一種歸芍六君丸的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種歸芍六君丸的制備方法，由當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g作為原料藥，采用超臨界萃取制備而成，使得含量有很大提高，服用量減少，本發(fā)明還提供了歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種歸茍六君丸的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種歸芍六君丸的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]歸芍六君丸記載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0242-90，處方為當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g，以上八味，粉碎成細(xì)粉，過(guò)
篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得。能益氣養(yǎng)血。用于肝脾不和，脘脹腹痛，食少體倦，嘔吐。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有歸芍六君丸在提取制備方面采用超臨界技術(shù)的報(bào)道，而采用打粉的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種歸芍六君丸的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種歸芍六君丸的制備方法，由當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯茶100g、炎甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g作為原料藥制成,所述的方法由下列步驟組成:取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 15-30MPa，溫度 30-50°C，C(V流量 l-3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間 150_180min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重lg。
[0008]上述一種歸芍六君丸的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述一種歸芍六君丸的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥.min,萃取時(shí)間 160min。
[0010]上述一種歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，歸芍六君丸由當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g作為原料藥制成，制備方法由下列步驟組成:取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-500C，CO2流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間150_180min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重lg。[0011]上述歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，歸芍六君丸制備方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0012]上述歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，歸芍六君丸制備方法中所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量21111/^生藥.min,萃取時(shí)間160min。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)中，歸芍六君丸每16粒重lg，每次9g，一日2次，采用本發(fā)明制備成的歸芍六君丸也是每16粒重lg，但含有的藥材量是原來(lái)的2倍，因此每次4.5g，一日2次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0015]實(shí)施例1
[0016]取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間150min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重Ig0
[0017]實(shí)施例2
[0018]取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C02流量3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重1g0
[0019]實(shí)施例3
[0020]取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、
姜半夏50g加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40。。，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間160min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重1g0
[0021]實(shí)施例4:歸芍六君丸抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0022]1實(shí)驗(yàn)材料
[0023]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
[0024]人黑色素瘤細(xì)胞MV3，南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0025]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0026]研究藥物:本發(fā)明歸芍六君丸:按實(shí)施例3方法制備。
[0027]藥液儲(chǔ)液:稱取1OOmg歸芍六君丸，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μ m濾器過(guò)濾，500 μ 1doff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。[0028]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0029]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419);NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810-033 Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號(hào):2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號(hào):2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號(hào):2010242);Str印tomycin SulfateCAMRESCO公司批號(hào):2010382);無(wú)水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號(hào):080310182);MTT(Biosharp批號(hào):0793) ;PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
[0030]1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0031]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DM1L);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRA MAX190) ；C02培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào):SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):ΚΑ-1000) ;0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào):SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0032]2實(shí)驗(yàn)方法
[0033]I)人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(10cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離 心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個(gè)/ml。
[0034]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
[0035]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入歸芍六君丸溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0036]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0037]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0038]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0039]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:
[0040]細(xì)胞增值抑制率(％)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)/對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0041]3統(tǒng)計(jì)處理
[0042]采用Microsoft Excel2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0043]4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0044]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí),對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞MV3增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01 )，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(Ρ〈0.001)。[0045]表1歸芍六君丸對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞MV3增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種歸芍六君丸的制備方法，由當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯茶100g、炎甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g作為原料藥制成,其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重lg。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種歸芍六君丸的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種歸芍六君丸的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時(shí)間160min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于歸芍六君丸由當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成:取當(dāng)歸100g、炒白術(shù)100g、黨參100g、白芍100g、茯苓100g、炙甘草50g、陳皮50g、姜半夏50g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa,溫度30-50°C, CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取物，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，另取生姜30g與大棗30g搗碎、煎汁，泛丸，干燥，即得，每16粒重lg。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于歸芍六君丸制備方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種歸芍六君丸在制備抑制人黑色素瘤細(xì)胞MV3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于歸芍六君丸制備方法中所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥.min,萃取時(shí)間 160min。
【文檔編號(hào)】A61K36/8888GK103599292SQ201310608898
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】李強(qiáng) 申請(qǐng)人:李強(qiáng)