一種青梅感冒片的制備方法及其在抑制腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種青梅感冒片的制備方法及應用。本發(fā)明的青梅感冒片的制備方法，由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅267g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得甘草酸含量有很大提高。本發(fā)明還提供了青梅感冒片在制備抑制小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】一種青梅感冒片的制備方法及其在抑制腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種青梅感冒片的制備方法及其在抑制小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]青梅感冒顆粒標準號WS-11318 (ZD-1318) -2002，記載于國家中成藥標準匯編內科脾胃分冊。由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅267g作為原料藥制成，具有清涼解熱的功效。用于風熱感冒，頭痛，咳嗽，鼻塞。
[0003]現(xiàn)有技術中，尚未有青梅感冒顆粒在提取制備方面采用超臨界和微波技術的報道，而揮發(fā)油提取，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。

【發(fā)明內容】

[0004]為了解決上述的技術問題，本發(fā)明提供了一種青梅感冒片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種青梅感冒片在制備抑制小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0007]—種青梅感冒片的制備方法，由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅 267g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成:取青蒿、香薷，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa,溫度30-50 °C, CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時間180-220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成150片，每片重0.3g。
[0008]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
[0010]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0011]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.min。
[0012]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
[0013]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0014]上述的青梅感冒片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。[0015]上述的青梅感冒片在制備抑制小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用。
[0016]現(xiàn)有技術中，青梅感冒顆粒每次I袋，每袋15g，一日2-3次。青梅感冒顆粒服藥量大，且顆粒劑制備需要加大量的糖，糖尿病患者不適宜，不加糖的話味道不佳，患者不容易服下，依從性差。采用本發(fā)明方法制備成的青梅感冒片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用2-3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0017]試驗一、不同方法制備的青梅感冒片中甘草酸含量的比較
[0018]1、儀器及試藥本發(fā)明青梅感冒片:按實施例1方法制備，使用1510g原料藥，經(jīng)提取制成150片，每片重0.3g。原青梅感冒顆粒，按照WS-11318 (ZD-1318)-2002標準方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；甘草酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0019]2、方法
[0020]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇一 0.2mol/L醋酸銨溶液一冰醋酸(67: 33: I)為流動相 ；檢測波長為250nm。理論板數(shù)按甘草酸峰計算應不低于3000。
[0022]對照品溶液的制備精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，加90%甲醇制成每Iml含0.4mg的溶液，即得。
[0023]供試品溶液的制備取本發(fā)明的青梅感冒片，研細，取0.08g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇10ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補足減失的重量，離心，上清液用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0024]對照產品供試品溶液的制備取本對照的青梅感冒顆粒，研細，混勻，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇10ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用90 %甲醇補足減失的重量，離心，上清液用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0025]測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。3、結果
[0026]結果表明，本發(fā)明青梅感冒片中甘草酸的含量為35_70mg/片；而原青梅感冒顆粒中甘草酸的含量為14.5mg/袋，每次服用量2片的甘草酸含量為原顆粒劑含量的5-10倍，在服用量減少的情況下，甘草酸含量有很大提高。
[0027]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的青梅感冒片，有效成分含量遠遠高于WS-11318(ZD-1318)-2002標準記載的方法制備的青梅感冒顆粒。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發(fā)明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
[0029]實施例1[0030]取青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅267g，將青蒿、香薷加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥.π?η，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成150片，每片重0.3g。
[0031]經(jīng)檢測，成品中甘草酸的含量為69.8mg/片。
[0032]實施例2
[0033]取青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅267g，將青蒿、香薷加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.min，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成150片，每片重0.3g。
[0034]經(jīng)檢測，成品中甘草酸的含量為56.2mg/片。
[0035]實施例3
[0036]取青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅267g，將青蒿、香薷加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30。。，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時間220min,得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成150片，每片重0.3g。
[0037]經(jīng)檢測，成品中甘草酸的含量為36.9mg/片。
[0038]實施例4:青梅感冒片抑制小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖的實驗研究資料
[0039]1.實驗材料
[0040]1.1實驗用細胞株
[0041]小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro_2a細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0042]1.2實驗藥物
[0043]研究藥物:本發(fā)明青梅感冒片:按實施例1方法制備。
[0044]藥液儲液:稱取IOOmg青梅感冒片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0045]1.3實驗試劑[0046]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESCO 公司);EDTA (AMRESCO 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate (AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿有限公司)；MTT (Biosharp 批號:0793) =PBS (實驗室自配)；
[0047]1.4實驗器材
[0048]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι 濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0049]2.實驗方法
[0050]I) Neuro-2a 細胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)，當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管中，1000rpm離心5min，調整細胞懸液濃度3X IO4個/ml。
[0051]2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī) 培養(yǎng)。
[0052]3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入青梅感冒片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0053]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0054]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0055]6)同時設置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
[0056]7)結果以藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
[0057]3.統(tǒng)計處理
[0058]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0059]4.實驗結果
[0060]MTT法實驗后統(tǒng)計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時,對Neuro_2a細胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量達到
15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0061]表1青梅感冒片對Neuro_2a細胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0062]
【權利要求】
1.一種青梅感冒片的制備方法，由青蒿200g、五指柑267g、香薷134g、狗肝菜200g、甘草134g、積雪草134g、崗梅267g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:取青蒿、香薷，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時間180-220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成150片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
4.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
5.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
7.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
8.根據(jù)權利要求1所述的青梅感冒片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
9.權利要求1所述的青梅感冒片在制備抑制小鼠腦神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a細胞增殖藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103768263SQ201310661414
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權日:2013年12月6日
【發(fā)明者】孫波 申請人:濟南新起點醫(yī)藥科技有限公司