人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞免疫學【技術領域】，具體地說是一種能夠大量分泌IL-12的人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，該試劑盒由單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC成熟劑和腫瘤抗原組成。通過本發(fā)明所制備的DC，其應用主要為癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預防。本發(fā)明的優(yōu)點是制備的DC能夠分泌大量的IL-12，從而促使T細胞向Th1型免疫應答方向分化，同時具有制備工藝簡單、成本低廉、易于規(guī)?；a等優(yōu)勢。
【專利說明】人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，特別涉及一種能夠大量分泌IL-12的樹突狀細胞疫苗的專用試劑盒。
【背景技術】
[0002]樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最強的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC),最大特點是能夠刺激初始型T細胞(naiVe T cell)活化和增值，是特異性免疫應答的使動者。因此，DC在腫瘤免疫細胞治療中有著廣泛的應用前景。然而，DC在人外周血中的比例非常低，而且腫瘤患者體內DC的功能大多處于抑制狀態(tài)。因此，如何獲得足夠數量并具有誘導T細胞向Thl型免疫應答方向分化為細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)的DC,貝U成為臨床應用的關鍵。
[0003]目前，DC常規(guī)的擴增方案很多，如經典的GM-CSF、IL_4誘導DC分化，然后用TNF-a或者組合細胞因子IL-1 ^、IL-6、TNF- a、PGE-2等，或者聯(lián)合聚肌胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,poly-1:C)、細菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide,LPS)等促進其成熟，然而上述促DC成熟劑僅能使成熟DC低水平分泌IL-12，而IL-12是DC促進T細胞向Thl型免疫應答方向分化的關鍵分子。因此，如何誘導DC成熟并分泌高水平的IL-12，對免疫細胞實施 殺傷腫瘤細胞則起到核心作用。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備能夠大量分泌IL-12的人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒。
[0005]本發(fā)明所提供的一種能夠大量分泌IL-12的人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒由單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC成熟劑和腫瘤抗原組成。
[0006]作為優(yōu)選，所述單核細胞分離獲取培養(yǎng)基為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種。
[0007]作為優(yōu)選，所述促DC誘導分化培養(yǎng)基的溶劑為X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種，溶質為GM-CSF和IL-4，其中GM-CSF的濃度是800-1000IU / ml，IL-4的濃度是 800-1000IU / ml。
[0008]作為優(yōu)選，所述促DC成熟劑的溶劑為X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種，溶質為 IL-1^、IL-6、TNF-a，或者 IL-1^、IL_6、TNF_a 與 IFN-Y、Mtb-Hag 中的一種或者兩種，該促DC成熟劑加入到培養(yǎng)體系后，IL-1 P終濃度為8-15ng / mL, IL-6終濃度為 50-150ng / mL, TNF-a 終濃度為 8_15ng / mL, Mtb-Hag 終濃度為 5 ~10 y g /ml, IFN-y 終濃度為 100 ~1000IU / ml。
[0009]作為優(yōu)選，所述腫瘤抗原為下述抗原中的一種或多種:⑶19、⑶20、WT-1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2 / neu、Idiotype、MAGEA3、p53、NY-ESO-U PSMA, GD2、CEA>MeIanA / MARTKRas mutantsgp 100>p53mutant>Proteinase3>bcr-abl>Tyrosinase>Survivin, PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP, AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK,Androgen receptor、Cyclin B1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、Fucosyl GMl>Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn,該抗原加入培養(yǎng)體系后濃度是I~20 μ g / ml ο
[0010]作為優(yōu)選，所述單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC誘導成熟培養(yǎng)基的PH是7.2~7.4。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)人樹突狀細胞疫苗的方法。
[0012]該方法為按照專屬試劑盒說明書操作要求并補加10%自體血漿的條件下，能高表達⑶80、⑶86、HLA-DR，低表達⑶83，同時能夠分泌大量的IL-12的人樹突狀細胞疫苗的制備。
[0013]本發(fā)明的人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒選擇性強，可以從人單核細胞中誘導出能夠大量分泌IL-12的DC疫苗。用該人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒獲得的人DC疫苗能夠直接配合傳統(tǒng)的手術、化療和放療等治療方式，或者在體外誘導特異性細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)進行體內回輸,可達到在常規(guī)療法清除大量腫瘤細胞后，進行清除少量殘留或擴散的腫瘤細胞，以提高、鞏固腫瘤治療效果，減少復發(fā)、提高生活質量的目的；或者對癌癥高危人群進行直接回輸達到預防的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]1.圖1流式細胞術檢測不同組合DC促成熟劑誘導DC成熟第7天成熟度檢測(n=8);第一列至第四列分別代表DC表面分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR，第一行至第四行分別代表 IL-1 β、IL-6、TNF-a、PGE2，IL-1 β、IL_6、TNF_a , IFN-y ,IL-1 β、IL_6、TNF_a、Mtb-HAg 和 IL-1 β、IL-6、TNF- a、IFN- y、Mtb-HAg 等不同組合 DC 促成熟劑。
`[0015]2.圖2不同組合DC促成熟劑對DC產生IL-12的影響(n=8) ；IFN- Y和Mtb-HAg對DC產生IL-12均有促進作用，特別是兩者與IL-1 β、IL-6和TNF- a進行組合誘導促進DC分泌IL-12的量不低于IL-1 β、IL-6、TNF- a和PGE2組合誘導的1000倍。
【具體實施方式】
[0016]下面用實例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。
[0017]實施例1
[0018]第一步:從分離獲得的PBMCs中進一步分離并獲取單核細胞。包括以下步驟:
[0019]1.采集患者外周靜脈血50ml，經聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個核細胞。具體步驟為:1500轉/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉淀的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1:2的比例加入離心管中，2000轉/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉速分別為1600轉/分，1300轉/分，均離心7分鐘，即得到外周血單個核細胞。
[0020]2.將上述分離的PBMCs重懸于單核細胞分離獲取培養(yǎng)基內，調整細胞密度為(5~10) X IO6 / ml，總體積為IOml加入T75ml的細胞培養(yǎng)瓶內，于37°C>5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內貼壁2h。[0021]3.輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使未貼壁細胞重新懸?。蝗缓笪鼦墤腋〉奈促N壁細胞，則留下的貼壁細胞即為單核細胞。
[0022]第二步:誘導單核細胞向DC分化。包括以下步驟:
[0023]1.將添加有10%自體血漿的促DC誘導分化培養(yǎng)基20ml加入上述T75的培養(yǎng)瓶內，然后置于37°C、5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
[0024]2.第三天(72h)后吸棄IOml培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)基，并補加IOml新鮮的含有10%自體血漿的促DC誘導分化培養(yǎng)基；同時添加腫瘤抗原，使其終濃度為IOyg / ml。
[0025]第三步:誘導已向DC分化的單核細胞成為成熟的DC，并進行成熟度和IL-12分泌量的檢測。包括以下步驟:
[0026]1.在細胞培養(yǎng)的第五天，加入促DC成熟劑。
[0027]2.細胞培養(yǎng)的第6~7天，分別通過流式細胞術和ELISA進行DC的成熟度和IL-12分泌量檢測。
[0028]本發(fā)明相對原有培養(yǎng)基培養(yǎng)出的DC成熟度不高和IL-12分泌不足的情況下，其成熟度和IL-12的分泌均較高。 參見圖1和圖2。
【權利要求】
1.一種人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于包括: (1)單核細胞分離獲取培養(yǎng)基； (2)促DC誘導分化培養(yǎng)基； (3)促DC成熟劑； (4)腫瘤抗原。
2.根據權利要求1所述人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于，所述單核細胞分離獲取培養(yǎng)基為PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opti_MEM?培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基中的任意一種。
3.根據權利要求1或2所述人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于，所述促DC誘導分化培養(yǎng)基的溶劑為X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種，溶質為 GM-CSF 和 IL-4，其中 GM-CSF 的濃度是 800-1000IU / ml，IL-4 的濃度是 800-1000IU /ml o
4.根據權利要求3所述人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于，所述促DC成熟劑的溶劑為X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基中任意一種，溶質為IL-1 ^、IL-6、TNF-a，或者IL-1P、IL_6、TNF-a與IFN-y ,Mtb-Hag中的一種或者兩種，該促DC成熟劑加入到培養(yǎng)體系后，IL-1 P終濃度為8-15ng / mL，IL-6終濃度為50-150ng / mL，TNF_a終濃度為 8-15ng / mL，Mtb-Hag 終濃度為 5 ~10 y g / ml, IFN- y 終濃度為 100 ~1000IU /ml。
5.根據權利要求1或2或4所述人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于，所述腫瘤抗原為下述抗原中的一種或多種:CD19、CD20、WT-l、MUCl、LMP2、HPVE6E7、EGFRvII1、HER-2 / neu、Idiotype、MAGE A3、p53、NY-ESO-U PSMA,⑶2、CEA, MelanA / MART1、Rasmutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr-abl、Tyrosinase、Surviving PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、⑶3、Fucosyl GMl、Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn，該抗原加入培養(yǎng)體系后濃度是 I ~20 y g /ml o
6.根據權利要求3所述人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于，所述腫瘤抗原為下述抗原中的一種或多種:CD19、CD20、WT-1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2 / neu、Idiotype、MAGE A3、p53、NY-ESO-U PSMA,⑶2、CEA, MelanA / MART1、Rasmutant、gplOO、p53mutant、Proteinase3、bcr-abl> Tyrosinase、Surviving PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC, TRP-2、⑶3、Fucosyl GMU Mesothelin、PSCA、MAGEAUsLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn，該抗原加入培養(yǎng)體系后濃度是 I ~20 y g /ml o
7.根據權利要求1或2所述人樹突狀細胞疫苗制備的專用試劑盒，其特征在于，所述單核細胞分離獲取培養(yǎng)基、促DC誘導分化培養(yǎng)基、促DC誘導成熟培養(yǎng)基的PH是7.2~7.4。
8.根據權利要求1-7任一項所述專用試劑盒培養(yǎng)人樹突狀細胞疫苗的方法，其特征在于:所述專用試劑盒需要與10%的自體血漿配合使用，能高表達⑶80、⑶86、HLA-DR，低表達⑶83，同時能夠分泌大量的IL-12的人樹突狀細胞疫苗。
【文檔編號】A61K39/00GK103638517SQ201310638797
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權日:2013年12月4日
【發(fā)明者】馬飛, 黃浩, 申珊珊 申請人:深圳市合一康生物科技有限公司