一種破壞煙曲霉生物膜的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種破壞煙曲霉生物膜的方法，包括制備藥物、收集菌株、制備載體、制備孢子懸液、藥物敏感試驗(yàn)、制備煙曲霉生物膜載體、藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用和結(jié)晶紫半定量，本發(fā)明利用金銀花提取物的綠原酸破壞煙曲霉生物膜，用亞抑菌濃度的綠原酸破壞早期和成熟期的煙曲霉生物膜，本發(fā)明的亞抑菌濃度的綠原酸對(duì)早期及成熟期煙曲霉生物膜均具有破壞作用，破壞效果呈現(xiàn)出濃度依賴性。
【專利說明】一種破壞煙曲霉生物膜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及煙曲霉生物膜，具體涉及一種破壞煙曲霉生物膜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物膜是一種附著在組織的表面、由自身產(chǎn)生的胞外基質(zhì)包圍的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，是相對(duì)于游離狀態(tài)的菌細(xì)胞而言的另一種微生物的生存方式。近年來研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉能在體內(nèi)外形成生物膜，由于其菌絲被胞外基質(zhì)所包裹，因此得以逃避抗真菌藥和機(jī)體免疫的傷害，從而能形成持續(xù)的感染源造成慢性而且耐藥的感染。由煙曲霉導(dǎo)致的侵襲性曲霉病是免疫低下患者主要的死亡原因之一，死亡率達(dá)到30-100%，目前治療侵襲性曲霉病的常用抗真菌藥物對(duì)煙曲霉生物膜效果欠佳，主要由于其胞外基質(zhì)對(duì)煙曲霉菌絲細(xì)胞的保護(hù)，使得這些抗真菌藥的敏感性下降，研究報(bào)道顯示，生物膜中的煙曲霉菌比浮游菌耐藥性高幾十至上千倍，并且生物膜越成熟，胞外基質(zhì)越致密，煙曲霉生物膜就會(huì)越耐藥。如果能夠破壞生物膜，使胞外基質(zhì)減少甚至完全清除，使生物膜內(nèi)的菌細(xì)胞失去胞外基質(zhì)的保護(hù)而變成游離狀態(tài)的菌細(xì)胞，那么這些菌的耐藥性將會(huì)減低，目前尚未發(fā)現(xiàn)能破壞煙曲霉生物膜的藥物，因此治療煙曲霉生物膜相關(guān)感染成為臨床難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供一種破壞煙曲霉生物膜的方法，包括制備藥物、收集菌株、制備載體、制備孢子懸液、藥物敏感試驗(yàn)、制備煙曲霉生物膜載體、藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用和結(jié)晶紫半定量，其特征在于，用金銀花提取物的綠原酸破壞煙曲霉生物膜，具體步驟如下:
1)制備藥物取400~500mg綠原酸用3~6ml100%的二甲亞砜溶解，配制成濃度為102400 μ g/ml 的溶液，于-20°C ~_25°C儲(chǔ)存；
2)收集菌株收集煙曲霉菌株，質(zhì)控菌株為ATCC22019近平滑念珠菌；
3)制備載體將直徑為1(T15mm玻璃細(xì)胞爬片進(jìn)行高溫高壓滅菌，作為載體；
4)制備孢子懸液將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于35~37°C生化培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)蘇，后轉(zhuǎn)至另一個(gè)PDA培養(yǎng)皿并置于35~37°C生化培養(yǎng)箱活化:1-5天后，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用2(T30ml MOPS緩沖的RPM1-1640重懸孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，并用RPM1-1640液體培養(yǎng)液調(diào)整濃度為f 3X IO6.孢子?π1，再用RPM1-1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液；
5)藥物敏感試驗(yàn)微量液基稀釋法，在無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I至第10孔加入步驟4)制備的孢子懸液，再將步驟I)制備的綠原酸置于無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I至第10孔，第I孔加入量為100 μ 1，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟4)制備孢子懸液的生長對(duì)照孔，第12孔為MOPS緩沖的RPM1-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37°C培養(yǎng)48h，獲得綠原酸的最低抑菌濃度MIC ;最低抑菌濃度(MIC)的判定:肉眼觀察判斷終點(diǎn)，96培養(yǎng)板各個(gè)孔充分混勻之后與生長對(duì)照孔比較，100%生長抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為此藥物的MIC;
6)制備煙曲霉生物I吳載體
A:早期模型建立將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于35~37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)活化3飛天，用5~IOml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用2(T25ml MOPS緩沖的RPM1-1640重懸孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，并用RPM1-1640液體培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1~5X IO5.孢子.Hir1Jf f 2ml孢子懸液放在步驟3)制備的載體上，靜置于35~37°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h時(shí)載體上為早期煙曲霉生物膜；
B:成熟期模型建立將步驟A制備的煙曲霉生物膜培養(yǎng)48h時(shí)載體上為成熟期煙曲霉生物膜；
7)藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用將步驟6)制備的兩種模型煙曲霉生物膜載體用無菌磷酸鹽緩沖液漂洗，后放入新的無菌載體中，按步驟5)獲得的綠原酸最低抑菌濃度MIC，加入亞抑菌濃度的綠原酸，每個(gè)孔加入量為1ml，空白組為MOPS緩沖的RPM1-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37°C培養(yǎng)48飛0h，后取出載體，進(jìn)行結(jié)晶紫半定量；
8)結(jié)晶紫半定量吸取步驟7)載體表面浮游菌液，室溫干燥，取f2ml1%結(jié)晶紫染色2(T30min，用磷酸鹽緩沖液洗脫未結(jié)合的結(jié)晶紫，室溫干燥，用f2ml 95%乙醇脫水3飛min，取100-110 μ I洗脫液于96孔酶標(biāo)板中，在波長為570nm處測各孔酶標(biāo)值。
[0004]掃描電鏡觀察從24孔板中取出載體后按下面步驟操作:(1)2.5%戊二醛固定2小時(shí)；(2) 50%、60%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，每個(gè)濃度脫水10分鐘；(3)臨界干燥儀干燥；(4)真空噴鍍金粉；(5)觀察和攝片，條件:電壓20kV，放大倍數(shù)2000倍。
[0005]以上所述步驟7)藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用，靜置培養(yǎng)48_50h過程中，間隔24h用與原孔中相同的藥物換液。
[0006]以上所述亞抑菌濃度的綠原酸濃度為128yg/mfl024yg/ml，所述綠原酸為400^450mgo
[0007]以上所述步驟5)加入藥物的量為100 μ 1，靜置于35~36°C培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步和顯著的特點(diǎn)是: 本發(fā)明建立了早期和成熟期的煙曲霉生物膜，再以亞抑菌濃度的綠原酸作用，通過結(jié)晶紫半定量及掃描電鏡可以看出，綠原酸可以破壞早期和成熟期的煙曲霉生物膜，使生物膜中的胞外基質(zhì)減少，并且綠原酸的濃度越大效果越明顯。由于本發(fā)明使用的綠原酸菌是亞抑菌濃度，該濃度的綠原酸對(duì)生物膜中的菌細(xì)胞并無殺傷作用，但是能夠破壞煙曲霉生物膜中已經(jīng)形成的胞外基質(zhì)，使生物膜中的菌細(xì)胞失去胞外基質(zhì)的保護(hù)而變成浮游菌，從而讓煙曲霉的耐藥性降低。
[0009]綠原酸能破壞煙曲霉生物膜，使生物膜狀態(tài)的煙曲霉變成浮游菌的作用是目前臨床上所用抗真菌藥不具備的，綠原酸破壞生物膜的作用為臨床上能解決由于生物膜引起的耐藥問題提供基礎(chǔ)，展現(xiàn)了其控制煙曲霉生物膜造成的相關(guān)感染的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明實(shí)施例2早期及成熟期煙曲霉生物膜掃描電鏡觀察(X 2000倍) A-24h空白組，B-24h 512 μ g/ml的綠原酸組，C_24h 1024 μ g/ml的綠原酸組，D-48h空白組，E-48h 512 μ g/ml的綠原酸組，F(xiàn)_48h 1024 μ g/ml的綠原酸組。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
1.制備抗真菌藥物取400mg綠原酸(國家食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-201314)用3~5ml 100%的二甲亞砜溶解，配成濃度為102400 μ g/ml的溶液，分裝后于_20°C儲(chǔ)存。
[0012]2.收集菌株于2012年9月到2013年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室收集到的30個(gè)煙曲霉菌株。質(zhì)控菌株為ATCC22019近平滑念珠菌，獲贈(zèng)于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室。
[0013]3.制備載體玻璃細(xì)胞爬片，直徑13_ (海門市盛邦實(shí)驗(yàn)器材有限公司)，高溫高壓滅囷后備用。
[0014]4.試劑和器材馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA (北京路橋)、M0PS (Sigma)、RPM1-1640粉(Gibco)、二甲亞砜(Sigma)、無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning)、生化培養(yǎng)箱(常州市偉嘉儀器制造有限公司，型號(hào):SPX-250)、生物安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào):BHC-1300 II A/B2)，掃 描電鏡(日立，S-3400N)。
[0015]5.制備孢子懸液將步驟2收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于37°C生化培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)蘇，再轉(zhuǎn)種到另一個(gè)PDA培養(yǎng)皿并置于37°C生化培養(yǎng)箱活化3天后，用5ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用20ml MOPS緩沖的RPM1-1640重懸孢子，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整濃度為I X IO6.孢子.mr1，再用RPM1-1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液。
[0016]6.藥物敏感試驗(yàn)微量液基稀釋法，在無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I至第10孔加入步驟4)制備的孢子懸液，再將步驟I制備的綠原酸置于無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I至第10孔，第I孔加入量為100 μ 1，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟5制備孢子懸液的生長對(duì)照孔，第12孔為MOPS緩沖的RPM1-1640液體培養(yǎng)基，靜置于37°C培養(yǎng)48h ；
7.最低抑菌濃度(MIC)的判定肉眼觀察判斷終點(diǎn):96培養(yǎng)板各個(gè)孔充分混勻之后與生長對(duì)照孔比較，100%生長抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為此藥物的MIC。
[0017]8.早期和成熟期煙曲霉生物膜模型建立以步驟3的玻璃細(xì)胞爬片作為載體，將步驟2收集的煙曲霉菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平皿上，置于37°C培養(yǎng)，活化3天之后用5ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，20ml MOPS緩沖的RPM1-1640重懸孢子，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為l~5X105/ml，將Iml孢子懸液加入24孔板中的無菌玻璃細(xì)胞爬片上，靜置于37°C生化培養(yǎng)箱中孵育，每日用MOPS緩沖的RPM1-1640換液。培養(yǎng)至24h時(shí)載體上為早期煙曲霉生物膜，48h時(shí)載體上為成熟期煙曲霉生物膜。
[0018]9.本發(fā)明所用藥物濃度空白組為MOPS緩沖的1640液體培養(yǎng)基，綠原酸組分為2個(gè)組，除了 MOPS緩沖的1640液體培養(yǎng)基，其中還分別含有亞抑菌濃度的1024 μ g/ml和512 μ g/ml的綠原酸。
[0019]10.藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用于建模的第24、48h的載體用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗后放入新的24孔板中，按步驟11的濃度加入藥物，每個(gè)孔加入1ml，靜置于37°C培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，期間每24h用相同的藥物換液。于藥物作用48h后，取出載體，分別行結(jié)晶紫半定量和掃描電鏡觀察。
[0020]11.結(jié)晶紫半定量用槍頭取磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗步驟12載體表面浮游菌，載體室溫干燥后，取Iml I %結(jié)晶紫染色20min，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗脫未結(jié)合的結(jié)晶紫，室溫干燥，Iml 95%乙醇脫色3min，取100 μ I洗脫液置于96孔酶標(biāo)板中，在波長為570nm處測各孔酶標(biāo)值。以上實(shí)驗(yàn)，每組4個(gè)標(biāo)本，均獨(dú)立重復(fù)3次。
[0021]12.掃描電鏡觀察從步驟12制備的24孔板中取出載體后按下面步驟操作:(1)
2.5%戊二醛固定2小時(shí)；(2)50%、60%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，每個(gè)濃度脫水10分鐘；
(3)臨界干燥儀干燥；(4)真空噴鍍金粉；(5)觀察和攝片，條件:電壓20kV，放大倍數(shù)2000倍。
[0022]實(shí)施例2
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.藥物的MIC受試煙曲霉菌株對(duì)綠原酸的MIC為> 1024 μ g/ml。
[0023]2.綠原酸對(duì)煙曲霉生物膜的破壞作用各個(gè)組的藥物作用48h后，結(jié)晶紫半定量結(jié)果顯示，無論是24h還是48h的煙曲霉生物膜，不同濃度的綠原酸在作用48h后，其OD57tl均比空白組降低0°< 0.05)，其中其中1024μ g/ml的綠原酸組比512 μ g/ml的綠原酸組降低更明顯，見表1 。掃描電鏡顯示，無論是24h還是48h的煙曲霉生物膜的空白組均可見濃密的胞外基質(zhì)包裹住菌絲，菌絲僅隱約可見，而綠原酸組則可以清晰的見到菌絲的形態(tài)和分布情況，僅殘留少許胞外基質(zhì)包繞菌絲，其中1024 μ g/ml的綠原酸組比512 μ g/ml的綠原酸組的胞外基質(zhì)更少，見圖1。
[0024]表1早期及成熟期煙曲霉生物膜結(jié)晶紫半定量的OD57ci值(mean土SD)
【權(quán)利要求】
1.一種破壞煙曲霉生物膜的方法，包括制備藥物、收集菌株、制備載體、制備孢子懸液、藥物敏感試驗(yàn)、制備煙曲霉生物膜載體、藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用和結(jié)晶紫半定量，其特征在于，用金銀花提取物的綠原酸破壞煙曲霉生物膜，具體步驟如下: 1)制備藥物取400~500mg綠原酸用3~6ml100%的二甲亞砜溶解，配制成濃度為102400 μ g/ml 的溶液，于-20°C ~_25°C儲(chǔ)存； 2)收集菌株收集煙曲霉菌株,質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌； 3)制備載體將直徑為1(T15mm玻璃細(xì)胞爬片進(jìn)行高溫高壓滅菌，作為載體； 4)制備孢子懸液將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于35~37°C生化培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)蘇，后轉(zhuǎn)至另一個(gè)PDA培養(yǎng)皿并置于35~37°C生化培養(yǎng)箱活化3飛天后，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用2(T30ml MOPS緩沖的RPM1-1640重懸孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，并用RPM1-1640液體培養(yǎng)液調(diào)整濃度為f 3X IO6.孢子?ml-1，再用RPM1-1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液； 5)藥物敏感試驗(yàn)微量液基稀釋法，在無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I至第10孔加入步驟4)制備的孢子懸液，再將步驟I)制備的綠原酸置于無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I至第10孔，第I孔加入量為100 μ 1，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟4)制備孢子懸液的生長對(duì)照孔， 第12孔為MOPS緩沖的RPM1-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37°C培養(yǎng)48h，獲得綠原酸的最低抑菌濃度MIC ； 6)制備煙曲霉生物I吳 載體 A:早期模型建立將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于35~37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)活化3飛天，用5~IOml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用2(T25ml MOPS緩沖的RPM1-1640重懸孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，并用RPM1-1640液體培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1~5X IO5.孢子.Hir1Jf f 2ml孢子懸液放在步驟3)制備的載體上，靜置于35~37°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h時(shí)載體上為早期煙曲霉生物膜； B:成熟期模型建立將步驟A制備的煙曲霉生物膜培養(yǎng)48h時(shí)載體上為成熟期煙曲霉生物膜； 7)藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用將步驟6)制備的兩種模型煙曲霉生物膜載體用無菌磷酸鹽緩沖液漂洗，后放入新的無菌載體中，按步驟5)獲得的綠原酸最低抑菌濃度MIC，加入亞抑菌濃度的綠原酸，每個(gè)孔加入量為1ml，空白組為MOPS緩沖的RPM1-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37°C培養(yǎng)48飛0h，后取出載體，進(jìn)行結(jié)晶紫半定量； 8)結(jié)晶紫半定量吸取步驟7)載體表面浮游菌液，室溫干燥，取f2ml1%結(jié)晶紫染色2(T30min，用磷酸鹽緩沖液洗脫未結(jié)合的結(jié)晶紫，室溫干燥，用f2ml 95%乙醇脫水3飛min，取100-110μ I洗脫液于96孔酶標(biāo)板中，在波長為570nm處測各孔酶標(biāo)值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述步驟7)藥物對(duì)煙曲霉生物膜作用，靜置培養(yǎng)48飛Oh過程中，間隔24h用與原孔中相同藥物換液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述亞抑菌濃度的綠原酸濃度為128 μ g/ml~1024 μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述綠原酸為400^450mgo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述步驟5)加入藥物的量為100 μ 1，靜置 于35~36°C培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】A61P31/10GK103698515SQ201310720517
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】陳一強(qiáng), 黃宏, 孔晉亮 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)