豬btg2基因在抗prrs病毒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的新功能，具體提供了豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其是通過BTG2基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。本發(fā)明還提供了利用BTG2基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法，以及制備過表達(dá)BTG2基因的克隆胚胎的方法。
【專利說明】豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的新功倉泛。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，俗稱“藍(lán)耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,該病毒是巢狀病毒目動(dòng)脈炎病毒科的一個(gè)成員，同屬的病毒還有馬動(dòng)脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎和母豬流產(chǎn)木乃伊胎等，每年對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2007年在中國爆發(fā)了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴(kuò)散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實(shí)是由一種高致病性的藍(lán)耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì)胞，現(xiàn)在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應(yīng)答，體液免疫不能及時(shí)產(chǎn)生有效的中和抗體，而且會(huì)形成抗體依賴的病毒增強(qiáng)效應(yīng)，最終導(dǎo)致免疫抑制和持續(xù)感染。由于該病毒的突變率極高，傳統(tǒng)疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種與抗藍(lán)耳病相關(guān)的新基因BTG2，及其通過對BTG2基因進(jìn)行過表達(dá)，從而抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]本發(fā)明首先提供了`豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其是通過BTG2基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
[0006]本發(fā)明還提供了一種過表達(dá)BTG2基因的載體。
[0007]作為優(yōu)選，所述載體為導(dǎo)入BTG2基因⑶S序列的pCMV-Myc-N載體。
[0008]本發(fā)明還提供了含有所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
[0009]進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為除胚胎細(xì)胞外的豬體細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明還提供了一種制備克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
[0011]本發(fā)明還提供了利用BTG2基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法，所述方法為通過對豬的BTG2基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，BTG2表達(dá)量高的豬比BTG2表達(dá)量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:
[0013]本發(fā)明所鑒定的與抗藍(lán)耳病相關(guān)的新基因BTG2 (B-cell translocation gene2),有研究表明BTG2具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的作用。本發(fā)明人首次利用生物信息學(xué)結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法，證明了 BTG2具有抑制PRRS病毒復(fù)制的作用。
[0014]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新的抑制PRRSV復(fù)制的基因BTG2可以有以下兩個(gè)用途:[0015]1.分析表明，相對于沒有過表達(dá)BTG2基因的細(xì)胞，過表達(dá)BTG2基因的細(xì)胞可以顯著抑制PRRS病毒的復(fù)制，因此，可以通過對豬的BTG2基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，BTG2表達(dá)量高的豬可能會(huì)比BTG2表達(dá)量低的豬更加抗PRRSV的感染，從而達(dá)到根據(jù)BTG2基因的表達(dá)量高低來篩選抗PRRSV的豬。
[0016]2.可以利用轉(zhuǎn)基因等基因工程學(xué)的方法，使得BTG2基因在豬中的表達(dá)量升高，從而得到BTG2表達(dá)量高的豬，進(jìn)而培育出抗PRRSV復(fù)制的豬。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的BTG2在通城豬和長白豬感染PRRSV的第O天，第3天，第5天和第7天肺組織中的表達(dá)模式和相對表達(dá)量；橫坐標(biāo)代表時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表RPKM (相對表達(dá)量)。
[0018]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中原始載體pCMV-Myc-N的載體圖譜。
[0019]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中MARC145細(xì)胞攻毒實(shí)驗(yàn)后24小時(shí)PRRSV的拷貝數(shù)；橫坐標(biāo)代表對照組和攻毒組；縱坐標(biāo)代表PRRSV 0RF7的相對表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0021]實(shí)施例1利用分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)方法發(fā)現(xiàn)新的抗PRRSV感染的基因
[0022]BTG2`[0023]由于不同的豬品種和個(gè)體的遺傳背景差異，對藍(lán)耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標(biāo)上，通城豬、梅山豬等國內(nèi)豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強(qiáng)的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達(dá)分析，某些免疫相關(guān)的基因表達(dá)量在感染前后兩個(gè)品種間有顯著的差異。通過對不同品種間PRRSV感染造成的基因表達(dá)差異的分析，不僅可以研究藍(lán)耳病的感染機(jī)制，還可以找出抗性或易感相關(guān)的基因，從而為藍(lán)耳病的治療和預(yù)防提供新辦法。
[0024]前期實(shí)驗(yàn)通過對6個(gè)品種豬(長白豬、大白豬、杜洛克豬、清平豬、梅山豬、通城豬)感染高致病性藍(lán)耳病毒(PRRSV)進(jìn)行抗病豬的篩選，通過臨床癥狀記錄:采食量、體溫、生理生化、細(xì)胞因子以及存活時(shí)間等的檢測，最后得到了對藍(lán)耳病抗性差異較大的兩個(gè)品種:長白豬(易感豬)、通城豬(抗病豬)。
[0025]選取抗病豬和易感豬各8頭，分別在第O天和感染高致病PRRSV后第3、5、7天宰殺取樣，肺組織提取總RNA，建庫進(jìn)行高通量測序，通過生物信息學(xué)分析。分析發(fā)現(xiàn):在攻毒第O天即對照組，BTG2在通城豬肺組織中的第3天的相對表達(dá)量(RPKM) 218.16大于長白豬的88.52 ;而且在通城豬肺組織中BTG2的表達(dá)達(dá)到峰值是在感染后第3天，在長白豬肺組織中BTG2基因感染后的表達(dá)量均低于感染前(如圖1所示)。
[0026]實(shí)施例2利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證BTG2基因抗PRRSV感染
[0027]1.設(shè)計(jì)針對BTG2基因(GenBank登錄號為EU255256.1)的引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)反轉(zhuǎn)錄mRNA并擴(kuò)增得到BTG2基因的CDS序列，引物序列如下:
[0028]目的基因BTG2:
[0029]上游引物BTG2-F:
[0030]5' -GCGTCGACCATGAGCCAGGCCCGCTGGAC-3'；
[0031]下游引物BTG2-R:
[0032]5' -CCCTCGAGACTAACTGGAGACCGCCATGACGTAG-3'。
[0033]將擴(kuò)增得到的BTG2基因的⑶S序列(如SEQ ID N0.1所示)導(dǎo)入原始載體pCMV-Myc-N (購自Clonetech公司，載體圖譜如圖2所示)，構(gòu)建pCMV_BTG2_Myc載體。由于pCMV-Myc-N具有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠使導(dǎo)入其中的BTG2基因進(jìn)行過表達(dá)。
[0034]2.BTG2基因過表達(dá)的驗(yàn)證
[0035]將構(gòu)建好的連有BTG2基因⑶S序列的pCMV_BTG2載體和未連接有BTG2基因的⑶S序列的pCMV-Myc-N載體，分別轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞。
[0036]3.將構(gòu)建好的連有BTG2基因⑶S序列的pCMV_BTG2載體和未連接有BTG2基因的CDS序列的pCMV-Myc-N載體，分別轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)之后，提取細(xì)胞的總RNA,對PRRS病毒的0RF7 (第7個(gè)編碼閱讀框)進(jìn)行定量PCR檢測。
[0037]PRRS 病毒 0RF7 引物:
[0038]上游引物PRRS-F: AATAACAACGGCAAGCAGCA ；
[0039]下游引物PRRS-R: GCACAGTATGATGCGTCGGC。
[0040]為了計(jì)算PRRS病毒0RF7的相對表達(dá)量，在對PRRS病毒的0RF7進(jìn)行定量PCR檢測的同時(shí)引入內(nèi)參基因GAPDH (GAPDH在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量比較恒定)，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0041]內(nèi)參基因GAPDH (GenBank 登錄號為 ΝΜ_001206359.1):
[0042]內(nèi)參基因GAPDH引物:
[0043]上游引物GAPDH-F: CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC ；
[0044]下游引物GAPDH-R:GACGCCTGCTTCACCACCTTCT。
[0045]4.分析轉(zhuǎn)染了帶有BTG2基因⑶S序列的質(zhì)粒的細(xì)胞中的PRRS 0RF7的拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)染了不帶有BTG2基因CDS序列的質(zhì)粒的細(xì)胞中的0RF7的拷貝數(shù)是否有顯著差異。我們的結(jié)果顯示，在攻毒完成，并培養(yǎng)24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染了過表達(dá)BTG2基因CDS序列的細(xì)胞中的PRRS病毒的0RF7的相對表達(dá)量要顯著的低于對照組(如圖3所示)。
[0046]通過比較過表達(dá)BTG2基因的MARC145細(xì)胞和不轉(zhuǎn)任何基因的MARC145細(xì)胞中的PRRS的拷貝數(shù)目，來分析BTG2基因?qū)τ赑RRS病毒在MARC145細(xì)胞中復(fù)制的影響。我們研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BTG2基因后，PRRS病毒在MARC145細(xì)胞中的復(fù)制明顯受到抑制，這說明BTG2基因?qū)τ赑RRS病毒的復(fù)制具有抑制作用，我們可以通過過表達(dá)BTG2基因來達(dá)到抑制PRRS病毒復(fù)制的目的。
[0047]本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作中包含:
[0048]I)總RNA的提取
[0049]總RNA的提取是用Invitrog en公司生產(chǎn)的TRIzol試劑，并嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行操作。
[0050]2)反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0051]反轉(zhuǎn)錄所采用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶并嚴(yán)格按照Promega公司的說明書要求進(jìn)行操作。
[0052]3)利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測PRRSV 0RF7的表達(dá)情況
[0053]熒光實(shí)時(shí)定量PCR:
[0054]儀器型號:ABI公司生產(chǎn)的 Applied BiosystemsViiA7
[0055]試劑盒:康為世紀(jì)公司生產(chǎn)的FastSYBR mixture (Coffin Biotech C0., Ltd.[CWBIO])，并按照產(chǎn)品說明書操作。
[0056]PRRSV 0RF7相對表達(dá)量分析方法:
[0057]Λ Λ Ct方法:Λ Ct實(shí)驗(yàn)組=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct)
[0058]Δ Ct對照組=(對照組目的基因Ct-對照組內(nèi)參基因Ct)
[0059]2—Δ ACt=2~(ACt 實(shí)驗(yàn)組-ACt 對照組)
[0060]采用GAPDH作為內(nèi)參基因。
[0061]實(shí)施例3利用BTG2基因過表達(dá)制備抗PRRSV的轉(zhuǎn)基因豬
[0062]1、供體細(xì)胞的復(fù)蘇。從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，并不斷快速搖動(dòng)凍存管。待冷凍液徹底解凍后，轉(zhuǎn)移至離心管中，用新鮮培養(yǎng)液稀釋3倍，1000rpm,離心5分鐘，出去上清，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，接種到培養(yǎng)皿中
培養(yǎng)。`
[0063]2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入供體細(xì)胞中。常規(guī)方法消化細(xì)胞，用IOOul無血清培養(yǎng)基DMEM來稀釋0.8ug待轉(zhuǎn)質(zhì)粒和2ul脂質(zhì)體(lipofectamineTM2000)。室溫孵育20分鐘后，向24孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi)添加IOOul上述液體。將培養(yǎng)板前后輕輕晃動(dòng)搖勻，培養(yǎng)4-6小時(shí)后更換培養(yǎng)液為完全細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0064]3、轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞加入800ug/mL G418，每2-3天換液一次，篩選14天后，用PBS洗2遍，收集陽性細(xì)胞克隆。
[0065]4、轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的DNA檢測。按照常規(guī)分子克隆方法，提取轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞DNA并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0066]5、以上述轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，以體外成熟的初情期前母豬卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞。把供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入39度，5%C02,100%濕度平衡10分鐘，然后在配有顯微操作儀器及恒溫臺(tái)的倒置顯微鏡上用固定吸管吸持卵母細(xì)胞，用注射針將吸取卵母細(xì)胞核。然后挑選表面光滑的體細(xì)胞，從去核時(shí)裂口處放入卵周隙，用注射針點(diǎn)壓透明帶，使供體細(xì)胞與受體卵的胞膜接觸緊密。將供體細(xì)胞-卵胞質(zhì)構(gòu)成的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液PZM3中，在39度，5%C02，100%濕度培養(yǎng)箱中恢復(fù)I小時(shí)。
[0067]6、將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡2分鐘，用融合/激活液洗滌3遍后，每批放5-8個(gè)放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行，用CUY-21融合儀(BEX，日本)施加I個(gè)lOOus，1.4kv/cm的直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活，接著用PZM3培養(yǎng)液洗滌3遍，立即轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中，39度，5%C02,100%濕度培養(yǎng)4小時(shí)后再體視顯微鏡下判定融合。
[0068]7、克隆胚胎體外培養(yǎng)。將融合的重構(gòu)胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍后，轉(zhuǎn)入預(yù)平衡2小時(shí)以上的胚胎培養(yǎng)液PZM3中，培養(yǎng)條件39度，5%C02，5%02，90%N2，飽和濕度。
[0069]8、挑選形態(tài)優(yōu)良的克隆胚胎用非手術(shù)法移入自然發(fā)情的經(jīng)產(chǎn)母豬子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠。[0070]9、對出生的克隆轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行PCR和southern檢測，進(jìn)行功能研究。
[0071]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所`做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.豬BTG2基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其特征在于，其是通過BTG2基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。
2.一種過表達(dá)BTG2基因的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述載體為導(dǎo)入BTG2基因CDS序列的pCMV-Myc-N 載體。
4.含有權(quán)利要求2或3所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于，其為除胚胎細(xì)胞外的豬體細(xì)胞。
6.一種制備克隆胚胎的方法，其特征在于，其以權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
7.利用BTG2基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法，其特征在于，所述方法為通過對豬的BTG2基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，BTG2表達(dá)量高的豬比BTG2表達(dá)量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染能力。
【文檔編號】A61K48/00GK103751802SQ201310717888
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李寧, 李佳, 任立明, 李駿蔚 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)