一種復方丹參提取物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種復方丹參提取物及其制備方法，所述提取物的制備方法包括以下步驟：取丹參、三七，加醇提取，得醇提液，濃縮，得醇提物；然后藥渣再用水提，得水提液，所得水提取液通過大孔樹脂精制，所得洗脫液濃縮，加堿水解，濃縮成稠膏或干燥，得水提物；合并所述醇提物和所述水提物即得。本發(fā)明所述的復方丹參提取物中去除了傳統(tǒng)技術中的糖類、蛋白類等雜質成分，同時大幅提高了藥效成分的含量。本發(fā)明還公開復方丹參提取物在制備治療心血管疾病的藥物中的應用。
【專利說明】一種復方丹參提取物及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥領域，尤其是涉及一種復方丹參提取物及其應用。

【背景技術】
[0002]隨著生活水平的提高、世界人口老齡化以及發(fā)病群體的年輕化，心腦血管疾病逐年增加，已成為嚴重危害人類健康和生活質量的疾病。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復發(fā)率高、并發(fā)癥多”即“四高一多”的特點，目前，我國心腦血管疾病患者已經超過2.7億人！我國每年死于心腦血管疾病近300萬人，占我國每年總死亡病因的51%。而幸存下來的患者75%不同程度喪失勞動能力，40%重殘。
[0003]丹參又名赤參，紫丹參，紅根等。苦，微寒。歸心、肝經。能擴張冠狀動脈，增加冠脈流量，改善心肌缺血、梗塞和心臟功能，調節(jié)心律，并能擴張外周血管，改善微循環(huán)；能提高機體耐缺氧能力；有抗凝血，促進纖溶，抑制血小板凝聚，抑制血栓形成的作用；能降低血脂，抑制冠脈粥樣硬化形成；能抑制或減輕肝細胞變性、壞死及炎癥反應，促進肝細胞再生，并有抗纖維化作用；能縮短紅細胞及血色素的恢復期，使網織細胞增多，能促進組織的修復，加速骨折的愈合；有中樞神經有抑制作用；有抗腫瘤作用；能增強機體免疫功能；能降低血糖；對結核桿菌等多種細菌有抑制作用。
[0004]三七具有散瘀止血作用，是血證的常用藥?！锻蹰彼幗狻氛f它“和營止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血。凡產后、經期、跌打、癰腫，一切瘀血皆破；凡吐衄、崩漏、刀傷、箭傷，一切新血皆止?！薄侗静菪戮帯分赋?“三七根，止血之神藥也。無論上、中、下之血，凡有外越者，一味獨用亦效。加入于補血補氣藥中則更神。蓋此藥得補而無沸騰之患，補藥得此而有安靜之體也?！?br> [0005]臨床上，丹參、三七通常聯(lián)合應用，治療心血管疾病，上市的藥物有復方丹參片、復方丹參注射液等。但普通片劑、膠囊生產工藝落后，有效成分含量低，無質量控制指標，需口服經胃腸道吸收，在肝臟發(fā)生首過效應后吸收入血，生物利用度低，吸收慢.并不能適合心絞痛病人的急救之需。


【發(fā)明內容】

[0006]復方丹參滴丸是一種起效快、療效好的冠心病治療藥物,臨床上深受患者的歡迎。針對復方丹參滴丸的制備工藝，本發(fā)明從提取工藝方面進行了深入研究，利用大孔樹脂精制去除了糖類、蛋白質等成分，提高了有效成分的含量，降低了服用量。從節(jié)約藥材資源方面，提高了藥材所含有效成分的綜合利用率。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種復方丹參提取物及其制備方法。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供所述復方丹參提取物的應用。
[0009]根據本發(fā)明的復方丹參提取物，其制備方法包括以下步驟:取丹參、三七，加醇提取，得醇提液，濃縮干燥，得醇提物；然后取所述醇提物的制備中生成的藥渣，再用水提，得水提液，所得水提液通過大孔樹脂精制，所得洗脫液濃縮，加堿水解，濃縮成稠膏或干燥，得水提物；合并所述醇提物和所述水提物即得。
[0010]優(yōu)選的，所述丹參、三七藥材的重量百分比為丹參20-98%，三七2%_80%。
[0011]根據本發(fā)明實施方式之一，所述醇提物的制備方法為:取丹參、三七藥材，加2-8倍量乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小時，合并提取液，減壓濃縮、干燥，即得。
[0012]優(yōu)選的，所述乙醇為70%_100%的乙醇溶液。
[0013]最優(yōu)選的，所述乙醇為95%的乙醇溶液。
[0014]根據本發(fā)明的另一實施方式，所述水提取液的制備方法為:取所述醇提物的制備中生成的藥渣，加2-12倍量水回流提取1-3次，每次1-3小時，過濾，合并所得濾液，即得所述水提取液。
[0015]根據本發(fā)明的再一實施方式，所述洗脫液的制備方法為:取所述提取液，上大孔樹脂柱，依次用水、70%-100%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液即為所述洗脫液。
[0016]優(yōu)選的，所述大孔樹脂柱使用前通過以下方法預處理:取大孔樹脂，以70%_100%乙醇濕法裝柱，然后用70%-100%乙醇洗至濾液與水混合不呈白色渾濁，最后用蒸餾水洗至無醇味。
[0017]更優(yōu)選的，所述大孔樹脂柱使用前通過以下方法預處理:取大孔樹脂，以95%乙醇濕法裝柱，然后用95%乙醇洗至濾液與水(I:3)混合不呈白色渾濁，最后用蒸餾水洗至無醇味。
[0018]最優(yōu)選的，所述大孔樹脂與所述丹參三七的重量比為0.5-2。
[0019]根據本發(fā)明再一實施方式，所述水解方法為:取所述洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后加入堿液，加熱回流，即得。
[0020]優(yōu)選的，所述堿液選自碳酸氫鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉，氫氧化鉀的溶液，pH值為7-10。
[0021]更優(yōu)選的，所述堿液為10%碳酸氫鈉溶液。
[0022]根據本發(fā)明再一實施方式，所述水解時間為0.5-8小時。
[0023]最優(yōu)選的，本發(fā)明的復方丹參提取物，其制備方法包括以下步驟:
[0024](I)取丹參、三七藥材，加3倍量95%乙醇提取2小時，然后再加2倍量95%乙醇提取Ih小時，合并提取液，60°C減壓濃縮、干燥，即得醇提物；
[0025](2)取醇提藥渣，加5倍量水提取2小時，然后再加4倍量水提取I小時，過濾，合并兩次所得濾液，即得水提液；
[0026](3)大孔樹脂預處理:取干AB-8型大孔樹脂的量:生藥量(上述步驟(I)中丹參三七藥材的量)=1:1,以95%乙醇濕法裝柱，然后用95%乙醇洗至濾液與水(I:3)混合不呈白色渾濁即可，再用大量的蒸餾水洗至無醇味，備用；
[0027](4)取所述水提液，以lBV/hr流速上到已處理好的AB-8大孔樹脂柱(大孔樹脂量:生藥量=1:1)，然后用IBV水以lBV/hr水洗除雜，最后用2.5BV的95%乙醇作為洗脫液，以lBV/hr洗脫，收集洗脫液，備用；
[0028](5)取步驟(4)所得洗脫液，60°C減壓濃縮，回收乙醇至無醇味(約為藥材量的1/4)，得精制復方丹參濃縮液。加入10%碳酸氫鈉溶液16.1ml，加熱回流2小時，得復方丹參水解液，70°C減壓濃縮至干，即得水提物；
[0029](6)合并步驟(I)所得醇提物與步驟(5)所得水提物即得本發(fā)明所述復方丹參提取物。
[0030]本發(fā)明的復方丹參提取物，作為藥物活性物質，需要時加入藥物可接受的載體，按照制劑學的常規(guī)技術制成的所需的制劑。制劑中的藥物活性物質，可以是0.1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物制劑，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。
[0031]本發(fā)明的制劑可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、滴丸劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。
[0032]優(yōu)選的，本發(fā)明的制劑是口服劑型，如:滴丸劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。
[0033]最優(yōu)選的，本發(fā)明的劑型為滴丸劑。
[0034]根據本發(fā)明，所述滴丸劑是通過以下方法制備的:取本發(fā)明所述的復方丹參提取物，加適量水溶化，與預溶化的輔料按照藥輔比為1:2-5混合均勻，加入冰片適量，進行化料，化料溫度為60-100°C?；暇鶆蚝?，轉移至滴丸機的滴灌中；藥液滴至0-10°C的液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網選丸，即得。
[0035]優(yōu)選的，所述輔料為PEG6000。
[0036]優(yōu)選的，藥輔比為1:3。
[0037]優(yōu)選的，化料溫度為80°C。
[0038]最優(yōu)選的，所述滴丸劑是通過以下方法制備的:取本發(fā)明所述的復方丹參提取物，加適量水溶化，與預溶化的輔料按照藥輔比為1:3混合均勻，加入冰片適量，進行化料，化料溫度為80°C?；暇鶆蚝螅D移至滴丸機的滴灌中；藥液滴至0-10°C的液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網選丸，即得。
[0039]根據本發(fā)明，所述復方丹參提取物的制備方法，包括以下步驟:取丹參、三七，加醇提取，得醇提液，濃縮干燥，得醇提物；然后取所述醇提物的制備中生成的藥渣，再用水提，得水提液，所得水提液通過大孔樹脂精制，所得洗脫液濃縮，加堿水解，濃縮成稠膏或干燥，得水提物；合并所述醇提物和所述水提物即得。
[0040]優(yōu)選的，所述丹參、三七藥材的重量百分比為丹參20-98%，三七2%_80%。
[0041]根據本發(fā)明實施方式之一，所述醇提物的制備方法為:取丹參、三七藥材，加2-8倍量乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小時，合并提取液，減壓濃縮、干燥，即得。
[0042]優(yōu)選的，所述乙醇為70%_100%的乙醇溶液。
[0043]最優(yōu)選的，所述乙醇為95%的乙醇溶液。
[0044]根據本發(fā)明的另一實施方式，所述水提取液的制備方法為:取所述醇提物的制備中生成的藥渣，加2-12倍量水回流提取1-3次，每次1-3小時，過濾，合并所得濾液，即得所述水提取液。
[0045]根據本發(fā)明的再一實施方式，所述洗脫液的制備方法為:取所述提取液，上大孔樹脂柱，依次用水、70%-100%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液即為所述洗脫液。
[0046]優(yōu)選的，所述大孔樹脂柱使用前通過以下方法預處理:取大孔樹脂，以70%_100%乙醇濕法裝柱，然后用70%-100%乙醇洗至濾液與水混合不呈白色渾濁，最后用蒸餾水洗至無醇味。
[0047]更優(yōu)選的，所述大孔樹脂柱使用前通過以下方法預處理:取大孔樹脂，以95%乙醇濕法裝柱，然后用95%乙醇洗至濾液與水(I:3)混合不呈白色渾濁，最后用蒸餾水洗至無醇味。
[0048]最優(yōu)選的，所述大孔樹脂與所述丹參三七的重量比為0.5-2。
[0049]根據本發(fā)明再一實施方式，所述水解方法為:取所述洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后加入堿液，加熱回流，即得。
[0050]優(yōu)選的，所述堿液選自碳酸氫鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉，氫氧化鉀的溶液，pH值為7-10。
[0051]更優(yōu)選的，所述堿液為10%碳酸氫鈉溶液。
[0052]根據本發(fā)明再一實施方式，所述水解時間為0.5-8小時。
[0053]最優(yōu)選的，本發(fā)明的復方丹參提取物的制備方法包括以下步驟:
[0054](I)取丹參、三七藥材，加3倍量95%乙醇提取2小時，然后再加2倍量95%乙醇提取Ih小時，合并提取液，60°C減壓濃縮、干燥，即得醇提物；
[0055](2)取醇提藥渣，加5倍量水提取2小時，然后再加4倍量水提取I小時，過濾，合并兩次所得濾液，即得水提液；
[0056](3)大孔樹脂預處理:取干AB-8型大孔樹脂的量:生藥量(上述步驟(I)中丹參三七藥材的量)=1:1,以95%乙醇濕法裝柱，然后用95%乙醇洗至濾液與水(I:3)混合不呈白色渾濁即可，再用大量的蒸餾水洗至無醇味，備用；
[0057](4)取所述水提液，以lBV/hr流速上到已處理好的AB-8大孔樹脂柱(大孔樹脂量:生藥量=1:1)，然后用IBV水以lBV/hr水洗除雜，最后用2.5BV的95%乙醇作為洗脫液，以lBV/hr洗脫，收集洗脫液，備用；
[0058](5)取步驟(4)所得洗脫液，60°C減壓濃縮，回收乙醇至無醇味(約為藥材量的1/4)，得精制復方丹參濃縮液。加入10%碳酸氫鈉溶液16.1ml，加熱回流2小時，得復方丹參水解液，70°C減壓濃縮至干，即得水提物；
[0059](6)合并步驟(I)所得醇提物與步驟(5)所得水提物即得本發(fā)明所述復方丹參提取物。
[0060]本發(fā)明的目的還在于提供一種復方丹參制劑。
[0061]本發(fā)明的復方丹參制劑，以本發(fā)明所述的復方丹參提取物，作為藥物活性物質，需要時加入其他活性成分和/或藥物可接受的載體，按照制劑學的常規(guī)技術制成的制劑。本發(fā)明的制劑可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、滴丸劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。
[0062]優(yōu)選的，本發(fā)明的制劑是口服劑型，如:滴丸劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、
膏劑等。
[0063]最優(yōu)選的，本發(fā)明的制劑為滴丸劑。
[0064]根據本發(fā)明，所述滴丸劑是通過以下方法制備的:取本發(fā)明所述的復方丹參提取物，加適量水溶化，與預溶化的輔料按照藥輔比為1:2-5混合均勻，加入冰片適量，進行化料，化料溫度為60-100°C?；暇鶆蚝?，轉移至滴丸機的滴灌中；藥液滴至0-10°C的液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網選丸，即得。
[0065]優(yōu)選的，所述輔料為PEG6000。
[0066]優(yōu)選的，藥輔比為1:3。
[0067]優(yōu)選的，化料溫度為80°C。
[0068]最優(yōu)選的，所述滴丸劑是通過以下方法制備的:取本發(fā)明所述的復方丹參提取物，加適量水溶化，與預溶化的輔料按照藥輔比為1:3混合均勻，加入冰片適量，進行化料，化料溫度為80°C。化料均勻后，轉移至滴丸機的滴灌中；藥液滴至0-10°C的液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網選丸，即得。
[0069]與未經醇提和大孔樹脂精制，而采用傳統(tǒng)水提醇沉的技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢:
[0070]在產品質量方面，本發(fā)明所述的復方丹參提取物中去除了糖類、蛋白類等非藥效成分，大幅提高了藥效成分的含量。與按照傳統(tǒng)的水提醇沉工藝制成的復方丹參提取物進行比較，丹參素含量提高83%，三七皂苷含量提高28.6%，丹參酮類成分含量提高了 31.1倍，單糖和二糖的含量由8.6%降低到0%，體現了現代中藥特點，也有利于制劑工藝的控制。
[0071]在服用劑量方面，以本發(fā)明所述復方丹參提取物為原料制備的精制復方丹參滴丸在保證藥效的前提下，日服用量下降16.7%。服用更加方便，從而提高了服藥患者的依從性。
[0072]本發(fā)明所述的提取物在制備治療心血管疾病的藥物中的應用。
[0073]優(yōu)選的，本發(fā)明所述提取物在制備治療心肌缺血引起的疾病的藥物中的應用。
[0074]優(yōu)選的，本發(fā)明所述提取物在制備治療抑制心肌損傷的藥物中的應用。
[0075]試驗表明，本發(fā)明的復方丹參提取物能顯著緩解大鼠冠狀動脈結扎所致急性心梗的主要癥狀指標，可以用于治療心肌缺血引起的各種疾病，包括心肌梗死、急性冠狀動脈綜合征、房室阻滯、心律失常、冠心病心絞痛等。
[0076]試驗表明，本發(fā)明的復方丹參提取物能顯著改善中毒性心肌炎的主要癥狀指標，可以用于治療心肌炎、心肌梗死等疾病引起的心肌細胞損傷，抑制心肌炎等疾病引起的心肌缺血。
[0077]本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0078]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從下面結合附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0079]圖1:本發(fā)明的復方丹參提取物的酚酸類成分指紋圖譜。
[0080]圖2:本發(fā)明的復方丹參提取物的皂苷類成分指紋圖譜。
[0081]圖3:本發(fā)明的復方丹參提取物的糖類成分指紋圖譜。
[0082]圖4:本發(fā)明的復方丹參提取物的丹參酮類成分圖譜。
[0083]圖5:復方丹參提取物對大鼠冠狀動脈結扎所致急性心梗的影響試驗不同給藥組的心臟切片數碼照片。
[0084]圖6:復方丹參提取物對中毒性心肌炎的影響試驗(體內中毒性心肌炎模型)中，不同給藥組的心肌細胞超微結構電鏡圖，a-f分別為空白對照組、模型組、卡托普利組、提取物低組、提取物中組、提取物高組。

【具體實施方式】
[0085]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明的限制。
[0086]試驗例一復方丹參提取物工藝流程:
[0087](I)取450g丹參藥材、88g三七藥材，加3倍量95%乙醇提取2小時，然后再加2倍量95%乙醇提取Ih小時，合并提取液，60°C減壓濃縮、干燥，即得醇提物；
[0088](2)取醇提藥渣，加5倍量水提取2小時，然后再加4倍量水提取I小時，過濾，合并兩次所得濾液，即得水提液；
[0089](3)大孔樹脂預處理:取干AB-8型大孔樹脂的量:生藥量(上述步驟(I)中丹參三七藥材的量)=1:1,以95%乙醇濕法裝柱，然后用95%乙醇洗至濾液與水(I:3)混合不呈白色渾濁即可，再用大量的蒸餾水洗至無醇味，備用；
[0090](4)取所述水提液，以lBV/hr流速上到已處理好的AB-8大孔樹脂柱(大孔樹脂量:生藥量=1:1)，然后用IBV水以lBV/hr水洗除雜，最后用2.5BV的95%乙醇作為洗脫液，以lBV/hr洗脫，收集洗脫液，備用；
[0091](5)取步驟(4)所得洗脫液，60°C減壓濃縮，回收乙醇至無醇味(約為藥材量的1/4)，得精制復方丹參濃縮液。加入10%碳酸氫鈉溶液16.1ml，加熱回流2小時，得復方丹參水解液，70°C減壓濃縮至干，即得水提物；
[0092](6)合并步驟(I)所得醇提物與步驟(5)所得水提物即得本發(fā)明所述復方丹參提取物。
[0093]4、復方丹參提取物滴丸的制備:
[0094]取復方丹參提取物，加適量水溶化，與預溶化的PEG6000按照藥輔比為1:3混合均勻，加入冰片I克，進行化料，化料溫度為80°C?；暇鶆蚝?，轉移至滴丸機的滴灌中；藥液滴至0-10°C的液體石蠟中，取出滴丸，除油，篩網選丸，即得。
[0095]試驗例二復方丹參提取物與未經醇提及精制樣品的檢測數據及分析
[0096]分別測定本發(fā)明所述的復方丹參提取物的丹參素、三七皂苷及單糖和二糖的含量，并與按照傳統(tǒng)的水提醇沉工藝制成的復方丹參提取物進行比較，數據顯示:復方丹參提取物的丹參素含量提高83%，三七皂苷含量提高28.6%，單糖和二糖的含量由8.6%降低到0%(見圖1、圖2和圖3)。本發(fā)明所述的復方丹參提取物中丹參酮的含量提高了 31.1倍(圖4)。按照相同的藥輔比制成制劑，日服用量下降16.7%。
[0097]試驗例三復方丹參提取物藥效學評價試驗
[0098]1.藥物與試劑:
[0099]1.1復方丹參提取物(按本發(fā)明的實施例一制備，分為3個劑量組，分別為提取物低、提取物中、提取物高)。配制方法:稱取樣品，用蒸餾水溶解配制成所需濃度的藥液。
[0100]1.2卡托普利片(陽性藥):中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:1203032 ;配制方法:
[0101]將卡托普利片研磨成粉末，用蒸餾水溶解配制成所需濃度的藥液。
[0102]1.30.9%氯化鈉注射液:南京小營藥業(yè)集團有限公司，批號:2012011301。
[0103]1.4注射用鹽酸多柔比星:浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號:120101。
[0104]1.5水合氯醛:國藥集團化學試劑有限公司，批號:20100111。
[0105]1.6肌酸激酶(CK)測定試劑盒，批號:20120713 ;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒，批號:20120712 ;丙二醛(MDA)測定試劑盒，批號:20120717 ;超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，批號:20120709 ;肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定試劑盒，批號:20120720 ;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒，批號:20120709 ;谷草轉氨酶(AST)試劑盒，批號:20120713。均由南京建成生物工程研究所提供。
[0106]1.7紅四氮唑(TTC)，國藥集團化學試劑公司，批號:F20120308 ;配制方法:稱取TTC粉末，用PBS緩沖液溶解配制成1%的TTC溶液。
[0107]1.8高糖DMEM:美國GIBCO BRL公司產品。
[0108]1.9小牛血清:由杭州四季青公司提供，_20°C保存。
[0109]1.10胰蛋白酶:由南京sunshine科技有限責任公司提供。
[0110]1.11 二甲基亞砜:上海凌峰化學試劑有限公司，批號:051123。
[0111]1.12青霉素:山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號:B041103。
[0112]1.13鏈霉素:山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號:040601。
[0113]2.主要試劑配制:
[0114]2.1高糖DMEM的配制:1L DMEM培養(yǎng)液中加入NaHC033.7g加青霉素G鈉，0.05g硫酸鏈霉素0.05g,用7.4%NaHC03或lmol/L HCl調至pH為7.2-7.4。加小牛血清(20%的濃度)用于細胞培養(yǎng)。
[0115]2.2PBS 緩沖鹽溶液(g/L):NaC18.0g，KC10.20g，Na2HPO4.12Η201.56g，KH2PO40.20g。用 7.4%NaHC03 溶液或 lmol/L HCl 調 pH 值至 7.4。
[0116]2.3消化液:胰酶，AMRESC0公司產品；EDTA_2Na，國藥集團化學試劑有限公司產品。胰酶用PBS配至0.25%，過濾除菌；EDTA用PBS配至0.02%,高壓滅菌。胰酶、EDTAl:1混合，4°C冰箱保存。
[0117]3.實驗動物:
[0118]清潔級SD大鼠2批，230?250g，第一批大鼠由蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供，動物合格證號=SCXK(蘇)2009-0001，第二批大鼠由浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號=SCXK (浙)2008-0033 ;新生I?3天SD大鼠乳鼠，雌雄不限，由南京市江寧區(qū)青龍山動物養(yǎng)殖場提供。
[0119]4.實驗儀器:
[0120]4.1HX-300呼吸機:成都泰盟科技有限公司。
[0121]4.2ECG-6511心電圖機:上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司。
[0122]4.3HH-2數顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司產品。
[0123]4.4BS224s型電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產品。
[0124]4.5BS110S型電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產品。
[0125]4.6DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海精宏實驗設備有限公司。
[0126]4.7LDZ5-2離心機:北京醫(yī)用離心機廠。
[0127]4.8超凈工作臺:蘇州凈化設備廠。
[0128]4.9倒置顯微鏡:0LYMPUS公司出廠，型號CKX41。
[0129]4.10 水套式 CO2 無菌孵育箱:Thermo Electron Corporat1n, made in USA,F0RMA3111, S/N:304481_7185。
[0130]4.11臺式低速離心機:上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術器械廠，型號:CH80_2。
[0131]4.12恒溫磁力攪拌器:上海司樂儀器有限公司，型號:85_2。
[0132]4.13電熱鼓風干燥箱:上海?，攲嶒炘O備有限公司，型號:DGX-9143B_1。
[0133]4.14立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，型號:YXQ-LS-50S II。
[0134]4.15電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號:BS224S。
[0135]4.16B1-RAD Model680 型酶標儀:英國 B1-RAD Laboratories Ltd。
[0136]5.復方丹參提取物對大鼠冠狀動脈結扎所致急性心梗的影響:
[0137]取清潔級雄性SD大鼠，按體重隨機分為9組，分別為偽手術組(蒸餾水)，模型組(蒸餾水)，提取物低(生藥劑量81.15mg/kg)，提取物中(生藥劑量162.3mg/kg)，提取物高(生藥劑量324.6mg/kg),每組10只。各組大鼠每天灌胃給藥一次,連續(xù)給藥7天。給藥容積為0.5ml/100g體重。于末次給藥后lh，腹腔注射水合氯醛300mg/kg麻醉，仰位固定，手術切口部位先后用碘酒和酒精消毒，之后在第三、四根肋骨開胸，并進行人工呼吸，暴露心臟，用醫(yī)用無損傷縫合針5/0結扎冠脈左前降支，迅速關閉胸腔并常規(guī)消毒，手術操作過程不超過30s，術后繼續(xù)人工呼吸I?2min，肌注(1.m)20萬單位青霉素預防感染。手術開始前5min、結扎后Os、lmin、5min、15min、lh、4h分別記錄標準II導聯(lián)心電圖，考察心電圖J點的變化。
[0138]實驗結束后，立即取出心臟，用生理鹽水洗去血液，剪去心房及心底部血管，稱心室重量，將心室沿房室溝平均切成5片放入1%TTC溶液內，在37°C恒溫水浴染色5min，取出后首先拍數碼照片，而后分離未染色部分(即梗塞部分)并稱重計算其占整個心室重量的百分率(心肌梗塞百分率)，并與缺血模型組進行組間t檢驗。計算梗塞百分率公式如下:
[0139]梗塞百分率(％)=蒼白區(qū)重量/ (心室重量)X100%
[0140]取心臟之前，對大鼠進行眼眶靜脈叢取血I?2ml, 2000rpm速度離心25min分離出血清，按試劑盒方法測定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活性。結果見表1、表2、表3及圖5。
[0141]表1.對冠脈結扎所致心肌缺血大鼠J點變化(mv)的影響(x±s) ( n=7)
[0142]
組則 7 ι； 手術前 -
(m8/k8!IibIb5minISminIh4h
獅-0.110±0.0350_242rf.045‘+—+0.277=0.()72^ (O30±0.WWT 0.288±0Λ7(Γ ‘?).260±0.07(Τ'
從取物AX1.15-0.123=0.01!(U24絲.恥I + ++^ (U80±0.卿U.244±H.0?I.""
提取物中KO-d.l!9±?.(l!2?'277±" (W...0.24?±(ι.0?5": * ?.220土ft.fWTft.16te().()4<)%".*
提取物高324.6-0.085=().()160.22 Iii UWl "'?.25%(ωΦΓ *(UM±W.W(r * IU70±(WI5X'".*
[0143]注:#P〈0.05，##P〈0.01，造模后各時間點與造模前進行自身前后比較；aP〈0.05， P〈0.0I，各組同時間點與模型組進行組間比較。
[0144]由表I可見，各手術組大鼠冠脈結扎手術后心電圖J點顯著高于手術前(p〈0.01)，說明造模成功。與模型組比較，術后15min，提取物中、提取物高組能顯著性抑制J點的抬高(p〈0.05)，術后Ih，提取物高組能顯著性抑制J點的抬高(p〈0.05)，術后4h，提取物中、提取物高組能顯著性抑制J點的抬高(P〈0.05)。其他各組間比較均無顯著性差異。
[0145]表2.對大鼠冠脈結扎所致心肌梗塞的影響n=7)
[0146]

【權利要求】
1.一種復方丹參提取物，其特征在于，所述提取物的制備方法包括以下步驟:取丹參、三七，加醇提取，得醇提液，濃縮干燥，得醇提物；然后取所述醇提物的制備中生成的藥渣，再用水提，得水提液，所得水提液通過大孔樹脂精制，所得洗脫液濃縮，加堿水解，濃縮成稠膏或干燥，得水提物；合并所述醇提物和所述水提物即得。
2.如權利要求1所述的提取物，其特征在于，所述醇提物的制備方法為:取丹參、三七藥材，加2-8倍量乙醇回流提取1-3次，每次0.5-3小時，合并提取液，減壓濃縮、干燥，即得。
3.如權利要求1所述的提取物，其特征在于，所述水提取液的制備方法為:取所述醇提物的制備中生成的藥渣，加2-12倍量水回流提取1-3次，每次1-3小時，過濾，合并所得濾液，即得所述水提取液。
4.如權利要求1所述的提取物，其特征在于，所述洗脫液的制備方法為:取所述提取液，上大孔樹脂柱，依次用水、70%-100%乙醇洗脫，所得乙醇洗脫液即為所述洗脫液。
5.如權利要求4所述的提取物，其特征在于，所述大孔樹脂柱使用前通過以下方法預處理:取大孔樹脂，以70%-100%乙醇濕法裝柱，然后用70%-100%乙醇洗至濾液與水混合不呈白色渾濁，最后用蒸餾水洗至無醇味。
6.如權利要求5所述的提取物，其特征在于，所述大孔樹脂與所述丹參三七的重量比為 0.5-2。
7.如權利要求1所述的提取物，其特征在于，所述水解方法為:取所述洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后加入堿液，加熱回流，即得。
8.如權利要求7所述的提取物，其特征在于，所述堿液選自碳酸氫鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉，氫氧化鉀的溶液，PH值為7-10。
9.如權利要求7所述的提取物，其特征在于，所述水解時間為0.5-8小時。
10.如權利要求1-9任一項所述的提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:取丹參、三七，加醇提取，得醇提液，濃縮干燥，得醇提物；然后取所述醇提物的制備中生成的藥渣，再用水提，得水提液，所得水提取液通過大孔樹脂精制，所得洗脫液濃縮，加堿水解，濃縮成稠膏或干燥，得水提物；合并所述醇提物和所述水提物即得。
11.一種復方丹參制劑，其特征在于，以權利要求1-9任一項所述的復方丹參取物，作為藥物活性物質，需要時加入藥物可接受的載體，按照制劑學的常規(guī)技術成的制劑。
12.如權利要求1-9任一項所述的提取物在制備治療心血管疾病的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/10GK104161798SQ201310183285
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優(yōu)先權日:2013年5月17日
【發(fā)明者】徐波, 牛濤, 陳紅, 劉巖 申請人:天津天士力現代中藥資源有限公司