專利名稱：一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗及制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于養(yǎng)殖海水魚類的疫苗及使用的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗及制備和使用方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)海水養(yǎng)殖魚類的疾病呈逐年增加趨勢(shì)，尤其是副溶血性弧菌、溶藻弧菌和遲緩愛德華氏菌的流行，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前魚類細(xì)菌性疾病主要是通過采用抗菌藥物結(jié)合優(yōu)化養(yǎng)殖技術(shù)的方法進(jìn)行疾病的預(yù)防和治療。然而，長(zhǎng)期使用抗生素及化學(xué)藥品，使大部分細(xì)菌產(chǎn)生了較強(qiáng)且廣泛的耐藥性，并且還造成環(huán)境污染以及藥物殘留超標(biāo)等食品安全問題。由于藥殘問題，多次造成我國(guó)的水產(chǎn)品出口受限。為了達(dá)到環(huán)境安全、食品安全及無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖的目的，國(guó)家已經(jīng)命令禁止生產(chǎn)和使用危害嚴(yán)重的藥物，盡量少用或不用藥物。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來諸多學(xué)者研究表明疫苗免疫接種是防治魚類細(xì)菌性疾病的有效方法，為魚類細(xì)菌病的防治尋找到了另一有效安全的防治途徑，是我國(guó)科學(xué)研究重點(diǎn)支持的領(lǐng)域之一。隨著高密度、設(shè)施集約化養(yǎng)殖模式的普及，魚類細(xì)菌性疾病呈現(xiàn)出多重感染、混合感染、交叉感染的新趨勢(shì)，同時(shí)感染多種細(xì)菌的情況非常普遍，因此一些學(xué)者開展了二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗和多聯(lián)疫苗研究。如近些年已經(jīng)開展了鰻弧菌和溶藻弧菌二聯(lián)疫苗對(duì)大菱鲆的免疫效果研究、開展了嗜水氣單胞菌和河弧菌二聯(lián)疫苗對(duì)鯽的免疫效果研究、開展了溶藻弧菌、副溶血弧菌和 嗜水氣單胞菌三聯(lián)疫苗對(duì)大黃魚常見細(xì)菌性疾病免疫保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究、開展了三聯(lián)疫苗預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病研究。以上研究全部采用注射和浸泡免疫方法，由于浸泡具有免疫效果差、疫苗用量大等缺點(diǎn)，注射接種疫苗操作過程繁瑣、工作量大、傷口容易感染等，均不適宜在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用?？诜臃N具有免疫效果好、操作方便、刺激較小以及工作強(qiáng)度小等特點(diǎn)，適宜在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。另外，近年來也有科研人員采用2%海藻酸鈉、6%PVP_K30制備了銀鯽口服嗜水氣單胞菌微膠囊疫苗，相對(duì)免疫保護(hù)率為61.1%，高于全細(xì)胞疫苗組的50% ;用聚乳酸一乙醇酸共聚物PLG和聚乙烯醇采用復(fù)乳揮發(fā)法制備嗜水氣單胞菌口服疫苗，產(chǎn)品相對(duì)免疫保護(hù)率為42.9%，高于全細(xì)胞疫苗組的32.1%。以上研究均是希望遞送疫苗到后腸，刺激腸道粘膜免疫相關(guān)淋巴組織發(fā)揮免疫作用。但是，以上技術(shù)沒有對(duì)相關(guān)魚類的胃腸道消化生理特性研究，也沒有對(duì)其進(jìn)行耐酸性研究，因此疫苗有效成分不能實(shí)現(xiàn)腸道釋放的目的，如養(yǎng)殖海水魚類，如大菱鲆、牙鲆等，胃液pH—般在2.5 5.5，胃排空時(shí)間一般為4 8小時(shí)，腸液PH —般在6.0 7.8，由于魚用疫苗易受溫度、酸堿度、胃蛋白酶影響，直接口服接種會(huì)損壞疫苗，降低疫苗免疫效果，如果疫苗過早釋放，將被胃酸、消化酶分解，不能起到免疫保護(hù)作用，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗及制備和使用方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗，該三聯(lián)口服疫苗由藥用淀粉、麥芽糊精、濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液、濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液及濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液混合配制而成，所述藥用淀粉:麥芽糊精:濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液的比例為=3:1:0.35:0.35:0.35，單位為:克:克:mL:mL:mL0而且，所述副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液及遲緩愛德華氏菌菌液經(jīng)過了 0.5%的甲醛滅活。一種用于養(yǎng) 殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，其特征在于:該制備過程的方法如下:⑴滅活:使用0.5%的甲醛對(duì)副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液和遲緩愛德華氏菌菌液進(jìn)行滅活；(2)微丸制備:①按藥用淀粉:麥芽糊精:濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液的比例為:3:1:0.35:0.35:0.35，單位為:克:克:mL:mL:mL的配比將上述物質(zhì)混合均勻成微濕的軟材；②制微丸:對(duì)上述軟材使用微丸機(jī)制微丸，微丸機(jī)采用400轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，制備成10 20目的微丸；⑶腸溶層包衣制備:①將主要成分為腸溶型丙烯酸樹脂包衣材料溶于90%的乙醇中，制備成10% 15%的懸濁液；②使用包衣機(jī)將上述懸濁液均勻噴涂于疫苗微丸的表面；⑷誘食劑的噴涂:①將二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10% 30%的水溶液；②使用包衣機(jī)將上述水溶液均勻噴涂于上述制備的腸溶層包衣表面。而且，所述步驟⑵所述制備成的微丸的有效疫苗含量為109cfu/g量級(jí)水平。而且，所述步驟⑶的①的步驟中腸溶型丙烯酸樹脂的具體標(biāo)號(hào)為E0BS60，pH6.0。而且，所述步驟⑷的①的步驟中誘食劑二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)，以甜菜堿代替作為誘食劑。一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的使用方法，其特征在于:該方法的步驟如下:⑴第一次投喂:在每天正常餌料投喂間隔，將三聯(lián)口服疫苗微丸投喂魚，投喂量為正常餌料量的50%，每天2次；⑵加強(qiáng)投喂；在第一次投喂三聯(lián)口服疫苗微丸后的第25 - 35天開始與第一次投喂方法相同的加強(qiáng)投喂。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是:1、本發(fā)明與現(xiàn)有疫苗制備方法相比，本發(fā)明首次制備了副溶血性弧菌、溶藻弧菌和遲緩愛德華氏菌三聯(lián)口服疫苗，并采用投喂接種的方法，免疫效果理想，工作量小，適合大規(guī)模接種。2、本發(fā)明采用功能性包衣材料，既保護(hù)疫苗在胃液中不被消化，又使疫苗在腸道中迅速釋放，與后腸黏膜充分接觸，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，獲得高效免疫效果，解決了直接口服給藥免疫效果差的問題。3、本發(fā)明充分考慮工廠化海水魚的生活環(huán)境、身體機(jī)能、捕食習(xí)慣等特點(diǎn)，在配方比例上反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，科學(xué)取值，針對(duì)性很強(qiáng)，使用方便，效果非常顯著，有很高的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗，該三聯(lián)口服疫苗由藥用淀粉、麥芽糊精、濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液、濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液及濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液混合配制而成，所述藥用淀粉:麥芽糊精:濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液的比例為=3:1:0.35:0.35:0.35，單位為:克:克:mL:mL:mL0在本發(fā)明的具體實(shí)施中，所述副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液及遲緩愛德華氏菌菌液在使用前要經(jīng)過0.5%的甲醛滅活。一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，該制備過程的方法如下:⑴滅活:使用0.5%的甲醛對(duì)副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液和遲緩愛德華氏菌菌液進(jìn)行滅活； ⑵微丸制備:①按藥用淀粉:麥芽糊精:濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液的比例為:3:1:0.35:0.35:0.35，單位為:克:克:mL:mL:mL的配比將上述物質(zhì)混合均勻成微濕的軟材；②制微丸:對(duì)上述軟材使用微丸機(jī)制微丸，微丸機(jī)采用400轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，制備成10 20目的微丸，所述制備成的微丸的有效疫苗含量為109cfu/g量級(jí)水平；⑶腸溶層包衣制備:①將主要成分為腸溶型丙烯酸樹脂包衣材料溶于90%的乙醇中，制備成10% 15%的懸濁液；在本發(fā)明的具體實(shí)施中，腸溶型丙烯酸樹脂的具體型號(hào)為E0BS60，pH6.0 ；②使用包衣機(jī)將上述懸濁液均勻噴涂于疫苗微丸的表面；⑷誘食劑的噴涂:①將二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10% 30%的水溶液；在本發(fā)明的具體實(shí)施中，所述誘食劑二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)，可以根據(jù)不同的魚種噴涂不同種類，不同濃度的誘食劑，如采用甜菜堿作為誘食劑，其水溶液濃度為20% ；②使用包衣機(jī)將上述水溶液均勻噴涂于上述制備的腸溶層包衣表面。一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的使用方法，該方法的步驟如下:
⑴第一次投喂:在每天正常餌料投喂間隔，將三聯(lián)口服疫苗微丸投喂魚，投喂量為正常餌料量的50%，每天2次；⑵加強(qiáng)投喂；在第一次投喂疫苗微丸后的第25 - 35天開始與第一次投喂方法相同的加強(qiáng)投喂。三聯(lián)口服疫苗及其制備實(shí)例I一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，該三聯(lián)口服疫苗制劑的配方如下:150g藥用淀粉、50g麥芽糊精、55mL經(jīng)過0.5%的甲醛滅活的副溶血性弧菌、溶藻弧菌和遲緩愛德華氏菌菌液(濃度為IXlO12Cfu,比例為1:1:1)，通過微丸機(jī)制備出10 20目的微丸，自然晾干或低溫烘干，疫苗有效含量為109cfu/g。將腸溶型包衣材料(主要成分為丙烯酸樹脂)溶于90%的乙醇中，制備成10%的懸濁液，使用包衣機(jī)均勻噴涂于疫苗微丸的表面，最后將二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10%的溶液，使用包衣機(jī)均勻噴涂于腸溶層表面。三聯(lián)口服疫苗及其制備實(shí)例2
一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，該三聯(lián)口服疫苗制劑的配方如下:150g藥用淀粉、50g麥芽糊精、55mL經(jīng)過0.5%的甲醛滅活的副溶血性弧菌、溶藻弧菌和遲緩愛德華氏菌菌液(濃度為IXlO12Cfu,比例為1:1:1)，通過微丸機(jī)制備出10 20目的微丸，自然晾干或低溫烘干，疫苗有效含量為109cfu/g。將腸溶型包衣材料(主要成分為丙烯酸樹脂)溶于90%的乙醇中，制備成15%的懸濁液，使用包衣機(jī)均勻噴涂于疫苗微丸的表面，最后將二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成30%的溶液，使用包衣機(jī)均勻噴涂于腸溶層表面。 三聯(lián)口服疫苗的使用方法實(shí)例將上述制備的疫苗微丸投喂半滑舌鰨，投喂量為正常餌料投喂量的50%，其余50%投喂正常餌料，每天2次，連續(xù)投喂2天，間隔30天加強(qiáng)投喂2天。應(yīng)用效果對(duì)比:水族箱小水體免疫大菱鲆實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)兩個(gè)組，對(duì)照組和口服免疫組。口服免疫組每天投喂制備的口服疫苗2次，連續(xù)投喂2天，然后投喂正常餌料；對(duì)照組投喂正常顆粒餌料。間隔7天采血一次，每組采4尾魚，測(cè)定血清和后腸黏膜中的抗體平均水平。28天后，分別對(duì)試驗(yàn)魚和對(duì)照魚進(jìn)行溶藻弧菌、副溶血性弧菌和遲緩愛德華氏菌(比例為1:1:1，菌液濃度為I X 109cfu/mL)進(jìn)行人工感染，7天后統(tǒng)計(jì)兩組魚的死亡率，并計(jì)算免疫保護(hù)率。結(jié)果見表I和表2。表I 口服免疫后大菱鲆血清中抗體效價(jià)均值
權(quán)利要求
1.一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗，其特征在于:該三聯(lián)口服疫苗由藥用淀粉、麥芽糊精、濃度為I X IO12Cfu的副溶血性弧菌菌液、濃度為I X IO12Cfu的溶藻弧菌菌液及濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液混合配制而成，所述藥用淀粉:麥芽糊精:濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液的比例為=3:1:0.35:0.35:0.35，單位為:克:克:mL:mL:mL0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗，其特征在于:所述副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液及遲緩愛德華氏菌菌液經(jīng)過了 0.5%的甲醛滅活。
3.一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，其特征在于:該制備過程的方法如下: ⑴滅活:使用0.5%的甲醛對(duì)副溶血性弧菌菌液、溶藻弧菌菌液和遲緩愛德華氏菌菌液進(jìn)行滅活； ⑵微丸制備: ①按藥用淀粉:麥芽糊精:濃度為IXlO12Cfu的副溶血性弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的溶藻弧菌菌液:濃度為IXlO12Cfu的遲緩愛德華氏菌菌液的比例為:3:1:0.35:0.35:0.35，單位為:克:克:mL:mL:mL的配比將上述物質(zhì)混合均勻成微濕的軟材； ②制微丸:對(duì)上述軟材使用微丸機(jī)制微丸，微丸機(jī)采用400轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，制備成10 20目的微丸； ⑶腸溶層包衣制備: ①將主要成分為腸溶型 丙烯酸樹脂包衣材料溶于90%的乙醇中，制備成10% 15%的懸濁液； ②使用包衣機(jī)將上述懸濁液均勻噴涂于疫苗微丸的表面； ⑷誘食劑的噴涂: ①將二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10% 30%的水溶液； ②使用包衣機(jī)將上述水溶液均勻噴涂于上述制備的腸溶層包衣表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，其特征在于:所述步驟⑵所述制備成的微丸的有效疫苗含量為109cfu/g量級(jí)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，其特征在于:所述步驟⑶的①的步驟中腸溶型丙烯酸樹脂的具體標(biāo)號(hào)為E0BS60，pH6.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，其特征在于:所述步驟⑷的①的步驟中誘食劑二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)，以甜菜堿代替作為誘食劑。
7.一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的使用方法，其特征在于:該方法的步驟如下: ⑴第一次投喂:在每天正常餌料投喂間隔，將三聯(lián)口服疫苗微丸投喂魚，投喂量為正常餌料量的50%，每天2次； ⑵加強(qiáng)投喂；在第一次投喂三聯(lián)口服疫苗微丸后的第25 - 35天開始與第一次投喂方法相同的加強(qiáng)投喂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗，該三聯(lián)口服疫苗由藥用淀粉、麥芽糊精、濃度為1×1012cfu的副溶血性弧菌菌液、濃度為1×1012cfu的溶藻弧菌菌液及濃度為1×1012cfu的遲緩愛德華氏菌菌液按比例3:1:0.35:0.35:0.35，單位為克:克:ml:ml:ml混合配制而成；本發(fā)明所涉及用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的制備，其方法步驟包括⑴滅活；⑵微丸制備；⑶腸溶層包衣制備及⑷誘食劑的噴涂；本發(fā)明所涉及用于養(yǎng)殖海水魚類三聯(lián)口服疫苗的使用方法，其方法步驟包括⑴第一次投喂和⑵加強(qiáng)投喂。本發(fā)明制備了副溶血性弧菌、溶藻弧菌和遲緩愛德華氏菌三聯(lián)口服疫苗，并采用投喂接種的方法，免疫效果理想，工作量小，適合大規(guī)模接種，同時(shí)，本發(fā)明采用功能性包衣材料，既保護(hù)疫苗在胃液中不被消化，又使疫苗在腸道中迅速釋放，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，獲得高效免疫效果。
文檔編號(hào)A61K9/16GK103191422SQ20131013944
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者孫志景, 張振國(guó), 姜巨峰, 吳會(huì)民, 馮守明, 夏蘇東, 劉肖蓮 申請(qǐng)人:天津市水產(chǎn)研究所