專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法。
背景技術(shù)：
黃酮是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)母核是以C6-C3-C6為骨架的
2-苯基色原酮。它的存在形式有兩種，一種是游離的苷元，另一種是與糖等結(jié)合的苷。黃酮類(lèi)化合物在植物界分布很廣泛，如銀杏葉、山碴、沙棘、薔薇果、拘祀、杜仲、茶葉、葛根等。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)有500多種植物中有黃酮類(lèi)和異黃酮類(lèi)物質(zhì)，它們包括黃烷酮、異黃烷酮、黃酮醇、黃烷酮醇、雙黃酮及其衍生物。黃酮類(lèi)物質(zhì)主要作用有:抗腫瘤，延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能、治療慢性前列腺炎、增強(qiáng)免疫力、調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)、護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病毒等。葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，甘葛藤又習(xí)稱(chēng)為粉葛，葛根是最常用的稱(chēng)呼。從成分分析結(jié)果看，葛根的葛根素及總黃酮含量顯著高于本屬其它植物，活性物質(zhì)主要為大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等，是提取黃酮的較優(yōu)選擇。目前提取黃酮的方法有很多，如熱水提取法、堿液提取法、丙酮提取法、乙醇浸提法、微波萃取法、超聲波法等，但是這些方法的共性是將含黃酮植物粉碎處理后直接進(jìn)行提取，黃酮收率因工藝和原材料的差別而不穩(wěn)定，而且提取不夠完全，容易造成黃酮成分的損失，整體收率都不高。如文獻(xiàn)《葛根總黃酮的提取研究》(李增富，吳榮峰，應(yīng)用化工第37卷第11期)，其收率為 167.974mg/100g 葛根粉，即 0.17%。利用植物細(xì)胞、組織或器官培養(yǎng)來(lái)獲得對(duì)人類(lèi)有用的次生代謝物已經(jīng)成為當(dāng)今植物生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，其最大優(yōu)點(diǎn)就是生產(chǎn)完全在人工控制條件下進(jìn)行，可以通過(guò)改變培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系得到超整株植物收率的代謝產(chǎn)物。然而影響植物細(xì)胞培養(yǎng)的因素很多，如培養(yǎng)基成分，植物本身的特性，培養(yǎng)條件，環(huán)境條件，生物因素，內(nèi)部因素等，尤其是培養(yǎng)基成分則是關(guān)鍵之關(guān)鍵，其不僅影響機(jī)體的生長(zhǎng)還影響機(jī)體的次生代謝產(chǎn)物合成。因此，提供一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法對(duì)于開(kāi)拓黃酮制備新途徑具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法，使得該方法能夠提高從葛根中獲取黃酮的收率。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:—種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法，將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上在23-27°C溫度、800-12001x光照強(qiáng)度下，以每天8_12小時(shí)光照時(shí)間培養(yǎng)15-20天，然后分離
獲得黃酮；所述培養(yǎng)基由NH4NO3、KNO3、MgSO4 *7H20,CaCl2.2Η20,KH2PO4,FeSO4.7Η20、EDTA-Na2、K1、CoCl2.6Η20、H3BO3> Na2MoO2.2Η20、MnSO4.H2O, CuSO4.5Η20、ZnSO4.7Η20、6_ (芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂組成，pH值為5.8。其中，所述葛根愈傷組織細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的植物組織培養(yǎng)和愈傷組織培養(yǎng)操作制備獲得，即通過(guò)將葛根外植體進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)后獲得，所述葛根外植體取自根部。本發(fā)明所述葛根愈傷組織細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有提取黃酮收率不高的缺陷，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)手段，優(yōu)化培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系對(duì)葛根細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，促使其分泌次生代謝物黃酮，收率得到提升。作為優(yōu)選，所 述培養(yǎng)基由以下方法制備獲得:以質(zhì)量百分濃度計(jì)，配制由8.25% 的 NH4NO3>9.50% 的 KNO3> 1.85% 的 MgSO4.7H20和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3%，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75%，然后調(diào)pH值為5.8高壓滅菌后即得培養(yǎng)基。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所述培養(yǎng)基并不局限于配制成IOOOmL,本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)參考本發(fā)明所述培養(yǎng)基配制比例，能夠輕易的擴(kuò)大或縮小所述培養(yǎng)基的規(guī)格，這也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。在本發(fā)明培養(yǎng)葛根細(xì)胞的過(guò)程中，作為優(yōu)選，所述光照強(qiáng)度為10001X，所述光照時(shí)間為10小時(shí)，所述溫度為25°C，所述培養(yǎng)時(shí)間為16-19天。在本發(fā)明所述方法的最后，從培養(yǎng)基中提取分離黃酮屬于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，如采用乙醇進(jìn)行浸提提取分離。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述分離提取獲得黃酮具體為:步驟1、收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:50-75%乙醇為lg:15-35mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩20_60min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行步驟2 ；步驟2、以濾渣:50-75%乙醇為lg: 15_35mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩20-60min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾洛，濾液備用，濾洛重復(fù)本步驟1_3次；步驟3、合并步驟I和步驟2所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮。其中，作為優(yōu)選，步驟I和步驟2所述質(zhì)量體積比為lg:20mL，步驟I和步驟2所述乙醇體積百分?jǐn)?shù)為60%，步驟I和步驟2所述振蕩時(shí)間為40min。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的記載(見(jiàn)背景技術(shù))，現(xiàn)有提取葛根總黃酮的收率為0.17%，而經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述方法獲得的黃酮，其收率將近0.5%，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)明顯得到提高。同時(shí)，本發(fā)明還調(diào)整培養(yǎng)基部分組分以及用量，結(jié)果顯示，調(diào)整后的培養(yǎng)方法獲得的黃酮收率為0.36%，表明隨意調(diào)整培養(yǎng)基成分易使得黃酮收率降低。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系，以培養(yǎng)葛根細(xì)胞的生物技術(shù)手段來(lái)制備黃酮，收率明顯高于現(xiàn)有乙醇浸提法、水提取法等常規(guī)方法的黃酮收率，開(kāi)拓了制備黃酮的新途徑。


圖1所示為不同培養(yǎng)基黃酮收率對(duì)比試驗(yàn)折線圖；其中，折線A代表本發(fā)明培養(yǎng)基的黃酮收率，折線B代表對(duì)照培養(yǎng)基的黃酮收率，橫坐標(biāo)表示時(shí)間(天)，縱坐標(biāo)表示黃酮收率(％)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。按照本發(fā)明所述方法，將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上在23_27°C溫度、800-12001x光照強(qiáng)度下，以每天8-12小時(shí)光照時(shí)間培養(yǎng)15-20天，然后分離獲得黃酮；所述培養(yǎng)基由NH4NO3、KNO3、MgSO4 *7H20,CaCl2.2Η20,KH2PO4,FeSO4.7Η20、EDTA-Na2、K1、CoCl2.6Η20、Η3Β03、Na2MoO2.2Η20、MnSO4.H2O, CuSO4.5Η20、ZnSO4.7Η20、6_ (芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂組成，pH值為5.8。其中，葛根愈傷組織細(xì)胞可采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行制備，如切取葛根根部外植體接種到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，然后將切口處的愈傷組織接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)獲得愈傷組織細(xì)胞，所述誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基一般由MS培養(yǎng)基、6-BA、NAA組成，屬本領(lǐng)域公知。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1:通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮1、配制培養(yǎng)基(質(zhì)量百分濃度)配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；
分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養(yǎng)基)，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養(yǎng)基)，然后調(diào)PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。2、制備方法葛根愈傷組織 細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在25°C溫度、lOOOlx光照強(qiáng)度下，以每天10小時(shí)光照時(shí)間(上午8時(shí)至下午6時(shí))培養(yǎng)16天；收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:60%乙醇為lg:20mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩40min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行如下步驟；以濾渣:60%乙醇為lg:20mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩40min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復(fù)加乙醇振蕩2次；合并前述個(gè)步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.43%。實(shí)施例2:通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮1、配制培養(yǎng)基(質(zhì)量百分濃度)配制由 8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養(yǎng)基)，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養(yǎng)基)，然后調(diào)PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。2、制備方法葛根愈傷組織細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在26°C溫度、IIOOIx光照強(qiáng)度下，以每天11小時(shí)光照時(shí)間(上午8時(shí)至下午7時(shí))培養(yǎng)17天；
收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:65%乙醇為lg:25mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩60min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行如下步驟；以濾渣:65%乙醇為lg:25mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩60min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復(fù)加乙醇振蕩3次；合并前述個(gè)步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.47%。實(shí)施例3:通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮1、配制培養(yǎng)基(質(zhì)量百分濃度)
配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4- 二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養(yǎng)基)，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養(yǎng)基)，然后調(diào)PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。2、制備方法葛根愈傷組織細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在27°C溫度、12001x光照強(qiáng)度下，以每天12小時(shí)光照時(shí)間(上午8時(shí)至下午8時(shí))培養(yǎng)18天；收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:70%乙醇為lg:30mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩50min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行如下步驟；以濾渣:70%乙醇為lg:30mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩50min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復(fù)加乙醇振蕩I次；合并前述個(gè)步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.47%。實(shí)施例4:通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮1、配制培養(yǎng)基(質(zhì)量百分濃度)配制由 8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養(yǎng)基)，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養(yǎng)基)，然后調(diào)PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。2、制備方法葛根愈傷組織細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在26°C溫度、IOOOIx光照強(qiáng)度下，以每天10小時(shí)光照時(shí)間(上午8時(shí)至下午6時(shí))培養(yǎng)19天；收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:75%乙醇為lg:35mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩40min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行如下步驟；以濾渣:75%乙醇為lg:35mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩40min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復(fù)加乙醇振蕩2次；合并前述個(gè)步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.48%。實(shí)施例5:通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮1、配制培養(yǎng)基(質(zhì)量百分濃度)配制由8.25% 的 ΝΗ4Ν03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7Η20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2Η20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7Η20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養(yǎng)基)，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養(yǎng)基)，然后調(diào)PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。2、制備方法葛根愈傷組織細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。將葛根愈傷組織 細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在23°C溫度、8001x光照強(qiáng)度下，以每天8小時(shí)光照時(shí)間(上午8時(shí)至下午4時(shí))培養(yǎng)20天；收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:50%乙醇為lg:15mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩20min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行如下步驟；以濾渣:50%乙醇為lg:15mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩20min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復(fù)加乙醇振蕩3次；合并前述個(gè)步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.46%。實(shí)施例6:通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮1、配制培養(yǎng)基(質(zhì)量百分濃度)配制由8.25% 的 NH4N03、9.50% 的 ΚΝ03、1.85% 的 MgSO4.7H20 和余量水組成的第一溶液；配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液；配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液；配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液；配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液；分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌呤(即6BA)、2，4 一二氯苯氧乙酸(即2，4 一 D)、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 — 二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3% (即30g/1000mL培養(yǎng)基)，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75% (即7.5g/1000mL培養(yǎng)基)，然后調(diào)PH值為5.8，分裝到三角燒瓶中，121 °C、0.1Mpa到0.15Mpa下滅菌15min，冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。2、制備方法葛根愈傷組織細(xì)胞由浙江工商大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在24°C溫度、9001x光照強(qiáng)度下，以每天9小時(shí)光照時(shí)間(上午8時(shí)至下午5時(shí))培養(yǎng)15天；收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:55%乙醇為lg:20mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩30min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行如下步驟；以濾渣:55%乙醇為lg:20mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩30min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，此步獲得的濾渣按照此步處理方式重復(fù)加乙醇振蕩2次；合并前述個(gè)步驟中所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮，收率為0.40%。實(shí)施例7:對(duì)比試驗(yàn)調(diào)整本發(fā)明所述培養(yǎng)基成分中的蔗糖更換為常規(guī)碳源-葡萄糖，同時(shí)調(diào)整MnSO4 -H2O質(zhì)量百分濃度為0.1115%、鹽酸硫氨素質(zhì)量百分濃度為0.0025%,并且去掉6_(芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸，一次配方作為對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行黃酮的制備，制備方法參照實(shí)施例1，結(jié)果見(jiàn)表I和圖1。表I不同培養(yǎng)基黃酮收率對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法，其特征在于，將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在滅菌后的培養(yǎng)基上，并在23-27°C溫度、800-12001X光照強(qiáng)度下，以每天8-12小時(shí)光照時(shí)間培養(yǎng)15-20天，然后分離提取獲得黃酮；所述培養(yǎng)基由 NH4N03、KNO3> MgSO4.7H20、CaCl2.2H20、KH2PO4, FeSO4.7H20、EDTA-Na2,K1、CoCl2.6H20、H3BO3' Na2MoO2.2H20、MnSO4.H2O, CuSO4.5H20、ZnSO4.7H20、6_ (芐胺基)嘌呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖、瓊脂組成，pH值為5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基由以下方法制備獲得: 以質(zhì)量百分濃度計(jì)，配制由8.25%的NH4NO3^9.50%的ΚΝ03、1.85%的MgSO4.7H20和余量水組成的第一溶液； 配制由2.51%的CaCl2.2H20和余量水組成的第二溶液； 配制由0.85%的KH2PO4和余量水組成的第三溶液； 配制由0.139%的FeSO4.7H20、0.187%的EDTA-Na2和余量水組成的第四溶液；配制由 0.00415% 的 KI,0.00012% 的 CoCl2.6Η20、0.031% 的 Η3Β03、0.00125% 的Na2MoO2.2Η20、0.0845% 的 MnSO4.Η20、0.00012% 的 CuSO4.5Η20、0.043% 的 ZnSO4.7Η20 和余量水組成的第五溶液； 配制由0.5%的肌醇、0.0025%的煙酸、0.0025%的鹽酸吡哆醇、0.0005%的鹽酸硫氨素、0.01%的甘氨酸和余量水組成的第六溶液； 分別取第一溶液、第二溶液、第三溶液、第四溶液、第五溶液和第六溶液各20mL，然后加入6-(芐胺基)嘌 呤、2，4 一二氯苯氧乙酸、蔗糖以及瓊脂定容至IOOOmL,其中6-(芐胺基)嘌呤濃度為10_6M，2，4 一二氯苯氧乙酸濃度為1.5X10_5M，蔗糖質(zhì)量百分濃度為3%，瓊脂質(zhì)量百分濃度為0.75%，然后調(diào)pH值為5.8高壓滅菌后即得培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述葛根愈傷組織細(xì)胞通過(guò)將葛根外植體進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)后獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述光照時(shí)間為10小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述溫度為25°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)時(shí)間為16-19天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述分離提取獲得黃酮具體為: 步驟1、收集培養(yǎng)基中的愈傷組織細(xì)胞烘干、粉碎，然后以愈傷組織細(xì)胞:50-75%乙醇為lg:15-35mL的質(zhì)量體積比，向愈傷組織細(xì)胞中加入乙醇并振蕩20_60min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾渣，濾液備用，濾渣進(jìn)行步驟2 ； 步驟2、以濾渣:50-75%乙醇為lg: 15-35mL的質(zhì)量體積比，向?yàn)V渣中加入乙醇并振蕩20-60min，然后過(guò)濾，獲得濾液和濾洛，濾液備用，濾洛重復(fù)本步驟1_3次； 步驟3、合并步驟I和步驟2所獲得的所有濾液、濃縮并烘干，即得黃酮。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，步驟I和步驟2所述質(zhì)量體積比為lg:20mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，步驟I和步驟2所述乙醇體積百分?jǐn)?shù)為 60%。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種通過(guò)培養(yǎng)葛根細(xì)胞制備黃酮的方法。該方法將葛根愈傷組織細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上在23-27℃溫度、800-1200lx光照強(qiáng)度下，以每天8-12小時(shí)光照時(shí)間培養(yǎng)15-20天，然后分離獲得黃酮。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系，以培養(yǎng)葛根細(xì)胞的生物技術(shù)手段來(lái)制備黃酮，收率明顯高于現(xiàn)有乙醇浸提法、水提取法等常規(guī)方法的黃酮收率，開(kāi)拓了制備黃酮的新途徑。
文檔編號(hào)A61P39/06GK103146637SQ201310045809
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者周天瓊, 周正兵, 高留根 申請(qǐng)人:杭州華締投資管理有限公司