濃縮至膏狀，噴霧干燥得總?cè)圃碥仗崛∥锔稍锓勰? (5)再用50%-90%乙醇洗脫I~5個保留體積，收集乙醇洗脫液,減壓回收乙醇至膏狀，噴霧干燥得到總黃酮提取物干燥粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:步驟(1)中所述提取方法為超聲提取，微波輔助提取或閃式提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:步驟(2)中大孔樹脂類型選自DM301、NKA-9型、AB-8、D101、DM130、DM_18、D312型弱極性或中極性大孔樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:步驟(1)中的乙醇水混合溶液濃度為50%~80%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:步驟(2)中洗脫濃度為40~60%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:步驟(4)中乙醇濃度為20%~25%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:步驟(5)中乙醇濃度優(yōu)選50%~70%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:聚酰胺柱色譜為200~400目。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從山楂葉中制備總?cè)圃碥蘸涂傸S酮的方法，其特征是:用酶標(biāo)儀測定總?cè)圃碥仗崛∥镏性碥疹惓煞值暮繛?0%以上，黃酮含量為90%以上。
【文檔編號】A61K36/734GK103735667SQ201410049110
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年2月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月12日
【發(fā)明者】劉春婷, 李玲芝, 宋少江, 彭纓, 黃肖霄, 劉慶博 申請人:沈陽藥科大學(xué)